Name: quantification of tumor cell adhesion in lymph node cryosections
Uploaded: 2020-02-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections at JoVE.com

ونشكر الدكتورة روزانا دي ليما باغانو وأنا كارولينا بينهيرو كامبوس على المساعدة التقنية. تم دعم هذا العمل من خلال منح من: FAPESP - مؤسسة ساو باولو للأبحاث (2016/07463-4) ومعهد لودفيغ لأبحاث السرطان (LICR).

تم استرداد LNs من جثث جديدة من الفئران Wistar البالغة الصحية التي ضحت بها خلع عنق الرحم. اتبعنا المبادئ التوجيهية للصحة الوطنية للألم والضيق في الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات والبحوث الحيوانية التابعة لمعهد البحث والتعليم في مستشفى سيريو ليبان (CEU...

<ol>
	<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast.">The distribution of secondary growths in cancer of the breast.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).</li><li>Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+involved+in+cancer+metastasis:+a+better+understanding+to+seed+and+soil+hypothesis.">Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).</li><li>Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphatic+System+in+Disease+Processes+and+Cancer+Progression.">The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).</li><li>Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+lymph+node+involvement+and+its+significance+in+the+development+of+distant+metastases+in+head+and+neck+carcinoma.">Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma.</a> Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).</li><li>Kowalski, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+the+distribution+of+neck+node+metastasis+from+oral+carcinoma.">Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma.</a> Head &amp; Neck. 22 (3), 207-214 (2000).</li><li>McGuire, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+factors+for+recurrence+and+survival+in+human+breast+cancer.">Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).</li><li>Gervasi, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+lymph+nodal+metastases+in+prostate+cancer.">Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer.</a> The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).</li><li>Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+and+curability+at+various+levels+of+metastasis+in+resected+lung+cancer.">Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).</li><li>Sasako, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D2+lymphadenectomy+alone+or+with+para-aortic+nodal+dissection+for+gastric+cancer.">D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).</li><li>Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+evaluation+and+survival+after+curative+resection+of+colon+cancer:+systematic+review.">Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review.</a> Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+lymphadenectomy+and+preoperative+radiotherapy+for+lower+rectal+cancers.">Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers.</a> Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).</li><li>Machens, A., Dralle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+the+number+of+lymph+node+metastases+and+lung+metastasis+in+papillary+thyroid+cancer.">Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).</li><li>Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Anatomy,+Histology,+Immunohistology,+and+Ultrastructure,+Lymph+Node,+Rat.">Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat.</a> Hemopoietic System. , 129-136 (1990).</li><li>Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cords,+channels,+corridors+and+conduits:+critical+architectural+elements+facilitating+cell+interactions+in+the+lymph+node+cortex.">Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex.</a> Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).</li><li>Podgrabinska, S., Skobe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lymphatic+vasculature+in+regional+and+distant+metastases.">Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases.</a> Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).</li><li>Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CC+chemokine+receptor-7+and+regional+lymph+node+metastasis+of+B16+murine+melanoma.">Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).</li><li>Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+and+their+extracellular+matrix+ligands+in+lymphangiogenesis+and+lymph+node+metastasis.">Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EblacZ+tumor+dormancy+in+bone+marrow+and+lymph+nodes:+active+control+of+proliferating+tumor+cells+by+CD8++immune+T+cells.">EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells.</a> Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).</li><li>Cady, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+lymph+node+metastases;+a+singular+manifestation+of+the+process+of+clinical+metastases+in+cancer:+contemporary+animal+research+and+clinical+reports+suggest+unifying+concepts.">Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).</li><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+systemic+progression+of+human+cancer:+a+focus+on+the+individual+disseminated+cancer+cell-the+unit+of+selection.">The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection.</a> Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).</li><li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels,+exit+the+node,+and+colonize+distant+organs+in+mice.">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li><li>Brodt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+adhesion+to+frozen+lymph+node+sections-an+in+vitro+correlate+of+lymphatic+metastasis.">Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction.">Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).</li><li>Jandrey, E. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDRG4+promoter+hypermethylation+is+a+mechanistic+biomarker+associated+with+metastatic+progression+in+breast+cancer+patients.">NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients.</a> NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).</li><li>Costa, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+heterogeneity+of+ADAM23+promotes+tumor+growth+and+metastasis+through+LGI4+and+nitric+oxide+signals.">Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals.</a> Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+of+secondary+lymphoid+organs+impacts+on+B-cell+fate+and+survival.">Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).</li><li>Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement-membrane+components+associated+with+the+extracellular+matrix+of+the+lymph+node.">Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node.</a> Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).</li><li>Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+extracellular+matrix+proteins+of+the+lymph+node+cortex:+evidence+supporting+the+reticular+network+as+a+pathway+for+lymphocyte+migration.">Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration.</a> BMC Immunology. 11, 42 (2010).</li><li>Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Node+Metastasis+in+Breast+Cancer+Xenografts+Is+Associated+with+Increased+Regions+of+Extravascular+Drain,+Lymphatic+Vessel+Area,+and+Invasive+Phenotype.">Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype.</a> Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).</li></ol>

