Name: quantification of tumor cell adhesion in lymph node cryosections
Uploaded: 2020-02-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections at JoVE.com

Wir danken Dr. Rosana De Lima Pagano und Ana Carolina Pinheiro Campos für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien von: FAPESP - Sao Paulo Research Foundation (2016/07463-4) und Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) unterstützt.

LNs wurden von frischen Kadavern gesunder erwachsener Wistar-Ratten geborgen, die durch Zervixverrenz geopfert wurden. Wir folgten den NIH-Richtlinien für Schmerzen und Leiden bei Labortieren und alle Verfahren wurden von der Ethikkommission und Tierforschung des Forschungs- und Bildungsinstituts des Krankenhauses von Sério-Libans (CEUA P 2016-04) genehmigt.
HINWEIS: Alle frisch gefrorenen Gewebe gelten als biogefährlich und sollten unter geeigneten Biosicherheitsvorkehrungen behandelt werd...

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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+heterogeneity+of+ADAM23+promotes+tumor+growth+and+metastasis+through+LGI4+and+nitric+oxide+signals.">Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals.</a> Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+of+secondary+lymphoid+organs+impacts+on+B-cell+fate+and+survival.">Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).</li><li>Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+extracellular+matrix+proteins+of+the+lymph+node+cortex:+evidence+supporting+the+reticular+network+as+a+pathway+for+lymphocyte+migration.">Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration.</a> BMC Immunology. 11, 42 (2010).</li><li>Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Node+Metastasis+in+Breast+Cancer+Xenografts+Is+Associated+with+Increased+Regions+of+Extravascular+Drain,+Lymphatic+Vessel+Area,+and+Invasive+Phenotype.">Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype.</a> Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).</li></ol>

Die Verbreitung von Krebszellen durch das Lymphsystem erfordert eine Vielzahl komplexer zellgesteuerter Ereignisse. Sie initiieren mit Zellablösung vom Primärtumor und der Umgestaltung der extrazellulären Matrixarchitektur (ECM) und werden durch anhaltende Chemotaxis und aktive Migration durch die affeligen Lymphatiken auf dem Weg zu den Sentinel-LNs unterstützt. Wenn Krebszellen in LNs haften und überleben, können sie sich leicht auf andere Sekundärorgane ausbreiten. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur...

