Name: imaging dpp release from a drosophila wing disc
Uploaded: 2019-10-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Dr. Sarala Pradhan'a bu protokolün daha önceki bir versiyonu üzerinde çalıştığı için teşekkür ederiz. Bu protokolü geliştirirken finansman için NSF-IOS 1354282'ye teşekkür ederiz. Nih-NIDCR RO1DE025311'e şu anda laboratuvarımızı finanse ettiği için teşekkür ederiz.

1. Diseksiyon için Larva Oluşturmak için Yumurta Toplama
<ol><li>Çapraz 30-40 bakire dişi Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu 10-15 erkek Sp/CyO-GFP uçar; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu. NOT: Dpp-GAL4 ve UAS-Dpp-GFP içeren iki genotip, dengeleyicilerde larva evresinde uygun singenin seçilmesine olanak tanıyan larva belirteçleri olduğu sürece kullanılabilir.</li>
	<li>Yumurta toplamak için, çapraz sinekleri taze bir yiyecek şişesine çevirin ve şişeden çıkarmadan önce 3-4 saat yumurtlamalarına izin veri...

<ol>
	<li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decapentaplegic+acts+as+a+morphogen+to+organize+dorsal-ventral+pattern+in+the+Drosophila+embryo.">Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo.</a> Cell. 71 (3), 451-461 (1992).</li><li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+enhancement+and+repression+of+the+activity+of+the+TGF-beta+family+member,+decapentaplegic,+is+necessary+for+dorsal-ventral+pattern+formation+in+the+Drosophila+embryo.">Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo.</a> Development. 114 (3), 583-597 (1992).</li><li>Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activity+gradient+of+decapentaplegic+is+necessary+for+the+specification+of+dorsal+pattern+elements+in+the+Drosophila+embryo.">An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.</a> Development. 117 (2), 807-822 (1993).</li><li>Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+to+identify+elements+of+the+decapentaplegic+signaling+pathway+in+Drosophila.">Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).</li><li>Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+decapentaplegic+and+engrailed+expression+in+Drosophila+imaginal+disks:+do+these+genes+mark+the+anterior-posterior+compartment+boundary.">The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary.</a> Development. 113 (1), 27-33 (1991).</li><li>Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-beta+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila.</a> Development. 111 (3), 657-666 (1991).</li><li>de Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+decapentaplegic+and+thick+veins+during+the+differentiation+of+the+veins+in+the+Drosophila+wing.">Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Letsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dpp+signaling+is+mediated+by+the+punt+gene+product:+a+dual+ligand-binding+type+II+receptor+of+the+TGF+beta+receptor+family.">Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family.</a> Cell. 80 (6), 899-908 (1995).</li><li>Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+serine/threonine+kinases+implicated+in+the+control+of+Drosophila+body+pattern+by+decapentaplegic.">Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic.</a> Cell. 78 (2), 225-237 (1994).</li><li>Raftery, L. A., Sutherland, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+family+signal+transduction+in+Drosophila+development:+from+Mad+to+Smads.">TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads.</a> Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+regulate+Dpp+release+in+the+Drosophila+wing+disc.">Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Dahal, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inwardly+rectifying+K++channel+is+required+for+patterning.">An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning.</a> Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).</li><li>George, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channel+Contributions+to+Wing+Development+in+Drosophila+melanogaster.">Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster.</a> G3. 9 (4), 999-1008 (2019).</li><li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses.">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li><li>Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dpp+gradient+formation+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Cell. 103 (6), 971-980 (2000).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+influence+Drosophila+wing+morphogenesis+by+regulating+Dpp+release.">Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Hazegh, K. E., Reis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Buoyancy-based+Method+of+Determining+Fat+Levels+in+Drosophila.">A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+Drosophila+wing+imaginal+disc+cytonemes+on+Decapentaplegic.">Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic.</a> Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332 (6027), 354-358 (2011).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes+as+specialized+signaling+filopodia.">Cytonemes as specialized signaling filopodia.</a> Development. 141 (4), 729-736 (2014).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+by+touch--neurons+are+not+alone.">Communicating by touch--neurons are not alone.</a> Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).</li></ol>

Dpp gibi BmP'ler, komşu veya görünüşte uzak hücrelerde hücre içi sinyal bir çağlayan neden membran bağlı reseptörleri karmaşık bir bağlamak zaman önemli bir etki yapmak. Dr Thomas Kornberg'in laboratuvarı göstermiştir ki, sitokinler15,24,25olarak adlandırılan aktin bazlı ince filapodia benzeri yapılar kullanarak sinyal alan Dpp sinyal temas hücrelerini üreten hücreler . Bu veriler, bu bağlamda gelişi...

