Name: quantification of tumor cell adhesion in lymph node cryosections
Uploaded: 2020-02-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections at JoVE.com

אנו מודים לד ר רוסאנה דה לימה פאגאנו ואנה קרולינה Pinheiro קמפוס לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ: FAPESP-סאו פאולו מחקר קרן (2016/07463-4) ולודוויג המכון לחקר הסרטן (LICR).

LNs התגלו מגוויות טרי של מבוגר בריא חולדות Wistar הוקרב על ידי פריקה צוואר הרחם. עקבנו אחר הנחיות NIH לכאב ומצוקה בחיות מעבדה וכל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה ומחקר בעלי חיים של מכון המחקר והחינוך של בית החולים Sírio-Libanês (CEUA P 2016-04).
הערה: כל הרקמות הקפואות הטריות נחשבות לחומרים ב?...

<ol>
	<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast.">The distribution of secondary growths in cancer of the breast.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).</li><li>Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+involved+in+cancer+metastasis:+a+better+understanding+to+seed+and+soil+hypothesis.">Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).</li><li>Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphatic+System+in+Disease+Processes+and+Cancer+Progression.">The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).</li><li>Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+lymph+node+involvement+and+its+significance+in+the+development+of+distant+metastases+in+head+and+neck+carcinoma.">Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma.</a> Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).</li><li>Kowalski, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+the+distribution+of+neck+node+metastasis+from+oral+carcinoma.">Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma.</a> Head &amp; Neck. 22 (3), 207-214 (2000).</li><li>McGuire, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+factors+for+recurrence+and+survival+in+human+breast+cancer.">Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).</li><li>Gervasi, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+lymph+nodal+metastases+in+prostate+cancer.">Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer.</a> The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).</li><li>Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+and+curability+at+various+levels+of+metastasis+in+resected+lung+cancer.">Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).</li><li>Sasako, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D2+lymphadenectomy+alone+or+with+para-aortic+nodal+dissection+for+gastric+cancer.">D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).</li><li>Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+evaluation+and+survival+after+curative+resection+of+colon+cancer:+systematic+review.">Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review.</a> Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+lymphadenectomy+and+preoperative+radiotherapy+for+lower+rectal+cancers.">Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers.</a> Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).</li><li>Machens, A., Dralle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+the+number+of+lymph+node+metastases+and+lung+metastasis+in+papillary+thyroid+cancer.">Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).</li><li>Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Anatomy,+Histology,+Immunohistology,+and+Ultrastructure,+Lymph+Node,+Rat.">Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat.</a> Hemopoietic System. , 129-136 (1990).</li><li>Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cords,+channels,+corridors+and+conduits:+critical+architectural+elements+facilitating+cell+interactions+in+the+lymph+node+cortex.">Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex.</a> Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).</li><li>Podgrabinska, S., Skobe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lymphatic+vasculature+in+regional+and+distant+metastases.">Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases.</a> Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).</li><li>Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CC+chemokine+receptor-7+and+regional+lymph+node+metastasis+of+B16+murine+melanoma.">Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).</li><li>Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+and+their+extracellular+matrix+ligands+in+lymphangiogenesis+and+lymph+node+metastasis.">Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EblacZ+tumor+dormancy+in+bone+marrow+and+lymph+nodes:+active+control+of+proliferating+tumor+cells+by+CD8++immune+T+cells.">EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells.</a> Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).</li><li>Cady, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+lymph+node+metastases;+a+singular+manifestation+of+the+process+of+clinical+metastases+in+cancer:+contemporary+animal+research+and+clinical+reports+suggest+unifying+concepts.">Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).</li><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+systemic+progression+of+human+cancer:+a+focus+on+the+individual+disseminated+cancer+cell-the+unit+of+selection.">The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection.</a> Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).</li><li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels,+exit+the+node,+and+colonize+distant+organs+in+mice.">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li><li>Brodt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+adhesion+to+frozen+lymph+node+sections-an+in+vitro+correlate+of+lymphatic+metastasis.">Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction.">Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).</li><li>Jandrey, E. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDRG4+promoter+hypermethylation+is+a+mechanistic+biomarker+associated+with+metastatic+progression+in+breast+cancer+patients.">NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients.</a> NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).</li><li>Costa, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+heterogeneity+of+ADAM23+promotes+tumor+growth+and+metastasis+through+LGI4+and+nitric+oxide+signals.">Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals.</a> Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+of+secondary+lymphoid+organs+impacts+on+B-cell+fate+and+survival.">Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).</li><li>Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement-membrane+components+associated+with+the+extracellular+matrix+of+the+lymph+node.">Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node.</a> Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).</li><li>Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+extracellular+matrix+proteins+of+the+lymph+node+cortex:+evidence+supporting+the+reticular+network+as+a+pathway+for+lymphocyte+migration.">Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration.</a> BMC Immunology. 11, 42 (2010).</li><li>Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Node+Metastasis+in+Breast+Cancer+Xenografts+Is+Associated+with+Increased+Regions+of+Extravascular+Drain,+Lymphatic+Vessel+Area,+and+Invasive+Phenotype.">Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype.</a> Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).</li></ol>

מערכת הלימפה הפצת תאים סרטניים דורש מגוון של אירועים מונחה תאים מורכבים. הם ליזום עם ניתוק התאים מהגידול העיקרי ואת שיפוץ של מטריצה החילוץ (ecm) האדריכלות, והם נתמכים על ידי כימוצ מתמשך הגירה פעילה דרך כלי לימפה lymphatics en בדרך הזקיף lns. אם תאים סרטניים לדבוק ולשרוד LNs, הם יכולים בקלות להתפשט לאי?...

גרורות סרטן היא הסיבה העיקרית לכישלון הטיפול ואת ההיבט הדומיננטי סכנת חיים של סרטן. כפי היסוד 130 לפני שנים, התפשטות גרורתית תוצאות כאשר האליטה של תאי הגידול הפיצו (DTCs, "זרעים") לרכוש יכולות ביולוגיות ספציפיות המאפשרות להם להתחמק אתרים עיקריים ולהקים צמיחה ממאיר באתרים מרוחקים ("האדמה")1. לאחרונה, מספר מושגים חדשניים לגבי היחסים "זרעים וקרקע" הופיעו, כגון אינדוקציה של נישות גרורתית (המשגיחה כ "אדמה פורייה" הדרושה "זרעים" כדי לשגשג), הזריעה עצמית של גידולים ראשוניים על ידי dtcs, "זרע" תרדמה באיברים משניים ומודל מתקדמות מקבילי של גרורות2.
עבור ממאירות מוצק ביותר, DTCs יכול לשכון ולהתגלות באיברים רבים mesenchymal, כגון מח עצם ובלוטות הלימפה (LNs) בחולים עם או בלי ראיות של גרורות קליני. מכיוון LNs ניקוז הגידול הם המיקום הראשון של התפשטות האזור של DTCs, במצב LN הוא אינדיקטור תחזיות חשוב והוא משויך לעיתים קרובות עם החלטות טיפול בפסיקה3. עבור חלק מסוגי הגידולים, הקורלציה בין במעמד ותוצאות גרועות יותר היא חזקה, כולל ראש וצוואר4,5, שד6, הערמונית7, ריאה8, קיבה9, המעי הגס10,11 בלוטת התריס סרטן12.
Lns הם איברים קטנים דמוי של מערכת הלימפה, כי הם מכוסים בתאים רשתית מוקף עם כלי הלימפה. איברים אלה נחוצים בהחלט לתפקוד מערכת החיסון13. LNs לפעול כפלטפורמות מושכים עבור תאים מחזורי החיסונית, להביא את לימפוציטים ו אנטיגן הצגת תאים יחד14. עם זאת, LNs גם למשוך תאים סרטניים במחזור. לאורך עשורים, LNs היו בתמונה כמסלולים פסיבי של הובלה תאים סרטניים גרורתי. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי תאים סרטניים עשוי גם להיות מונחה לכיוון LNs על ידי כימוטקטיק (נוגדנים) ו/או האפוטוטקטיק (אלמנטים מטריקס מושג) רמזים מופרש על ידי אנדותל הלימפה15. כדוגמאות, ביטוי יתר של קולטן CCR7 בתאי הגידול מקלה על ההדרכה של תאים מלנומה גרורתית לקראת הגידול-LNs מרוקן16. בנוסף, מסחטות חלבונים ב-LN לספק פיגום דבק עבור גיוס והישרדות של תאים סרטניים במחזור17. למעשה, מרוקן הגידול LNs לספק קרקע פורייה לזריעה של DTCs, אשר ניתן לשמור במדינות מתרבים או רדום על ידי מסוים בתוך אותות סביבתיים מיקרו18. גורלם הסופי של פקדי הזמן המתגוררים בעיר הוא שנוי במחלוקת; כמה עבודות מציעות כי תאים אלה הם אינדיקטורים פסיבי של התקדמות גרורתית19, בעוד אחרים מציעים כי הם בסבירות גבוהה יותר מייסדי ההתנגדות (על-ידי לזריעה עצמית אתרים ראשיים) ו/או לפעול כמאגרים סלולריים עבור גרורות (הפצת "זרעים" לצמיחת סרטן שלישוני)20,21. לאחרונה, שימוש במודלים פרה-קליניים, זה הוכיח כי חלק של אלה בתוך המתגוררים DTCs באופן פעיל הפולשים כלי הדם, נכנס למחזור הדם והכובש את הריאות21.
בהתחשב בכך נוכחות של תאים סרטניים ב LNs הוא סמן עבור תוקפנות סרטן והחלטיות, במחקר זה, אנו אופטימיזציה שיטה קלאסית שפותחה על ידי Brodt22 כדי כימות הגידול למדוד בלתי מותאם למדידת הגידולים לתאי מבחנה. השימוש בכדאיות מבוססת-פלואורסצנטית איפשר לנו לפתח פרוטוקול בעלות נמוכה, מהירה, רגישה וידידותית לסביבה (לא רדיואקטיבית) לאיתור שינויים דביקים בין תאי גידול לבין מקטעי בהקפאה. באמצעות התאים של סרטן השד MCF-7 המבטא רמות שונות של ביטוי גנים NDRG4 ועכברוש בסעיפים קפואים להדגים את השיטה, הראנו כי פרוטוקול זה איפשר מתאם טוב בין הדבקה תא הגידול כדי LNs בתוך מבחנה בתוך גרורות שנצפו בחולי סרטן השד24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Laminar Flow</td>
