Name: imaging dpp release from a drosophila wing disc
Uploaded: 2019-10-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Саралу Прадхан за работу над более ранней версией этого протокола. Мы хотели бы поблагодарить NSF-IOS 1354282 за финансирование в то время как мы разработали этот протокол. Мы хотели бы поблагодарить NIH-NIDCR RO1DE025311 за финансирование нашей лаборатории в настоящее время.

1. Сбор яиц для создания лари для вскрытия
<ol><li>Крест 30-40 девственной самки Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu летает до 10-15 самцов Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu. ПРИМЕЧАНИЕ: Любые два генотипа, содержащие Dpp-GAL4 и UAS-Dpp-GFP, могут использоваться до тех пор, пока балансеры имеют личинок маркеров, позволяющих подбирать ...

<ol>
	<li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decapentaplegic+acts+as+a+morphogen+to+organize+dorsal-ventral+pattern+in+the+Drosophila+embryo.">Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo.</a> Cell. 71 (3), 451-461 (1992).</li><li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+enhancement+and+repression+of+the+activity+of+the+TGF-beta+family+member,+decapentaplegic,+is+necessary+for+dorsal-ventral+pattern+formation+in+the+Drosophila+embryo.">Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo.</a> Development. 114 (3), 583-597 (1992).</li><li>Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activity+gradient+of+decapentaplegic+is+necessary+for+the+specification+of+dorsal+pattern+elements+in+the+Drosophila+embryo.">An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.</a> Development. 117 (2), 807-822 (1993).</li><li>Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+to+identify+elements+of+the+decapentaplegic+signaling+pathway+in+Drosophila.">Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).</li><li>Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+decapentaplegic+and+engrailed+expression+in+Drosophila+imaginal+disks:+do+these+genes+mark+the+anterior-posterior+compartment+boundary.">The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary.</a> Development. 113 (1), 27-33 (1991).</li><li>Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-beta+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila.</a> Development. 111 (3), 657-666 (1991).</li><li>de Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+decapentaplegic+and+thick+veins+during+the+differentiation+of+the+veins+in+the+Drosophila+wing.">Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Letsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dpp+signaling+is+mediated+by+the+punt+gene+product:+a+dual+ligand-binding+type+II+receptor+of+the+TGF+beta+receptor+family.">Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family.</a> Cell. 80 (6), 899-908 (1995).</li><li>Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+serine/threonine+kinases+implicated+in+the+control+of+Drosophila+body+pattern+by+decapentaplegic.">Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic.</a> Cell. 78 (2), 225-237 (1994).</li><li>Raftery, L. A., Sutherland, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+family+signal+transduction+in+Drosophila+development:+from+Mad+to+Smads.">TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads.</a> Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+regulate+Dpp+release+in+the+Drosophila+wing+disc.">Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Dahal, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inwardly+rectifying+K++channel+is+required+for+patterning.">An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning.</a> Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).</li><li>George, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channel+Contributions+to+Wing+Development+in+Drosophila+melanogaster.">Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster.</a> G3. 9 (4), 999-1008 (2019).</li><li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses.">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li><li>Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dpp+gradient+formation+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Cell. 103 (6), 971-980 (2000).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+influence+Drosophila+wing+morphogenesis+by+regulating+Dpp+release.">Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Hazegh, K. E., Reis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Buoyancy-based+Method+of+Determining+Fat+Levels+in+Drosophila.">A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+Drosophila+wing+imaginal+disc+cytonemes+on+Decapentaplegic.">Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic.</a> Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332 (6027), 354-358 (2011).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes+as+specialized+signaling+filopodia.">Cytonemes as specialized signaling filopodia.</a> Development. 141 (4), 729-736 (2014).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+by+touch--neurons+are+not+alone.">Communicating by touch--neurons are not alone.</a> Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).</li></ol>

BMPs, такие как Dpp сделать их значительное влияние, когда они связывают комплекс мембранных связанных рецепторов, чтобы вызвать каскад внутриклеточной сигнализации в соседних или, видимо, далеких клеток. Лаборатория доктора Томаса Корнберга показала, что клетки, которые производят конта...

Морфогенетические белки костей (БМП) необходимы для раннего эмбриогенеза и узорства взрослых структур. BMPs производятся и выделяются, чтобы повлиять на транскрипцию генов-мишеней, необходимых для роста и дифференциации клеток в ответных клетках. Decapentaplegic (Dpp) является Drosophila омолог БМП4, что важно для развития эмбриональных и взрослых структур, как крыло1,2,3,4. Несколько групп сосредоточили свое внимание на роли Dpp в узорчатом крыльях взрослых мух, потому что 1) крылья состоят из двух прозрачных листов эпителии с последовательной моделью venation, которые могут быть легко оценены; 2) диски крыла также разумно плоские, могут быть культивированы вне личинки, и просты для изображения и количественноразличия различий в шаблоне; и 3) развитие модели крыла чувствительно к Dpp так, что малые perturbations в тропе повлияют на картину venation крыла.
Dpp производится в клетках, расположенных в передней/ задней границе диска крыла5,6,7,8. Dpp связывается с комплексом типа 1 и типа 2 серина / трионин киназы рецепторов9,10. После Dpp связывания, тип 2 рецепторфориды типа 1 рецептор, который затем фосфорилаты матерей против Dpp (Mad), Smad 1/5/8 омолог. Фосфорилированный SMAD набирает дополнительный co-Smad (Медея), который позволяет ему войти в ядро, где он регулирует целевые гены, что приводит к вниз по течению эффекты, такие как распространение или дифференциация4,11.
Недавно, Бейтс Лаборатория показала, что ненадлежащее освобождение Dpp в крыло диска может привести к снижению Mad фосфорилирования, снижение экспрессии генов цели, и крыло шаблонных дефектов12,13. Несколько ионных каналов влияют на развитие крыла Дрозофилы и связанных с ним структур14,15. Эти ионные каналы также могут быть вовлечены в выпуск Dpp. При определении механизма высвобождения морфогена важно, чтобы был метод визуализации событий релиза.
Доктора Аурелио Телеман и Стивен Коэн создали белок синтеза Dpp-GFP, который способен спасти потерю Dpp, что означает, что он биологически активен и высвобождается биологически значимым образом16. Здесь мы описываем, как мы визуализировать события выпуска Dpp с помощью этого Dpp-GFP. Этот белок синтеза особенно полезен, потому что GFP является рН чувствительным таким образом, что, когда он находится в кислых пузырьков, флуоресценция закаляется17. Поэтому, когда белок, помеченный GFP, высвобождается из везикли в более нейтральную внеклеточную среду, интенсивность флуоресценции GFP увеличивается на17. Мы воспользовались чувствительностью pH GFP, чтобы определить, находится ли Dpp-GFP в кислых пузырьках. Мы изображения дисков крыла, выражающих Dpp-GFP до и после добавления хлорида аммония, который нейтрализует внутриклеточные отсеки пузырьков18. Мы обнаружили значительное увеличение флуоресценции пунктуры после добавления хлорида аммония, предполагая, что внутриклеточные Dpp-GFP затушевывается до добавления хлорида аммония18. Мы пришли к выводу, что внутриклеточные Dpp-GFP находится в кислых мембранных отсеков, таких как пузырьки, и не утоляется при добавлении хлорида аммония, чтобы нейтрализовать рН внутриклеточных отсеков18. Это делает живую визуализацию Dpp-GFP полезным методом визуализации динамики Dpp в диске крыла Drosophila, поскольку он высвобождается из кислых отсеков во внеклеточной среде.
Здесь мы описываем метод, который мы используем для визуализации событий выпуска Dpp с помощью Dpp-GFP. Dpp-GFP может быть выражен в его родной шаблон в drosophila крыла дисков с использованием системы UAS-GAL419. Это метод, который был использован, чтобы определить, что Irk каналы воздействия Dpp релиз18. Мы проверили метод с помощью живых изображений z-stacks. Мы не видим Dpp-GFP puncta движущихся в плоскости фокуса в временных рядах, если мы приобрели в одной плоскости фокуса. Мы также не видим движения Puncta Dpp-GFP, если мы изображены в z-стеке. Мы пришли к выводу, что пунктта Dpp-GFP, увиденная с помощью этого метода, является событиями высвобождения, а не движением пузырьков внутриклеточного. Этот метод живой визуализации Dpp-GFP потенциально может быть использован для тестирования других модификаторов dpp релиз для их воздействия на динамику Dpp или может быть изменен, чтобы посмотреть на динамику других лигандов

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baker&#39;s yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dyhydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>484-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Agar Type II</td>
			<td>Apex</td>
			<td>66-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500233</td>
			<td>Forceps for dissecting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Corn Syrup</td>
			<td>Karo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>Breiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S22060-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Micsroscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>U330-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy Flour</td>
			<td>ADM Specialty Ingredients</td>
			<td>062-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose dyhydrate</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Corn Meal</td>
			<td>Quaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dpp release from a drosophila wing disc

Трансформирующая сверхсемейная группа Фактор роста (TGF-я) имеет важное значение для раннего эмбрионального узорства и развития взрослых структур в многоклеточных организмах. Суперсемейка TGF-я включает в себя TGF-я, костяного морфогенетического белка (BMPs), активицинов, факторов роста и дифференциации, и нодаль. Давно известно, что количество лиганда, подвергаемого воздействию клеток, имеет важное значение для его воздействия. Считалось, что градиенты концентрации на длинных дистанциях создали эмбриональную модель. Однако в последнее время стало ясно, что сроки воздействия этих лиганд также имеет важное значение для их вниз по течению транскрипционных последствий. Суперсемейная лига н.е. TGF-я не может иметь следствие развития до тех пор, пока не высвобождается из клетки, в которой она была произведена. До недавнего времени было трудно определить, когда эти лиганды были освобождены из клеток. Здесь мы покажем, как измерить высвобождение Дрозофилы БМП под названием Decapentaplegic (Dpp) из клеток крыла примордия или диска крыла. Этот метод может быть изменен для других систем или сигнализации лигандов.

На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты работы этого протокола. Когда протокол успешен, Dpp-GFP можно рассматривать как полосу вниз по центру диска крыла с ядрами видимыми как нефлуоресцентные круги в пределах dpp-GFP области (Рисунок 2). Dpp-GFP релиз ви...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Сроки воздействия лигандов могут повлиять на их последствия для развития. Здесь мы покажем, как изображение выпуска drosophila кости морфогенетического белка (BMP) называется Dpp из клеток крыла диска.