Kemik Morfogenetik Proteinler (KPS) erken embriyogenez ve yetişkin yapıların desenleme için gereklidir. KİP'ler, yanıt veren hücrelerde büyüme ve hücre farklılaşması için gerekli hedef genlerin transkripsiyonunu etkileyecek şekilde üretilir ve salgılanır. Decapentaplegic (Dpp) kanat1gibi embriyonik ve yetişkin yapıların gelişimi için önemli olan BMP4 bir Drosophila homolog,2,3,4. Çeşitli gruplar yetişkin sinek kanatları desenleme Dpp rolü üzerinde duruldu çünkü 1) kanatları kolayca değerlendirilebilir tutarlı bir venasyon desenli iki şeffaf epitel levhaoluşur; 2) kanat diskleri de makul düz, larva dışında kültürlü olabilir ve görüntü ve desen farklılıkları ölçmek için basit; ve 3) kanat desen gelişimi dpp duyarlı dır ki yoldaki küçük tedirginlikler kanat venasyon deseni etkileyecektir.
Dpp kanat diski5,6,7,8ön /posterior sınırında bulunan hücrelerde üretilir. Dpp tip 1 ve tip 2 serine/ threonine kigaz reseptörleri9,10bir komplekse bağlanır. Dpp bağlanması üzerine tip 2 reseptörü, anneleri Dpp (Mad) ile fosforilasyona yol açan tip 1 reseptörü fosforilasyona, bir Smad 1/5/8 homolog. Fosforlu SMAD ek bir co-Smad acemi (Medea), hangi hedef genleri düzenleyen çekirdek girmek sağlar, bu tür çoğalma veya farklılaşma gibi downstream etkilerine yol açan4,11.
Son zamanlarda, Bates Lab kanat diskiçinde Dpp yanlış salınımı Mad fosforilasyon bir azalmaya yol açabilir göstermiştir, hedef gen ekspresyonu azalma, ve kanat desenleme kusurları12,13. Drosophila kanadıve ilişkili yapıların çeşitli iyon kanalları etkisi gelişimi14,15. Bu iyon kanalları da Dpp sürümü dahil olabilir. Morfojen salınım mekanizmasını belirlerken, serbest bırakma olaylarını görselleştirmek için bir yöntem olması önemlidir.
Dr Aurelio Teleman ve Stephen Cohen Dpp kaybı kurtarmak mümkün bir Dpp-GFP füzyon proteini oluşturdu, biyolojik olarak aktif olduğu anlamına gelir ve biyolojik olarak ilgili bir şekilde serbest bırakılır16. Burada, bu Dpp-GFP'yi kullanarak Dpp sürüm olaylarını nasıl görselleştirdiğimizi anlatıyoruz. GFP asidik veziküllerde olduğunda floresan17söndürülür gibi pH duyarlı olduğu için bu füzyon proteini özellikle yararlıdır. Bu nedenle, GFP ile etiketlenmiş bir protein daha nötr hücre dışı ortama bir vezikül serbest bırakıldığında, GFP floresans yoğunluğu artar17. Dpp-GFP'nin asidik veziküllerde olup olmadığını belirlemek için GFP'nin pH duyarlılığından yararlandık. Hücre içi kompartmanları nötralize eden amonyum klorür ilavesinden önce ve sonra Dpp-GFP ifade eden kanat disklerini görüntüledik18. Amonyum klorür ilavesinden sonra puncta floresansında önemli bir artış bulduk, bu da hücre içi Dpp-GFP'nin amonyum klorür18ilavesinden önce söndürüldünden kaynaklandı. Hücre içi Dpp-GFP'nin veziküller gibi asidik membrana bağlı bölmelerde bulunduğu ve hücre içi bölmelerin pH'ını nötralize etmek için amonyum klorür eklenmesi yle söndeğinin olmadığı sonucuna vardık18. Bu dpp-GFP canlı görüntüleme yararlı bir teknik olarak asidik bölmelerden hücre dışı ortama serbest bırakılır gibi Drosophila kanat diskinde Dpp dinamikleri görselleştirmek için yapar.
Burada, Dpp-GFP kullanarak Dpp sürüm olaylarını görselleştirmek için kullandığımız yöntemi açıklıyoruz. Dpp-GFP UAS-GAL4 sistemi19kullanılarak Drosophila kanat diskleri kendi yerli desen ifade edilebilir. Bu, Irk kanallarının Dpp salınımını18'eetkilediğini belirlemek için kullanılan yöntemdir. Bu yöntemi canlı görüntüleme z-yığınları ile doğruladık. Bir odak düzleminde elde ettiğimizde Dpp-GFP puncta'nın zaman serisinde odak düzleminde hareket diğini görmüyoruz. Biz de bir z-yığın görüntülenmiş eğer Dpp-GFP puncta hareketi görmüyorum. Bu yöntemle görülen Dpp-GFP puncta'sının hücre içi veziküllerin hareketi yerine serbest bırakma olayları olduğu sonucuna varıyoruz. Dpp-GFP canlı görüntüleme Bu yöntem potansiyel Dpp dinamikleri üzerindeki etkileri için Dpp sürümü diğer putatif değiştiriciler test etmek için kullanılabilir veya diğer ligands dinamikleri bakmak için değiştirilebilir