يتطلب نشر الخلايا السرطانية في الجهاز اللمفاوي مجموعة متنوعة من الأحداث المعقدة التي تحركها الخلايا. أنها تبدأ مع انفصال الخلية من الورم الأولي وإعادة عرض مصفوفة خارج الخلية (ECM) العمارة، ويدعمها chemotaxis المستمر والهجرة النشطة من خلال اللمفاويات afferent في طريقها إلى LNs الحارس. إذا انضمت الخلا...

الانبثاث السرطاني هو السبب الرئيسي لفشل العلاج والجانب المهيمن الذي يهدد الحياة من السرطان. كما افترض قبل 130 عاما، والنتائج انتشار النقيلي عندما نخبة من الخلايا السرطانية المنتشرة (DTCs، "البذور") اكتساب قدرات بيولوجية محددة التي تسمح لهم للتهرب من المواقع الأولية وإقامة النمو الخبيث في مواقع بعيدة ("التربة")1. في الآونة الأخيرة ، ظهرت العديد من المفاهيم الجديدة المتعلقة بعلاقات "البذور والتربة" ، مثل تحريض المنافذ premetastatic (تصور بأنها "تربة خصبة" اللازمة لازدهار "البذور" ) ، والبذر الذاتي للأورام الأولية من قبل DTCs ، و "البذور" السكون في الأعضاء الثانوية ونموذج التقدم الموازي للانبثاث2.
بالنسبة لمعظم الأورام الخبيثة الصلبة ، يمكن أن تقيم DTCs ويتم اكتشافها في العديد من الأعضاء المتوسطة ، مثل نخاع العظام والغدد الليمفاوية (LNs) في المرضى الذين يعانون من أو بدون دليل على الانبثاث السريري. لأن LNs استنزاف الورم هي الموقع الأول للانتشار الإقليمي للDTCs، LN الوضع هو مؤشر التنبؤ ية الهامة وغالبا ما يرتبط مع قرارات العلاجالمصاحب3. بالنسبة لبعض أنواع الأورام ، فإن الارتباط بين حالة LN والنتائج الأسوأ قوي ، بما في ذلك الرأس والرقبة4،5، الثدي6، البروستاتا7، الرئة8، المعدة9، القولون والمستقيم10،11 وسرطان الغدة الدرقية12.
LNs هي أجهزة صغيرة في الجهاز اللمفاوي ، مغطاة بخلايا شبكية ومحاطة بالأوعية اللمفاوية. هذه الأجهزة ضرورية للغاية لعمل الجهاز المناعي13. تعمل LNs كمنصات جذب للخلايا المناعية المتداولة ، مما يجمع الخلايا الليمفاوية والخلايا التي تقدم المستضدمع معًا14. ومع ذلك، تجذب LNs أيضًا الخلايا السرطانية المتداولة. على مدى عقود، تم تصوير LNs كطرق سلبية للنقل للخلايا السرطانية النقيلية. ومع ذلك ، أشارت الدراسات الحديثة إلى أن الخلايا السرطانية قد تسترشد أيضًا نحو LNs عن طريق التكتيك الكيميائي (chemokines) و / أو العظة (عناصر مصفوفة خارج الخلية) التي يفرزها البطانة اللمفاوية15. وكمثال على ذلك، فإن التعبير المفرط لمستقبلات CCR7 في الخلايا السرطانية يسهل توجيه خلايا الورم الميلانيني النقيلي نحو LNs التي تستنزف الورم16. بالإضافة إلى ذلك ، توفر بروتينات LN خارج الخلية سقالة لاصقة لتجنيد وبقاء الخلايا السرطانية المتداولة17. في الواقع ، توفر LNs التي تستنزف الأورام تربة خصبة لبذر DTCs ، والتي يمكن الحفاظ عليها في الدول التكاثرية أو الخاملة بواسطة إشارات بيئية صغيرة LN محددة18. والمصير النهائي لهذه البلدان النامية النامية المقيمة في الجيش الوطني مثير للجدل؛ تشير بعض الأعمال إلى أن هذه الخلايا هي مؤشرات سلبية للتقدم النقيلي19، في حين يقترح آخرون أنهم مؤسسي المقاومة على الأرجح (عن طريق المواقع الأولية ذاتية البذر) و / أو بمثابة خزانات خلوية للانبثاث (نشر "بذور" لنمو السرطان الثالث)20،21. في الآونة الأخيرة ، وذلك باستخدام نماذج ما قبل السريرية ، وقد ثبت أن جزءا صغيرا من هذه DTCs LN المقيمين غزت بنشاط الأوعية الدموية ، ودخلت في الدورة الدموية واستعمرت الرئتين21.
وبالنظر إلى أن وجود الخلايا السرطانية في LNs هو علامة لعدوانية السرطان والغازية ، في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين طريقة كلاسيكية طورها Brodt22 لقياس التصاق الخلايا السرطانية إلى LNs في المختبر. سمح لنا استخدام إجراء اختبار قائم على الفلورسينس بتطوير بروتوكول منخفض التكلفة وسريع وحساس وصديق للبيئة (غير مشع) للكشف عن التعديلات اللاصقة بين الخلايا السرطانية وأقسام التبريد LN. باستخدام خلايا سرطان الثدي MCF-7 التي تعبر عن مستويات مختلفة من التعبير الجيني NDRG4 والمقاطع المجمدة جرذ LN لتجسيد الأسلوب، أظهرنا أن هذا البروتوكول سمح بارتباط جيد بين التصاق خلايا الورم إلى LNs في المختبر وLN الانبثاث لوحظ في مرضى سرطان الثدي24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Laminar Flow</td>
			<td>Esco Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bin for Disc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020139126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T-25 cm2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1860 UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat-Brush with magnet</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14018340426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC18 Cell Traker Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>V-22885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse 80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Profile Disposable Razor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035838926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Cube (IHC)</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K560030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran 100 mL</td>
			<td>Crist&#225;lia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Bloquer Super Pap Pen</td>
			<td>Abcam, Life Science Reagents</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature &#34;OCT&#34; compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 1 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 10 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 2 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 5 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 50 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettor Easypet 3</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek cryomold</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Instituto Adolfo Lutz</td>
			<td>ATV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of tumor cell adhesion in lymph node cryosections

العقد الليمفاوية التي تستنزف الورم ليست مجرد مرشحات للنفايات الناتجة عن الورم. وهي واحدة من المواقع الإقليمية الأكثر شيوعا من الإقامة المؤقتة من الخلايا السرطانية المنشورة في المرضى الذين يعانون من أنواع مختلفة من السرطان. الكشف عن هذه الخلايا السرطانية LN المقيمة هو علامة حيوية هامة المرتبطة سوء التكهن وقرارات العلاج المصاحب. وقد أشارت نماذج الماوس الأخيرة إلى أن الخلايا السرطانية المقيمة LN يمكن أن يكون مصدرا كبيرا للخلايا الخبيثة للانبثاث البعيد. القدرة على قياس مدى التهيفية للخلايا السرطانية إلى LN parenchyma هو مقياس حاسم في البحوث التجريبية التي تركز على تحديد الجينات أو مسارات الإشارات ذات الصلة للنشر اللمفاوي / النقيلي. لأن LNs هي هياكل ثلاثية الأبعاد معقدة مع مجموعة متنوعة من المظاهر والتراكيب في أقسام الأنسجة اعتمادًا على مستوى القسم ، يصعب تكرار المصفوفات تجريبيًا في المختبر بطريقة يتم التحكم فيها بالكامل. هنا ، نصف طريقة بسيطة وغير مكلفة تسمح بالقياس الكمي للخلايا السرطانية اللاصقة إلى أقسام التبريد LN. باستخدام أقسام المسلسل من نفس LN، ونحن تكييف الطريقة الكلاسيكية التي وضعتها برودت لاستخدام التسميات غير المشعة والعد مباشرة عدد الخلايا السرطانية الملتزمة في منطقة سطح LN. يتم التعرف بسهولة على الخلايا السرطانية LN-المنضمة بواسطة المجهر الخفيف وأكد من خلال طريقة تستند إلى الفلورسينس، وإعطاء مؤشر التصاق يكشف عن تقارب الخلية ملزمة لLN parenchyma، وهو دليل موحية من التعديلات الجزيئية في ربط تقارب integrins إلى ارتباطها LN-ligands.