Krebsmetastasen sind der Hauptgrund für Behandlungsversagen und der vorherrschende lebensbedrohliche Aspekt von Krebs. Wie vor 130 Jahren postuliert, entsteht die metastasierende Ausbreitung, wenn eine Elite von verbreiteten Tumorzellen (DTCs, die "Samen") spezifische biologische Fähigkeitenerwerben, die es ihnen ermöglichen, primäre Standorte zu umgehen und bösartiges Wachstum an entfernten Stellen (dem "Boden") zu etablieren 1 . In jüngster Zeit sind mehrere neuartige Konzepte über die "Samen- und Bodenbeziehungen" entstanden, wie die Induktion prämetastatischer Nischen (konzeptioniert als "fruchtbarer Boden", der für "Samen" benötigt wird, um zu gedeihen), die Selbstaussaat von Primärtumoren durch DTCs, "Samen"-Ruhe an sekundären Organen und das parallele Progressionsmodell der Metastasierung2.
Bei den meisten soliden Malignitäten können DTCs in vielen mesenchymalen Organen, wie Knochenmark und Lymphknoten (LNs) bei Patienten mit oder ohne Nachweis klinischer Metastasierung, residieren und nachgewiesen werden. Da tumorabflussende LNs der erste Standort der regionalen Verbreitung von DTCs sind, ist der LN-Status ein wichtiger prognostischer Indikator und wird oft mit adjuvanten Therapieentscheidungen in Verbindung gebracht3. Bei einigen Tumortypen ist die Korrelation zwischen LN-Status und schlechteren Ergebnissen stark, einschließlich Kopf und Hals4,5, Brust6, Prostata7, Lunge8, Magen9, kolorektal10,11 und Schilddrüsenkrebs12.
LNs sind kleine eiförmige Organe des Lymphsystems, die mit Netzzellen bedeckt und mit Lymphgefäßen umschlossen sind. Diese Organe sind absolut notwendig für die Funktion des Immunsystems13. LNs fungieren als Anziehungsmittel plattformen für immun zirkulierende Zellen und bringen die Lymphozyten und Antigen-präsentierenden Zellen zusammen14. Jedoch, LNs ziehen auch zirkulierende Tumorzellen. Über Jahrzehnte wurden LNs als passive Transportwege für metastasierende Tumorzellen dargestellt. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass Tumorzellen auch durch chemotaktische (Chemokine) und/oder haptotaktische (extrazelluläre Matrixelemente) vom lymphatischen Endothel15sezernierte Cues zu LNs geführt werden können. Als Beispiele erleichtert die Überexpression des CCR7-Rezeptors in Tumorzellen die Führung metastasierender Melanomzellen hin zu tumorableitenden LNs16. Darüber hinaus bieten extrazelluläre LN-Proteine ein Klebegerüst für die Rekrutierung und das Überleben zirkulierender Tumorzellen17. Tatsächlich liefern tumorableitende LNs fruchtbaren Boden für die Aussaat von DTCs, die in proliferativen oder ruhenden Zuständen durch spezifische LN-Mikroumweltsignale gehalten werden können18. Das endgültige Schicksal dieser LN-wohnhaften DTCs ist umstritten; Einige Arbeiten deuten darauf hin, dass diese Zellen passive Indikatoren für die metastasierende Progressionsind 19, während andere vorschlagen, dass sie eher Gründer von Resistenzen sind (durch selbstsäende primäre Standorte) und/oder als zelluläre Reservoirs für Metastasen fungieren (Verbreitung von "Samen" für tertiäres Krebswachstum)20,21. Kürzlich wurde mit präklinischen Modellen nachgewiesen, dass ein Bruchteil dieser LN-wohnhaften DTCs aktiv in Blutgefäße eingedrungen ist, in den Blutkreislauf gelangt eist und die Lunge kolonisiert hat21.
In Anbetracht der Tatsache, dass das Vorhandensein von Krebszellen in LNs ein Marker für Krebsaggressivität und Invasivität ist, haben wir in dieser Studie eine klassische Methode optimiert, die von Brodt22 entwickelt wurde, um die Adhäsion von Tumorzellen an LNs in vitro quantitativ zu messen. Die Verwendung eines fluoreszenzbasierten Assays ermöglichte es uns, ein kostengünstiges, schnelles, empfindliches und umweltfreundliches (nicht radioaktives) Protokoll zum Nachweis von Klebstoffveränderungen zwischen Tumorzellen und LN-Kryosektionen zu entwickeln. Mit den MCF-7 Brustkrebszellen, die verschiedene Niveaus der NDRG4-Genexpression und Ratten-LN-Frozen-Abschnitte exdrücken, um die Methode zu veranschaulichen, zeigten wir, dass dieses Protokoll eine gute Korrelation zwischen der Adhäsion von Tumorzellen zu LNs in vitro und LN-Metastasen, die bei Brustkrebspatientinnen beobachtet wurden, ermöglichte24.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Laminar Flow</td>
			<td>Esco Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bin for Disc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020139126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T-25 cm2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1860 UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat-Brush with magnet</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14018340426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC18 Cell Traker Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>V-22885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse 80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Profile Disposable Razor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035838926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Cube (IHC)</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K560030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran 100 mL</td>
			<td>Crist&#225;lia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Bloquer Super Pap Pen</td>
			<td>Abcam, Life Science Reagents</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature &#34;OCT&#34; compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 1 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 10 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 2 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 5 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 50 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettor Easypet 3</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek cryomold</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Instituto Adolfo Lutz</td>
			<td>ATV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of tumor cell adhesion in lymph node cryosections

Tumorabflussende Lymphknoten (LNs) sind nicht nur Filter von tumorerzeugten Abfällen. Sie sind einer der häufigsten regionalen Standorte des vorläufigen Wohnsitzes von disseminierten Tumorzellen bei Patienten mit verschiedenen Krebsarten. Der Nachweis dieser LN-lebenden Tumorzellen ist ein wichtiger Biomarker, der mit schlechten Prognose- und adjuvanten Therapieentscheidungen verbunden ist. Jüngste Mausmodelle haben gezeigt, dass LN-lebende Tumorzellen eine wesentliche Quelle bösartiger Zellen für entfernte Metastasen sein könnten. Die Fähigkeit, die Verklebung von Tumorzellen mit LN Parenchym zu quantifizieren, ist ein kritisches Maß in der experimentellen Forschung, das sich auf die Identifizierung von Genen oder Signalwegen konzentriert, die für die lymphatische/metastasierende Verbreitung relevant sind. Da LNs komplexe 3D-Strukturen mit einer Vielzahl von Erscheinungen und Zusammensetzungen in Gewebeabschnitten sind, abhängig von der Ebene des Abschnitts, sind ihre Matrizen schwierig, experimentell in vitro in einer vollständig kontrollierten Weise zu replizieren. Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Methode, die die Quantifizierung von klebenden Tumorzellen zu LN-Kryosektionen ermöglicht. Mit seriellen Abschnitten desselben LN passen wir die von Brodt entwickelte klassische Methode an nicht radioaktive Etiketten an und zählen direkt die Anzahl der haftenden Tumorzellen pro LN-Oberfläche. LN-anhängliche Tumorzellen werden leicht durch Lichtmikroskopie identifiziert und durch eine fluoreszenzbasierte Methode bestätigt, was einen Haftungsindex ergibt, der die zellbindende Affinität zu LN-Parenchym offenbart, was ein suggestiver Beweis für molekulare Veränderungen in der Affinitätsbindung von Integrinen an ihre korrelierten LN-Liganden ist.

Wir veranschaulichen den Test, indem wir das LN-Klebstoffpotenzial roter fluoreszierender MCF-7-Brustkrebszellen bewerten, die verschiedene Ebenen des NDRG4-Gens (als NDRG4-positive und NDRG4-negative Zellen bezeichnet) exmittieren, einen negativen Modulator der Beta1-Integrin-Clustering an der Zelloberfläche24, indem wir die Fraktionen von Ratten-LN-anhaftenden Tumorzellen untersuchen. Beispiele für die Rohbilder dieses Protokolls sind in Ab...

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Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections

Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Methode, die die Quantifizierung von klebenden Tumorzellen zu Lymphknoten (LN) Kryosektionen ermöglicht. LN-anhängliche Tumorzellen werden leicht durch Lichtmikroskopie identifiziert und durch eine fluoreszenzbasierte Methode bestätigt, die einen Haftindex ergibt, der die Tumorzellbindungsaffinität zu LN-Parenchym offenbart.

Quantifizierung der Tumorzelladhäsion in Lymphknoten-Kryosektionen

Tumor-draining lymph nodes (LNs) are not merely filters of tumor-produced waste. They are one of the most common regional sites of provisional residence ...

Die häufigsten Stellen für Metastasen sind die ursprünglichen Lymphknoten. Somatids können verwendet werden, um die Klebstoffaffinität zwischen den Lymphknotenabschnitten von Tumorzellen in vitro zu erkennen. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass frische Lymphknotenabschnitte eine natürliche Komplexität des ursprünglichen Gewebes bieten, die nicht mit gereinigten Proteinen nachbilden könnte.Diese Methode könnte für molekulare Onkologiestudien nützlich sein, die versuchen, Gene oder Therapien zu identifizieren, die die Adhäsion von Tumorzellen an metastasierenden Zielorganen wie Lymphknoten stören. Um die Lymphknoten innerhalb von dreißig Minuten nach dem Opfer zu ernten, legen Sie die erwachsene Wistar-Ratte in dorsaler Rekumbency auf ein sauberes Dissektionsbrett bei Raumtemperatur und sprühen Sie das Fell mit 70% Isopropylalkohol. Mit sterilisierten Instrumenten, heben Sie die Bauchhaut und machen einen medialen Hautschnitt, um die Bauchviszera auszusetzen.Extrahieren Sie den Darm, bis die brust- und abdominalen Lymphknoten sichtbar werden. Mit einer stumpfen Spitzenschere die Lymphknoten sorgfältig verbrauchen, ohne die zugrunde liegende obere mesenterische Arterie zu verletzen, und legen Sie den Lymphknoten in ein 15 ml-Rohr, das 5 ml steriles PBS enthält. Wenn alle Lymphknoten geerntet sind, legen Sie einen Lymphknoten pro Kryomold mit dem Gesicht nach unten auf die Basis jeder Form und fügen Sie gerade genug optimale Schneidtemperaturmedium hinzu, um das Gewebe zu bedecken.Nach dem Einfrieren des Drucks verwenden Sie einen Kryostat, um 5 bis 8 Mikrometer dicke Abschnitte bei 22 Grad Celsius zu erfassen und die Abschnitte auf Glasmikroskop-Dias zu sammeln. Hochwertige Kryosektionen aus aufeinanderfolgenden Scheiben desselben Lymphknotens sind entscheidend für die Minimierung von Unterschieden zwischen den Scheiben und die Erleichterung konsistenter Zellhaftungsraten. Für die Tumorzellbeschriftung die interessenschonenden Zellen aus einer entsprechend inszenierten Zellkultur ernten und die Zellen bei 1 x 10 zu den 6 Zellen pro ml-Konzentration und serumfreiem Medium wieder suspendieren.Übertragen Sie 1 ml Zellen in ein neues 15 ml konisches Rohr und beschriften Sie die Zellen mit 2 Mikrogramm pro ml DiI(C18) für zehn Minuten bei 37 Grad Celsius, mit sanfter Erregung bei fünf Minuten, um eine Zellsedimentation zu vermeiden. Am Ende der Inkubation pellet die Zellen durch Zentrifugierung und waschen Sie die markierten Zellen zweimal mit 10 ml frischem serumfreiem Medium, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Nach der zweiten Wäsche die Zellen bei 1 x 10 auf die 6 Zellen pro ml serumfreies Medium wieder aussetzen, ergänzt durch 0,1% Rinderserumalbuminkonzentration.Durch das Fortschreiten der markierten Tumorzellen auf die geernteten Lymphknotengewebeabschnitte, waschen Sie die Abschnitte vorsichtig zweimal in PBS, gefolgt von einer Rehydratation in frischem PBS für fünfzehn Minuten bei Raumtemperatur. Blockieren Sie am Ende der Inkubation jede unspezifische Bindung mit 2,5% Rinderserumalbumin für dreißig Minuten bei 37 Grad Celsius, bevor Sie einen Wattestäbchen verwenden, um die Rutschen zu trocknen. Verwenden Sie einen hydrophoben Pen, um eine Barriere um jeden Abschnitt zu ziehen und fügen Sie 100 Mikroliter markierter Zellen auf jeden eingekreisten Lymphknoten hinzu.Nach ein bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer alle nicht haftenden Zellen mit vier sanften Waschungen in PBS entfernen und die verbleibenden haftenden Fluoreszenzzellen mit 3,7% Formaldehyd in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Für die Quantifizierung des Klebstoffindex verwenden Sie das 10-fache Objektiv auf einem Fluoreszenzmikroskop, um individuelle TIFF-Bilder von jedem Abschnitt in den hellen und roten Fluoreszenzfeldern zu erhalten. Dann benennen und speichern Sie die Bilder systematisch, bevor Sie die Bilder in Fidschi öffnen.Nachdem Sie den Maßstab gesetzt haben, wählen Sie mit dem polygonalen Werkzeug den zu quantifizierenden Interessenbereich aus. Wählen Sie diese Option aus, um den Lymphknotenbereich zu quantifizieren. Die Daten werden in Quadratmillimetern ausgedrückt.Als Nächstes wählen Sie Plugins, Analysieren, Zellenzähler und klicken Sie auf das Foto, um quantifiziert zu werden. Klicken Sie auf Initialisieren, und wählen Sie Zählertyp aus. Klicken Sie dann auf die Zellen im Foto.Der Lymphknoten-Adhäsionsindex wird als Anzahl der anhaftenden Tumorzellen pro abgedeckter Lymphknotenfläche ausgedrückt. Um das nächste Foto zu initialisieren, öffnen Sie das nächste Foto, und wiederholen Sie die Quantifizierung wie gezeigt. Wie beobachtet, ist die Morphologie der anhaftenden Zellen in Form gerundet, und die Zellen sind heterogen über den Lymphknoten von Interesse verteilt.Der Lymphknoten-Adhäsionsindex ist in NDRG4-negativen Brustkrebszelllinien zwei- bis dreimal höher als bei entsprechenden NDRG4-positiven Zellen. Dieses Verfahren kann angepasst werden, um Haftraten in anderen metastasierenden Zielgeweben, wie Gehirn oder Lunge, zu unterstützen, um die sekundären bevorzugten Haftstellen für inseminierte Tumorzellen zu bewerten. Denken Sie daran, dass sowohl frische als auch gefrorene Gewebe als biogefährlich betrachtet werden sollten und unter verwendung sorgsam mit Biosicherheitsvorkehrungen behandelt werden sollten.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Forschung

Krebsforschung

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