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baker&#39;s yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dyhydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>484-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Agar Type II</td>
			<td>Apex</td>
			<td>66-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500233</td>
			<td>Forceps for dissecting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Corn Syrup</td>
			<td>Karo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>Breiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S22060-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Micsroscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>U330-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy Flour</td>
			<td>ADM Specialty Ingredients</td>
			<td>062-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose dyhydrate</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Corn Meal</td>
			<td>Quaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dpp release from a drosophila wing disc

Transforming Büyüme Faktörü-beta (TGF-β) süper ailesi, çok hücreli organizmalarda erişkin yapıların erken embriyonik desenleşeme ve gelişimi için gereklidir. TGF-β süper familyası TGF-β, kemik morfogenetik protein (KBP), Aktivinler, Büyüme ve Farklılaşma Faktörleri ve Nodalları içerir. Uzun hücrelere maruz ligand miktarı etkileri için önemli olduğu bilinmektedir. Uzun menzilli konsantrasyon degradelerinin embriyonik desen kurduğu düşünülüyordu. Ancak, son zamanlarda bu ligands maruz kalma zamanlaması da onların downstream transkripsiyonel sonuçları için önemli olduğu ortaya çıkmıştır. TGF-β süper familya ligi, üretildiği hücreden serbest bırakılmadan gelişimsel bir sonucu olamaz. Yakın zamana kadar, bu ligandların hücrelerden ne zaman salınıldığını belirlemek zordu. Burada kanat primordium veya kanat diskhücrelerinden Decapentaplegic (Dpp) adlı bir Drosophila BMP salınımını ölçmek için nasıl göstereceğim. Bu yöntem diğer sistemler veya sinyal ligands için değiştirilebilir.

Şekil 2 bu protokolün temsili canlı görüntüleme sonuçlarını gösterir. Protokol başarılı olduğunda, Dpp-GFP kanat diskinin merkezinde nisbeten aşağı doğru bir şerit olarak görülebilir ve çekirdekleri Dpp-GFP bölgesinde floresan olmayan daireler olarak görülebilir (Şekil 2). Dpp-GFP sürümü görünür ve kaybolan floresan puncta olarak görülebilir. Dpp-GFP floresansının hücre cisimlerinde ve hücre cisimlerinden uzak larda ortaya ?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Ligandlara maruz kalmanın zamanlaması gelişimsel sonuçlarını etkileyebilir. Burada kanat diskhücrelerinden Dpp adı verilen Drosophila kemik morfogenetik proteininin (BMP) nasıl görüntülenebildiğini gösteriyoruz.

Drosophila Wing Disc'ten Görüntüleme Dpp Salınımı

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

DPP reseptörleri bağlayarak hücre kaderini etkiler ve transkripsiyon etkilemek için hücre içi bir sinyal gönderme. DPP üretilir ancak serbest bırakılmazsa, reseptörlere erişimi yoktur ve bu nedenle rollerini yerine getiremez. Bu teknik, araştırmacıların hangi genetik ve çevresel faktörlerin DPP salınım dinamiklerini değiştirdiğini incelemelerini sağlayan DPP salınımLarını görselleştirmeyi mümkün kılar.BMP sinyal yolu sineklerden insanlara kadar korunur, bu yüzden DPP salınımını belirleyen mekanizmanın da insan gelişimi ve yenilenmesi için uygun olmasını bekliyoruz. 30-40 bakire dişi DPP GAL4 10 ila 15 erkek UAS DPP-GFP sinekler ile uçar geçerek başlayın. Taze bir gıda şişesine az miktarda maya salçası ekleyerek yumurtlamayı teşvik edin.Yumurtaları toplamak için, çapraz sinekleri şişeye çevirin ve çıkarmadan önce 3-4 saat yumurtlamalarına izin verin. Larvalar üçüncü yıldız aşamasında olana kadar yumurta toplama şişelerini yaklaşık 144 saat boyunca 25 derecede tutun. Sonra diseksiyon için uygun larvaseçin.İlk olarak, kısa ve yağ yerine normal uzunlukta olacak tüberküloz olmayan larvaları seçin. Larvaları ifade eden DPP-GFP'yi seçmek için, bunları floresan stereo mikroskop altında görüntüleyin. Tüberküloz olmayan tüm larvalar bazı floresan lara sahip olur, ancak GFP kanat diskleri ile sınırlıdır ve DPP-GFP larvaları üzerinde daha az parlaktır.Kanat disklerini görüntüleme için canlı tutacak el yazması talimatlara göre modifiye HL3 ortamhazırlayın. HEPES ile pH'ı 7,1'e ayarlayın ve 0,22 mikrometrelik bir filtreden geçirin. İki adet renksiz çift taraflı bant genişliğini mikroskop slaytına yerleştirin ve aralarında yaklaşık beş milimetrelik bir boşluk bırakarak ve bandın uçlarının kaydıraktan kenarlarıyla kızardığından emin olun.Bandı slayta sıkıca bastırmak için düz bir kenar kullanın. İki bant parçası arasına modifiye edilmiş HL3 ortamının 25 mikrolitresini ekleyin. Kanat diski ortama monte edildiğinde, bant parçaları kapak kayması tarafından ezilmekten önler.Larvayı incelemek için, modifiye edilmiş HL3 ortamına yerleştirin ve iki çift forceps kullanarak yavaşça ikiye bölün. Arka yarısı atın, sonra bir çift forceps ile ön yarısında orta kavramak ve tamamen ters kadar larva içine ağız kanca geri itmek için diğer çifti kullanın. Larvanın her iki tarafından aşağı doğru çalışan trakeanın iki koyu renkli ana dalındaki keskin kıvrımlara bakın.Kanat diskleri doğrudan altında yatıyor. Diskleri yavaşça çıkarın ve hazırlanan slayttaki HL3 ortamına koyarak disklere hala trakea parçalarının bağlı olmadığından emin olun. Kanat disklerini, kanat kesesinin peripodial tarafının diskdüz yatarken yukarı bakacak şekilde düzenleyin.Bir coverslip ve oje ile mühür ile kanat kapağı. Cila kurudıktan sonra, hemen görüntüleme ile devam edin. 40X yağ hedefi ve 488 nanometre lazer ile konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak monte kanat diski görüntüleyin.İki dakika boyunca iki hertz hızında görüntüleri toplayın. En iyi sonuçlar için, lazer gücünü, ağartma üzerinde önlemek için DPP serbest hücrelerin net bir görüntü elde etmek için yeterince güçlü ayarlayın. Bir zaman serisi olarak görüntüleri toplamak ve DPP sürümü bir video elde etmek için AVI dosyaları olarak dışa aktarın.Protokol başarılı olduğunda, DPP-GFP kanat diskinin merkezinde bir şerit olarak görünür ve çekirdekleri floresan olmayan daireler olarak görünür. DPP-GFP salınımı, hücre gövdelerinde ve hücre gövdelerinden uzakta görünen ve kaybolan floresan puncta olarak görülebilir. Farklı puncta sitoknemes veya sitokinmes sinaps muhtemeldir.Kanat diskleri, görüntülemeperipodial tarafından yapılacak şekilde monte edilir. Kanat diski ters taraftan görüntülenirse, DPP-GFP floresansı odak dışında görünür ve çözünürlük zayıf olur. GFP DPP'ye eritilemediğinde, hücre vücutlarının dışında hiçbir delinme gözlenmez.Bu denetim, DPP-GFP'nin tek başına GFP'den farklı davrandığını gösterir. Ayrıca, DPP-GFP ifade edilmezse floresan puncta görünür. Bu işlem sırasında kanat diskinin peripodial tarafa monte edilmiş olması önemlidir.Kanat diski yanlış yönlendirilmişse, DPP-GFP odak dışında görünür. Bu yöntem kanatsız veya kirpi gibi diğer gelişimsel sinyal ligands salınımını incelemek için kullanılabilir. DPP salınımını etkileyebilecek tüm farklı çevresel ve genetik faktörleri inceleyebiliriz.Buna ek olarak, diğer hücre tiplerinden BMP salınımı çalışma için bu yöntemi uyarlayabilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Görüntüleme Kalsiyum<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Aktifleştirme de

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Drosophila Melanogaster'In Embriyodan Yetişkine Canlılığını Değerlendirmek Için Doğrudan ve Basit Bir Yöntem

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Canlı Isı Stresli Drosophila Embriyolarında İntranükleer Akin Çubuklarının Görüntülenmesi

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...