نحن نوضح الفحص من خلال تقييم إمكانات LN اللاصقة لخلايا سرطان الثدي الفلورية الحمراء MCF-7 التي تعبر عن مستويات مختلفة من جين NDRG4 (يشار إليه باسم NDRG4-positive والخلايا السالبة NDRG4) ، وهو مغير سلبي من تجمع beta1-integrin على سطح الخلية24، من خلال فحص كسور خلايا الورم LN-المعتنقي?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections at JoVE.com

Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections

هنا ، نصف طريقة بسيطة وغير مكلفة تسمح بالقياس الكمي للخلايا السرطانية اللاصقة إلى أقسام التبريد في العقدة الليمفاوية (LN). يتم التعرف بسهولة على الخلايا السرطانية LN المنضمة عن طريق المجهر الخفيف وتأكيدها من خلال طريقة تعتمد على الفلورسينس ، مما يعطي مؤشر التصاق يكشف عن تقارب الخلايا السرطانية الملزمة لLN parenchyma.

القياس الكمي لالتصاق خلايا الورم في أقسام التبريد في العقدة الليمفاوية

Tumor-draining lymph nodes (LNs) are not merely filters of tumor-produced waste. They are one of the most common regional sites of provisional residence ...

أكثر المواقع شيوعاً للانبثاث هي العقد اللمفاوية الأصلية. يمكن استخدام الوماتيكس للكشف عن تقارب لاصق بين الخلايا السرطانية'اللمفية أقسام العقدة في المختبر. إحدى مزايا هذه التقنية هي أن أقسام العقدة الليمفاوية الطازجة توفر تعقيدًا طبيعيًا للأنسجة الأصلية ، والتي لن يكون من الممكن إعادة إنشائها باستخدام البروتينات النقية.يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة لدراسات الأورام الجزيئية التي تسعى إلى تحديد الجينات أو العلاجات التي تتداخل مع الالتصاق الخلايا السرطانية في الأعضاء المستهدفة النقيلي، مثل الغدد الليمفاوية. لحصاد الغدد الليمفاوية في غضون ثلاثين دقيقة من التضحية، ضع فأر ويستار البالغ في إعادة شغل الظهر على لوحة تشريح نظيفة في درجة حرارة الغرفة ورش الفراء مع 70٪ من الكحول isopropyl. باستخدام أدوات تعقيم، ورفع جلد البطن وجعل شق الجلد الوسط لفضح الأحشاء البطن.استخراج الأمعاء حتى تصبح الغدد الليمفاوية الصدرية والبطن مرئية. باستخدام مقص طرف حاد، مكوس بعناية العقد الليمفاوية دون إصابة الشريان الرئيسي المتم العليا الكامنة، ووضع العقدة الليمفاوية في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني عقيم. عندما تم حصاد جميع الغدد الليمفاوية، ضع عقدة ليمفاوية واحدة لكل وجه cryomold أسفل على قاعدة كل قالب وإضافة فقط ما يكفي من متوسط درجة الحرارة المثلى لقطع لتغطية الأنسجة.بعد التجمد المفاجئ، استخدم جهاز التبريد للحصول على 5 إلى 8 ميكرومتر سميكة في 22 درجة مئوية وجمع المقاطع على الشرائح المجهر الزجاجي. تعتبر عمليات الخبس ذات الجودة الجيدة من شرائح متتالية من العقدة الليمفاوية نفسها أمرًا حاسمًا لتقليل الاختلافات بين الشرائح ، وتسهيل معدلات التصاق الخلايا المتسقة. بالنسبة لوضع العلامات على الخلايا السرطانية، حصد الخلايا ذات الاهتمام من ثقافة الخلايا التي تم تنظيمها بشكل مناسب وإعادة تعليق الخلايا عند 1 × 10 إلى 6 خلايا لكل تركيز mL ووسيلة خالية من المصل.نقل 1 مل من الخلايا في أنبوب جديد مخروطي 15 مل وتسمية الخلايا مع 2 ميكروغرام لكل mL DiI (C18) لمدة عشر دقائق في 37 درجة مئوية، مع التحريض لطيف في خمس دقائق لتجنب ترسب الخلايا. في نهاية الحضانة، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسل الخلايا المسمى مرتين مع 10 مل من مصل جديد خال من المصل لإزالة أي صبغة زائدة. بعد الغسيل الثاني، إعادة تعليق الخلايا في 1 × 10 إلى 6 خلايا لكل مل من المتوسطة خالية من المصل، وتستكمل مع 0.1٪ تركيز مصل الأبقار.دعوى من الخلايا السرطانية المسمى على أقسام الأنسجة العقد الليمفاوية المحصودة، غسل بلطف المقاطع مرتين في برنامج تلفزيوني، تليها إعادة الترطيب في برنامج تلفزيوني جديد لمدة خمسة عشر دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، كتلة أي ربط غير محددة مع 2.5٪ البوم الدم البقري لمدة ثلاثين دقيقة في 37 درجة مئوية، قبل استخدام مسحة القطن لتجفيف الشرائح. استخدام قلم مبيد للماء لرسم حاجز حول كل قسم وإضافة 100 ميكرولترات من الخلايا المسمى على كل عقدة اللمفية المحاصرة.بعد ساعة إلى ساعتين في 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة، وإزالة أي خلايا عدم الالتزام مع أربعة يغسل لطيف في برنامج تلفزيوني وإصلاح خلايا الفلورسينس المتمسك المتبقية مع 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة خمس عشرة دقيقة في درجة حرارة الغرفة. للحصول على تحديد كمي لمؤشر لاصق، استخدم الهدف 10x على المجهر المفلور للحصول على صور TIFF الفردية من كل قسم في حقول الفلورسنت مشرق وأحمر. ثم، اسم وحفظ الصور بشكل منهجي قبل فتح الصور في فيجي.بعد وضع الجدول، استخدم أداة المضلع لتحديد المنطقة ذات الأهمية التي سيتم تحديدها كمياً. حدد لتحديد منطقة العقدة الليمفاوية. وسيتم التعبير عن البيانات في ملليمتر مربع.بعد ذلك، حدد الإضافات، تحليل، عداد الخلية وانقر على الصورة ليتم تحديدها كميا. انقر فوق تهيئة وحدد نوع العداد. ثم، انقر على الخلايا في الصورة.وسيتم التعبير عن مؤشر الالتصاق العقدة الليمفاوية كرقم الخلايا السرطانية التي تُلتَكِن بها في منطقة العقدة الليمفاوية المغطاة. لتهيئة الصورة التالية، افتح الصورة التالية وكرر القياس الكمي كما هو موضح. كما لوحظ، يتم تقريب مورفولوجيا الخلايا المنضمة في الشكل، وتنتشر الخلايا غير متجانسة في جميع أنحاء العقدة الليمفاوية من الفائدة.مؤشر الالتصاق العقدة الليمفاوية هو اثنين إلى ثلاثة أضعاف أعلى في خطوط خلايا سرطان الثدي السلبية NDRG4، مقارنة بتلك التي تقاس للخلايا الإيجابية NDRG4 المقابلة. يمكن تكييف هذا الإجراء للمساعدة في معدلات الالتصاق في الأنسجة المستهدفة النقيلي الأخرى، مثل الدماغ أو الرئتين، لتقييم المواقع التفضيلية الثانوية للتصاق الخلايا السرطانية الملقحة. تذكر أن كلا من الأنسجة الطازجة والمجمدة ينبغي النظر في مخاطرة بيولوجية وينبغي التعامل معها باستخدام الاحتياطات المناسبة للسلامة البيولوجية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

الرئة ورم الخلية تجنيد الإنزيم

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

ورم انجرافتمينت في نموذج الفأر إكسينوجرافت من عباءة البشرية الخلية اللمفاوية

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

الخلية الهدف الجينوم قبل التخصيب وكله التضخيم لتوصيف المصب خلية مفردة

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

وصف ملحقات غشاء الخلية ودراسة أدوارهم في ديناميات التصاق خلايا السرطان

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

في فيفو تقييم الجيش الشعبي الثوري لدرجة الحموضة، فس2، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات والجلوتاثيون في "ورم المكروية"

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي