Name: imaging dpp release from a drosophila wing disc
Uploaded: 2019-10-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Vi vill tacka Dr. Sarala Pradhan för att ha arbetat med en tidigare version av detta protokoll. Vi skulle vilja tacka NSF-IOS 1354282 för finansiering medan vi utvecklat detta protokoll. Vi vill tacka NIH-NIDCR RO1DE025311 för finansiering av vårt labb för närvarande.

1. samla ägg för att generera larver för dissektion
<ol><li>Cross 30-40 Virgin Female DPP-GAL4/TM6 TB hu flyger till 10-15 hane SP/CyO-GFP; UAS-DPP-GFP/TM6 TB hu. Anmärkning: Två genotyper som innehåller DPP-GAL4 och UAS-DPP-GFP får användas så länge belastningsutjämnare har larv markörer som möjliggör val av lämplig avkomma under larvstadiet.</li>
	<li>För att samla ägg, vänd korsade flugor i en ny flaska med mat och låt dem lägga till 3 – 4 h innan du tar bort dem från injek...

<ol>
	<li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decapentaplegic+acts+as+a+morphogen+to+organize+dorsal-ventral+pattern+in+the+Drosophila+embryo.">Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo.</a> Cell. 71 (3), 451-461 (1992).</li><li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+enhancement+and+repression+of+the+activity+of+the+TGF-beta+family+member,+decapentaplegic,+is+necessary+for+dorsal-ventral+pattern+formation+in+the+Drosophila+embryo.">Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo.</a> Development. 114 (3), 583-597 (1992).</li><li>Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activity+gradient+of+decapentaplegic+is+necessary+for+the+specification+of+dorsal+pattern+elements+in+the+Drosophila+embryo.">An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.</a> Development. 117 (2), 807-822 (1993).</li><li>Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+to+identify+elements+of+the+decapentaplegic+signaling+pathway+in+Drosophila.">Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).</li><li>Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+decapentaplegic+and+engrailed+expression+in+Drosophila+imaginal+disks:+do+these+genes+mark+the+anterior-posterior+compartment+boundary.">The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary.</a> Development. 113 (1), 27-33 (1991).</li><li>Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-beta+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila.</a> Development. 111 (3), 657-666 (1991).</li><li>de Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+decapentaplegic+and+thick+veins+during+the+differentiation+of+the+veins+in+the+Drosophila+wing.">Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Letsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dpp+signaling+is+mediated+by+the+punt+gene+product:+a+dual+ligand-binding+type+II+receptor+of+the+TGF+beta+receptor+family.">Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family.</a> Cell. 80 (6), 899-908 (1995).</li><li>Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+serine/threonine+kinases+implicated+in+the+control+of+Drosophila+body+pattern+by+decapentaplegic.">Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic.</a> Cell. 78 (2), 225-237 (1994).</li><li>Raftery, L. A., Sutherland, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+family+signal+transduction+in+Drosophila+development:+from+Mad+to+Smads.">TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads.</a> Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+regulate+Dpp+release+in+the+Drosophila+wing+disc.">Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Dahal, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inwardly+rectifying+K++channel+is+required+for+patterning.">An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning.</a> Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).</li><li>George, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channel+Contributions+to+Wing+Development+in+Drosophila+melanogaster.">Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster.</a> G3. 9 (4), 999-1008 (2019).</li><li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses.">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li><li>Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dpp+gradient+formation+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Cell. 103 (6), 971-980 (2000).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+influence+Drosophila+wing+morphogenesis+by+regulating+Dpp+release.">Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Hazegh, K. E., Reis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Buoyancy-based+Method+of+Determining+Fat+Levels+in+Drosophila.">A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+Drosophila+wing+imaginal+disc+cytonemes+on+Decapentaplegic.">Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic.</a> Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332 (6027), 354-358 (2011).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes+as+specialized+signaling+filopodia.">Cytonemes as specialized signaling filopodia.</a> Development. 141 (4), 729-736 (2014).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+by+touch--neurons+are+not+alone.">Communicating by touch--neurons are not alone.</a> Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).</li></ol>

BMPs som DPP göra sin betydande inverkan när de binder ett komplex av membranbundna receptorer för att orsaka en kaskad av Intracellulär signalering i angränsande eller tydligen avlägsna celler. Dr Thomas Kornberg ' s Lab har visat att celler som producerar DPP signalkontakt celler som tar emot signalen med hjälp av aktin baserade tunna filapodia-liknande strukturer som kallas cytonemes15,24,25. Dessa data tyder på att u...

Ben morfogenetiska proteiner (BMPs) är viktiga för tidig embryogenes och mönstringen av vuxna strukturer. BMPs produceras och utsöndras för att påverka transkription av målgener som behövs för tillväxt och celldifferentiering i att reagera celler. Decapentaplegic (DPP) är en Drosophila homolog av BMP4 som är viktig för utvecklingen av embryonala och vuxna strukturer som Wing1,2,3,4. Flera grupper har fokuserat på rollen som DPP i mönstringen Adult fly Wings eftersom 1) vingarna består av två transparenta epitel ark med en konsekvent Ådringen mönster som lätt kan bedömas; 2) vingen skivorna är också rimligt platt, kan odlas utanför larven, och är enkla att bild och kvantifiera skillnader i mönster; och 3) Ving mönstret utveckling är känsligt för DPP så att små störningar i vägen kommer att påverka Wing Ådringen mönster.
DPP produceras i celler som finns i den främre/bakre gränsen av Wing Disc5,6,7,8. DPP binder till ett komplex av typ 1-och typ 2-serin/treoninkinasreceptorer9,10. Vid DPP-bindning, typ 2-receptorn fosforylater typ 1-receptorn som sedan fosforylerar mödrar mot DPP (MAD), en SMAD 1/5/8 homolog. Fosforylerade SMAD rekryterar en extra Co-SMAD (Medea), som gör det möjligt att komma in i kärnan där den reglerar målgener, vilket leder till nedströms effekter såsom proliferation eller differentiering4,11.
Nyligen har Bates Lab visat att felaktig frisättning av DPP inom Wing-skivan kan leda till en minskning av Mad fosforylering, minskning av mål genuttryck, och Ving mönster defekter12,13. Flera Jon kanaliserar får effektutveckling av drosophilaen påskyndar och tillhörande strukturerar14,15. Dessa jonkanaler kan också vara involverade i DPP-utgåvan. Vid bestämning av mekanismen för morphogen release, det är viktigt att det finns en metod för att visualisera release händelser.
DRS. Aurelio Teleman och Stephen Cohen skapade en DPP-GFP fusion protein som kan rädda förlust av DPP, vilket innebär att det är biologiskt aktiv och släpps på ett biologiskt relevant sätt16. Här beskriver vi hur vi visualisera DPP release händelser med hjälp av denna DPP-GFP. Detta fusionsprotein är särskilt användbart eftersom GFP är pH-känsligt så att när det är i sura blåsor, är fluorescensen släckt17. Därför, när ett protein som är märkta med GFP frigörs från en vesikel i den mer neutrala extracellulära miljön, ökar GFP fluorescens intensitet17. Vi utnyttjade pH-känsligheten hos GFP för att avgöra om DPP-GFP är bosatt i sura blåsor. Vi avbildade Wing skivor uttrycker DPP-GFP före och efter tillsats av ammoniumklorid, som neutraliserar intracellulära fack blåsor18. Vi fann en signifikant ökning av fluorescensen av Auktor efter tillsats av ammoniumklorid, vilket tyder på att intracellulära DPP-GFP är släckt innan tillsats av ammoniumklorid18. Vi drar slutsatsen att intracellulära DPP-GFP bosatt i sura membran-bundna avdelningar, såsom blåsor, och är OSLÄCKT vid tillsats av ammoniumklorid att neutralisera pH i intracellulära fack18. Detta gör Live Imaging av DPP-GFP en användbar teknik för att visualisera dynamiken i DPP i Drosophila Wing skivan som den släpps från sura fack i den extracellulära miljön.
Här beskriver vi den metod vi använder för att visualisera DPP release händelser med hjälp av DPP-GFP. DPP-GFP kan uttryckas i sitt ursprungliga mönster i Drosophila Wing skivor med hjälp av UAS-GAL4 system19. Detta är den metod som användes för att fastställa att IRK kanaler Impact DPP release18. Vi validerade metoden genom Live-Imaging z-stackar. Vi ser inte DPP-GFP Auktor rör sig inom det plan av fokus i tidsserier om vi förvärvade i ett plan av fokus. Vi ser inte heller förflyttning av DPP-GFP Auktor om vi avbildas i en z-stack. Vi drar slutsatsen att DPP-GFP Auktor sett med denna metod är release händelser snarare än förflyttning av vesikler intracellulärt. Denna metod för Live-avbildning av DPP-GFP kan potentiellt användas för att testa andra förmodade modifierare av DPP release för deras inverkan på DPP dynamik eller kan ändras för att titta på dynamiken i andra ligander

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baker&#39;s yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dyhydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>484-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Agar Type II</td>
			<td>Apex</td>
			<td>66-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500233</td>
			<td>Forceps for dissecting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Corn Syrup</td>
			<td>Karo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>Breiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S22060-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Micsroscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>U330-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy Flour</td>
			<td>ADM Specialty Ingredients</td>
			<td>062-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose dyhydrate</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Corn Meal</td>
			<td>Quaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dpp release from a drosophila wing disc

Den omvandla tillväxtfaktor-beta (TGF-β) superfamiljen är viktigt för tidig embryonal mönster och utveckling av vuxna strukturer i flercelliga organismer. Den TGF-β superfamiljen omfattar TGF-β, ben morfogenetiska protein (BMPs), Activins, tillväxt och differentiering faktorer, och Nodals. Det har länge varit känt att mängden ligand utsätts för celler är viktigt för dess effekter. Det ansågs att långväga koncentrations gradienter inrätta embryonala mönster. Men nyligen har det blivit klart att tidpunkten för exponeringen för dessa ligander är också viktigt för deras nedströms transkriptionella konsekvenser. En TGF-β-superfamilj ligand kan inte ha en utvecklingsmässig konsekvens förrän den frigörs från den cell där den producerades. Tills nyligen var det svårt att avgöra när dessa ligander släpptes från celler. Här visar vi hur man mäter frisläppandet av en Drosophila BMP kallas Decapentaplegic (DPP) från cellerna i Wing primordium eller Wing Disc. Denna metod kan ändras för andra system eller signalering ligands.

Figur 2 visar representativa Live-Imaging resultat av detta protokoll. När protokollet är framgångsrikt, DPP-GFP kan ses som en rand ner i mitten av Wing skivan med kärnor synlig som icke-fluorescerande cirklar i DPP-GFP-regionen (figur 2). DPP-GFP release är synlig som fluorescerande Auktor som visas och försvinner. Vi har observerat DPP-GFP-fluorescens som dyker upp och försvinner i cell kropparna och långt från cell kropparna. DPP signalering är ber...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Tidpunkten för exponeringen för ligander kan påverka deras utvecklingsmässiga konsekvenser. Här visar vi hur man bild release av en Drosophila Bone morfogenetiska protein (bmp) kallas DPP från celler i Wing Disc.

Avbildning DPP-utgåva från en Drosophila Wing-skiva

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

DPP påverka cell öde genom att binda receptorer och skicka en signal intracellulärt att påverka transkription. Om DPP produceras men inte frigörs, har den inte tillgång till receptorer och kan därför inte utföra sina roller. Denna teknik gör det möjligt att visualisera DPP release gör det möjligt för forskare att undersöka vilka genetiska och miljömässiga faktorer ändra DPP release dynamik.BMP-signalvägen bevaras från flugor till människor så vi förväntar oss att den mekanism som dikterar DPP-utgåvan också kommer att vara relevant för mänsklig utveckling och förnyelse. Börja med att korsa 30 till 40 jungfruliga kvinnliga DPP GAL4 flugor med 10 till 15 manliga UAS DPP-GFP flugor. Uppmuntra äggläggning genom att lägga till en liten mängd jästpasta till en färsk injektionsflaska med mat.För att samla äggen, vänd de korsade flugorna i injektionsflaskan och låt dem ligga i tre till fyra timmar innan du tar bort dem. Håll ägginsamlingsflaskan på 25 grader Celsius i cirka 144 timmar tills larverna är på tredje instar-stadiet. Välj sedan lämpliga larver för dissektion.Först väljer larver som är icke-TB som kommer att vara normal längd snarare än kort och fett. För att välja DPP-GFP uttrycker larver, visa dem under en fluorescens stereomikroskop. Alla icke-TB-larver kommer att ha viss fluorescens, men GFP är begränsad till vingskivorna och är mindre ljus på DPP-GFP-larverna.Förbered modifierad HL3 media enligt manuskriptet riktningar som kommer att hålla vingen skivorna vid liv för bildframställning. Justera pH-värdet till 7.1 med HEPES och filtrera det sedan genom ett 0,22 mikrometerfilter. Placera två bitar av färglös dubbelsidig tejp bredd klokt över ett mikroskop bild lämnar ett utrymme på cirka fem millimeter mellan dem och se till att ändarna av bandet ligger spolas med kanterna på bilden.Använd en plan kant för att trycka fast tejpen ordentligt på bilden. Tillsätt 25 mikroliter av det modifierade HL3-mediet mellan de två tejpbitarna. När vingskivan monteras i media kommer tejpbitarna att förhindra att den krossas av täcket.För att dissekera larven, placera den i det modifierade HL3-mediet och försiktigt riva den i hälften med hjälp av två par tlys. Kassera den bakre halvan, sedan greppa mitten av den främre halvan med ett par tövövingar och använda det andra paret för att driva mun krokarna tillbaka in i larven tills den är helt inverterad. Leta efter de skarpa böjarna i de två mörkare färgade primära grenarna i luftstrupen som löper ner på båda sidor av larven.Vingskivorna ligger direkt under. Ta försiktigt bort skivorna och lägg dem i HL3-media på den förberedda glidningen och se till att inga trakeabitar fortfarande sitter fast på skivorna. Ordna vingskivorna så att vingpåsens peripodialsida är vänd uppåt med skivan liggandes plant.Täck vingen med en täckör och tätning med nagellack. När lacket är torrt, fortsätt omedelbart med bildbehandling. Avbilda den monterade vingskivan med hjälp av ett konfokalt laserscanningsmikroskop med ett 40X-oljemål och en 488 nanometerlaser.Samla bilder med en hastighet av två hertz i två minuter. För bästa resultat, ställ in laserkraften bara tillräckligt stark för att få en tydlig bild av DPP-frisättande celler för att undvika över blekning. Samla in bilderna som en tidsserie och exportera dem som AVI-filer för att få en video av DPP-utgåvan.När protokollet lyckas visas DPP-GFP som en rand ner i mitten av vingskivan med kärnor synliga som icke fluorescerande cirklar. DPP-GFP release är synlig som fluorescerande puncta som visas och försvinner både i och långt bort från cellen organ. Den distinkta puncta är sannolikt i cytonemer eller vid cytonemes synapser.Vingskivorna monteras så att bildåtergivningen görs från peripodialsidan. Om vingskivan avbildas från baksidan, kommer DPP-GFP fluorescens visas ur fokus och upplösning kommer att vara dålig. När GFP inte är smält till DPP, ingen puncta utanför cellkropparna observeras.Denna kontroll visar att DPP-GFP beter sig annorlunda än GFP ensam. Vidare visas inga fluorescerande puncta när DPP-GFP inte uttrycks. Under denna procedur är det viktigt att vingskivan monteras peripodial sida upp.Om vingskivan är felaktigt orienterad, kommer DPP-GFP visas ur fokus. Denna metod skulle kunna användas för att studera utsläpp av andra utvecklingsmässiga signalering ligander som vinglösa eller igelkott. Vi kan utforska alla de olika miljömässiga och genetiska faktorer som kan påverka DPP release.Dessutom kan vi anpassa denna metod för att studera BMP-frisättning från andra celltyper.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-avbildning av<em&gt; Drosophila</em&gt; PUPP Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upprätt avbildning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging kalcium i<em&gt; Drosophila</em&gt; Vid Egg Aktivering

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Långsiktig Live avbildning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Ögon Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levande avbildning och analys av muskelsammandragningar i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Upptining, odling och bevarandet Drosophila cellinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkt och enkel metod för att bedöma Drosophila melanogasterlönsamhet från embryo till vuxen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods i levande värme stressade Drosophila embryon

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Hel djuravbildning av Drosophila melanogaster med mikrodatortomografi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissektion och live-avbildning av den sena embryonala Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...