Изображение Dpp Релиз из drosophila крыла диска

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

DPP влияет на судьбу клеток, связывая рецепторы и посылая сигнал внутриклеточно влиять на транскрипцию. Если DPP производится, но не выпущен, он не имеет доступа к рецепторам и, следовательно, не может выполнять свои роли. Этот метод позволяет визуализировать выпуск DPP, что позволяет исследователям изучить, какие генетические и экологические факторы меняют динамику выпуска DPP.Сигнальный путь БМП сохраняется от мух к человеку, поэтому мы ожидаем, что механизм, который диктует выпуск DPP, также будет актуален для развития и регенерации человека. Начните с пересечения от 30 до 40 девственных женщин DPP GAL4 летает с 10 до 15 мужчин UAS DPP-GFP мух. Поощряйте укладку яиц, добавляя небольшое количество дрожжевой пасты в свежий флакон пищи.Чтобы собрать яйца, переверните скрещенных мух во флакон и дайте им отложить в течение трех-четырех часов, прежде чем удалить их. Держите флаконы сбора яиц на 25 градусов по Цельсию в течение примерно 144 часов, пока личинки находятся на третьей стадии instar. Затем выберите соответствующие личинки для вскрытия.Во-первых, выбрать личинки, которые не являются ТБ, которые будут нормальной длины, а не короткие и толстые. Чтобы выбрать DPP-GFP, выражаюющий личинки, просмотрите их под стерео микроскопом флуоресценции. Все личинки, не противотуберкулезные, будут иметь некоторую флуоресценцию, но GFP ограничен дисками крыла и менее яркий на личинках DPP-GFP.Подготовьте модифицированные средства массовой информации HL3 в соответствии с рукописными указаниями, которые будут поддерживать живую визуализацию дисков крыла. Отрегулируйте рН до 7,1 с помощью HEPES, затем отфильтруйте его через фильтр 0,22 микрометра. Поместите два куска бесцветной двусторонний ширины ленты мудрым через слайд микроскоп оставив пространство около пяти миллиметров между ними и убедившись, что концы ленты лежат покраснел с краями слайда.Используйте плоский край, чтобы прижимать ленту твердо к слайду. Добавьте 25 микролитров модифицированных HL3-медиа между двумя частями ленты. Когда диск крыла установлен в средствах массовой информации, куски ленты будет предотвратить его от дробленая обложка.Чтобы вскрыть личинку, поместите ее в модифицированные HL3-средства и аккуратно разорвите пополам, используя две пары типсов. Отбросьте заднюю половину, а затем схватить середину передней половины с одной парой типсов и использовать другую пару, чтобы подтолкнуть рот крючки обратно в личинку, пока она полностью инвертирована. Ищите острые изгибы в двух темных цветных первичных ветвях трахеи, которые бегут по обе стороны личинки.Диски крыла лежат прямо под ним. Аккуратно удалите диски и поместите их в HL3-медиа на подготовленном слайде, убедившись, что к дискам все еще не прикреплены кусочки трахеи. Упорядочить крыла диски так, что периподиальная сторона крыла мешок сталкивается вверх с диском лежал плоский.Обложка крыло с крышкой и печать с лаком для ногтей. После того, как польский сухой, немедленно приступить к визуализации. Изображение установленного диска крыла с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с целью 40X нефти и 488 нанометрового лазера.Сбор изображений со скоростью двух герц в течение двух минут. Для получения наилучших результатов, установить мощность лазера достаточно сильны, чтобы получить четкое изображение DPP-выпускающих клеток, чтобы избежать более отбеливания. Соберите изображения в серии времени и экспортировать их в качестве файлов AVI для получения видео релиза DPP.Когда протокол успешен, DPP-GFP появляется как полоса вниз по центру диска крыла с ядрами видимыми как нефлуоресцентные круги. Выпуск DPP-GFP виден как флуоресцентная панкта, которая появляется и исчезает как внутри, так и далеко от тел клеток. Различные панкты, вероятно, в цитономах или в цитономе синапсах.Диски крыла монтируются таким образом, чтобы изображение было сделано с периподиальной стороны. Если диск крыла изображен с обратной стороны, флуоресценция DPP-GFP будет выглядеть не в фокусе, а разрешение будет плохим. Когда GFP не сливается с DPP, нет puncta за пределами клеток органов не наблюдается.Этот элемент управления показывает, что DPP-GFP ведет себя иначе, чем GFP в одиночку. Кроме того, нет флуоресцентных puncta появляются, когда DPP-GFP не выражается. Во время этой процедуры важно, чтобы диск крыла был установлен периподиальной стороной вверх.Если диск крыла неправильно ориентирован, DPP-GFP появится вне фокуса. Этот метод может быть использован для изучения выпуска других развития сигнализации лиганды, как бескрылый или еж. Мы можем исследовать все различные экологические и генетические факторы, которые могут повлиять на выпуск DPP.Кроме того, мы можем адаптировать этот метод для изучения BMP-релиза от других типов клеток.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-визуализация<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколки глаз

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Вертикальный Визуализация<em&gt; Drosophila</em&gt; Яйцо палат

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Визуализации кальция в<em&gt; Drosophila</em&gt; При активации Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Долгосрочный Живая съемка<em&gt; Drosophila</em&gt; Диски глаз

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging и анализ мышечных сокращений в дрозофилы эмбриона

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Прямой и простой метод для оценки Drosophila меланогастер'S жизнеспособность от эмбриона к взрослому

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Изображение Внутриядерных Actin Роды в Live Heat подчеркнул Drosophila эмбрионов

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Визуализация дрозофилы меланогастера с использованием микрокомпьютерной томографии

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Вскрытие и живая визуализация поздней эмбриональной гонады дрозофилы

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...