			<td>Esco Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bin for Disc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020139126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T-25 cm2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1860 UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat-Brush with magnet</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14018340426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC18 Cell Traker Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>V-22885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse 80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Profile Disposable Razor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035838926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Cube (IHC)</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K560030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran 100 mL</td>
			<td>Crist&#225;lia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Bloquer Super Pap Pen</td>
			<td>Abcam, Life Science Reagents</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature &#34;OCT&#34; compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 1 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 10 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 2 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 5 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 50 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettor Easypet 3</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek cryomold</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Instituto Adolfo Lutz</td>
			<td>ATV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of tumor cell adhesion in lymph node cryosections

גידול בלוטות לימפה ניקוז (LNs) הם לא רק מסננים של פסולת המיוצר הגידול. הם אחד האתרים האזוריים הנפוצים ביותר של מגורים זמניים של תאים סרטניים המופץ בחולים עם סוגים שונים של סרטן. הזיהוי של תאים אלה המתגוררים בתוך הגידול הוא בסמנים חשובים הקשורים פרוגנוזה גרועה החלטות הטיפול הפסיקה. מודלים העכבר האחרונות הצביעו על תאים סרטניים בתוך המתגוררים יכול להיות מקור משמעותי של תאים ממאירים עבור גרורות מרוחקות. היכולת לכמת את הadהיסוס של תאי הגידול לתוך מכימומה הוא מד קריטי במחקר ניסיוני המתמקד בזיהוי של גנים או איתות מסלולים הרלוונטיים הפצת הלימפה/גרורתית. מכיוון LNs הם מבנים תלת-ממדיים מורכבים עם מגוון רחב של הופעות ויצירות בסעיפים רקמות בהתאם למישור של סעיף, מטריצות שלהם קשה לשכפל ניסויים בתוך מבחנה באופן מלא בשליטה. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה וזולה המאפשרת את הקוונפיקציה של תאים סרטניים דבק כדי בהקפאה חלקים. שימוש במקטעים סידוריים של אותו LN, אנו להתאים את השיטה הקלאסית שפותחה על ידי Brodt להשתמש בתוויות לא רדיואקטיביות ולספור ישירות את מספר תאים הגידול הקפדה על פני השטח בשטח. In-חסיד תאים סרטניים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ אור ואישר על ידי שיטה מבוססת על-ידי זריחה, מתן אינדקס הדבקה החושף את הזיקה לתא-מחייב ב-LN, אשר היא עדות מרמזת של שינויים מולקולריים באיגוד האהדה של אינטגרציה להתאים שלהם ב-ligands ליגנדס.

אנו ממחישים את היכולת על ידי הערכת הפוטנציאל הדביק LN של פלורסנט אדום MCF-7 סרטן השד ביטוי רמות שונות של הגן NDRG4 (המכונה NDRG4-חיוביים ו NDRG4-שלילי תאים), מאפטור שלילי של beta1 אינטגרציה באשכולות במשטח התא24, על ידי בחינת שברים של בתאי הגידול החולדה in-חסיד. דוגמאות לתמונו?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections at JoVE.com

Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה וזולה המאפשרת כימות של תאים סרטניים דבק לצומת לימפה (LN) קריודורים. In-חסיד תאים סרטניים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ אור ואישר על ידי שיטה מבוססת-פלואורסצנטית, מתן אינדקס הדבקה החושף את הזיקה של תא הגידול מחייב לתוך הכריכה.

קוונפיקציה של הדבקה תא הגידול בצומת לימפה קריוסעיפים

Tumor-draining lymph nodes (LNs) are not merely filters of tumor-produced waste. They are one of the most common regional sites of provisional residence ...

האתרים השכיחים ביותר עבור גרורות הם בלוטות הלימפה המקוריות. Somatids ניתן להשתמש כדי לזהות את הזיקה דבק בין תאים סרטניים'לימפה קטעים במבחנה. אחד היתרונות של טכניקה זו הוא כי קטעי בלוטות לימפה טריים מספקים מורכבות טבעית של הרקמה המקורית, אשר לא ניתן יהיה לשחזר באמצעות חלבונים מטוהרים.שיטה זו יכולה להיות שימושית עבור מחקרים אונקולוגיים מולקולריים המבקשים לזהות גנים או טיפולים המפריעים להית הידבקות של תאים סרטניים באיברים יעד גרורתי, כמו בלוטות הלימפה. כדי לקצור את בלוטות הלימפה בתוך שלושים דקות של הקרבה, מניחים את חולדת Wistar הבוגרת בהפוגה הגבית על לוח ניתוח נקי בטמפרטורת החדר ומרססים את הפרווה ב-70% אלכוהול isopropyl. באמצעות מכשירים מעקרים, להרים את עור הבטן ולעשות חתך עור מתווך לחשוף את הקרביים הבטן.לחלץ את המעי עד בלוטות הלימפה בבית החזה והבטן להיות גלוי. באמצעות מספריים קהה קצה, בזהירות excise בלוטות הלימפה מבלי לפגוע העורק mesenteric מעולה הבסיסית, ולמקם את בלוטות הלימפה לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של PBS סטרילי. כאשר כל בלוטות הלימפה נקצרו, מניחים צומת לימפה אחד לכל cryomold עם הפנים כלפי מטה על הבסיס של כל עובש ולהוסיף בדיוק מספיק טמפרטורת חיתוך אופטימלית בינונית כדי לכסות את הרקמות.לאחר הקפאה הצמד, להשתמש cryostat לרכוש 5 עד 8 חלקים עבים מיקרומטר ב 22 מעלות צלזיוס ולאסוף את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. קריוסקציות באיכות טובה מפרוסות רצופות של אותו צומת לימפה הן קריטיות למזעור ההבדלים בין פרוסות, והקלה על שיעורי הידבקות עקביים בתאים. עבור תיוג תאים סרטניים, לקצור את התאים של עניין מתרבות התא מבוים כראוי מחדש להשעות את התאים ב 1 x 10 ל 6 תאים לכל ריכוז mL ובינוני ללא סרום.להעביר 1 מ"ל של תאים לתוך צינור חרוט 15 מ"ל חדש ולתייג את התאים עם 2 מיקרוגרם לכל ML DiI (C18) במשך עשר דקות ב 37 מעלות צלזיוס, עם תסיסה עדינה בחמש דקות כדי למנוע מים בתאים. בסוף הדגירה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את התאים המסומן פעמיים עם 10 מ"ל של מדיום טרי ללא סרום כדי להסיר כל צבע עודף. לאחר הכביסה השנייה, להשעות מחדש את התאים ב 1 x 10 כדי 6 תאים לכל mL של מדיום ללא סרום, בתוספת 0.1% ריכוז אלבומין בסרום bovine.המשך של תאים סרטניים שכותרתו על החלקים רקמת בלוטות הלימפה שנקטפו, בעדינות לשטוף את החלקים פעמיים PBS, ואחריו לחות מחדש PBS טרי במשך רבע שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לחסום כל כריכה לא ספציפית עם אלבומין סרום 2.5% bovine במשך שלושים דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לפני השימוש ספוגית כותנה לייבש את המגלשות. השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר מחסום סביב כל קטע ולהוסיף 100 microliters של תאים מסומנים על כל צומת לימפה מוקף.לאחר שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח, הסר את כל התאים שאינם דבקים בארבעה שטיפות עדינות ב- PBS ותקן את תאי הפלואורסצנטיות הדבקים הנותרים עם 3.7% פורמלדהיד ב- PBS במשך רבע שעה בטמפרטורת החדר. לכימות מדד דבק, השתמש במטרה 10x על מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבל תמונות TIFF בודדות של כל קטע בשדות פלואורסצנט בהירים ואדומים. לאחר מכן, תן שם ושמור את התמונות באופן שיטתי לפני פתיחת התמונות בפיג'י.לאחר הגדרת קנה המידה, השתמש בכלי מצולע כדי לבחור את אזור העניין שיש לכמת. בחר כדי לכמת את אזור בלוטות הלימפה. הנתונים יבואו לידי ביטוי במילימטרים רבועים.לאחר מכן, בחר תוספים, נתח, מונה תאים ולחץ על התמונה לכמת. לחץ על אתחל ובחר סוג מונה. לאחר מכן, לחץ על התאים בתמונה.מדד הידבקות בלוטות הלימפה יבוא לידי ביטוי כמספר תאי הגידול חסידים לכל אזור מכוסה בלוטות הלימפה. כדי לאתחל את התמונה הבאה, פתח את התמונה הבאה וחזור על הכימות כפי שהוכח. כפי שנצפה, המורפולוגיה של התאים חסיד מעוגל בצורה, ואת התאים מפוזרים הטרוגנית לאורך כל צומת הלימפה של עניין.מדד הידבקות בלוטות הלימפה הוא פי שניים עד שלושה גבוה יותר בקווי תאים שליליים של סרטן השד NDRG4, בהשוואה לזה שנמדד עבור תאים חיוביים תואמים NDRG4. הליך זה יכול להיות מותאם כדי לסייע שיעורי הידבקות ברקמות יעד גרורתיות אחרות, כמו המוח או הריאות, כדי להעריך את האתרים המועדפים משנית של הידבקות עבור תאים סרטניים ממורנים. זכור כי הן רקמות טריות וקפואות צריך להיחשב biohazardous ויש לטפל באמצעות אמצעי זהירות ביו-בטיחות מתאימים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

ריאות הגידול תא גיוס Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Engraftment גידול במודל של עכברים Xenograft של האדם מנטל לימפומה התא

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

אפיון של קרום התא הרחבות ולימוד תפקידיהם סרטן התא אדהזיה דינמיקה

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells