Name: quantification of tumor cell adhesion in lymph node cryosections
Uploaded: 2020-02-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections at JoVE.com

ロサナ・デ・リマ・パガーノ博士とアナ・カロライナ・ピニェイロ・カンポスの技術支援に感謝します。この研究は、FAPESP - サンパウロ研究財団(2016/07463-4)とルートヴィヒがん研究所(LICR)からの助成金によって支援されました。

LNは、頸部脱臼によって犠牲にされた健康な成人ウィスターラットの新鮮な死骸から回収された。我々は、実験動物の痛みと苦痛に関するNIHガイドラインに従い、すべての手順は、シリオ・リバネス病院の研究教育研究所の倫理委員会と動物研究によって承認されました(CEUA P 2016-04)。
注:すべての新鮮な凍結組織はバイオ危険とみなされ、適切なバイオセーフティの注意?...

<ol>
	<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast.">The distribution of secondary growths in cancer of the breast.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).</li><li>Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+involved+in+cancer+metastasis:+a+better+understanding+to+seed+and+soil+hypothesis.">Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).</li><li>Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphatic+System+in+Disease+Processes+and+Cancer+Progression.">The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).</li><li>Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+lymph+node+involvement+and+its+significance+in+the+development+of+distant+metastases+in+head+and+neck+carcinoma.">Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma.</a> Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).</li><li>Kowalski, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+the+distribution+of+neck+node+metastasis+from+oral+carcinoma.">Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma.</a> Head &amp; Neck. 22 (3), 207-214 (2000).</li><li>McGuire, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+factors+for+recurrence+and+survival+in+human+breast+cancer.">Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).</li><li>Gervasi, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+lymph+nodal+metastases+in+prostate+cancer.">Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer.</a> The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).</li><li>Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+and+curability+at+various+levels+of+metastasis+in+resected+lung+cancer.">Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).</li><li>Sasako, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D2+lymphadenectomy+alone+or+with+para-aortic+nodal+dissection+for+gastric+cancer.">D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).</li><li>Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+evaluation+and+survival+after+curative+resection+of+colon+cancer:+systematic+review.">Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review.</a> Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+lymphadenectomy+and+preoperative+radiotherapy+for+lower+rectal+cancers.">Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers.</a> Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).</li><li>Machens, A., Dralle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+the+number+of+lymph+node+metastases+and+lung+metastasis+in+papillary+thyroid+cancer.">Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).</li><li>Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Anatomy,+Histology,+Immunohistology,+and+Ultrastructure,+Lymph+Node,+Rat.">Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat.</a> Hemopoietic System. , 129-136 (1990).</li><li>Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cords,+channels,+corridors+and+conduits:+critical+architectural+elements+facilitating+cell+interactions+in+the+lymph+node+cortex.">Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex.</a> Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).</li><li>Podgrabinska, S., Skobe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lymphatic+vasculature+in+regional+and+distant+metastases.">Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases.</a> Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).</li><li>Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CC+chemokine+receptor-7+and+regional+lymph+node+metastasis+of+B16+murine+melanoma.">Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).</li><li>Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+and+their+extracellular+matrix+ligands+in+lymphangiogenesis+and+lymph+node+metastasis.">Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EblacZ+tumor+dormancy+in+bone+marrow+and+lymph+nodes:+active+control+of+proliferating+tumor+cells+by+CD8++immune+T+cells.">EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells.</a> Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).</li><li>Cady, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+lymph+node+metastases;+a+singular+manifestation+of+the+process+of+clinical+metastases+in+cancer:+contemporary+animal+research+and+clinical+reports+suggest+unifying+concepts.">Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).</li><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+systemic+progression+of+human+cancer:+a+focus+on+the+individual+disseminated+cancer+cell-the+unit+of+selection.">The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection.</a> Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).</li><li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels,+exit+the+node,+and+colonize+distant+organs+in+mice.">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li><li>Brodt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+adhesion+to+frozen+lymph+node+sections-an+in+vitro+correlate+of+lymphatic+metastasis.">Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction.">Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).</li><li>Jandrey, E. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDRG4+promoter+hypermethylation+is+a+mechanistic+biomarker+associated+with+metastatic+progression+in+breast+cancer+patients.">NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients.</a> NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).</li><li>Costa, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+heterogeneity+of+ADAM23+promotes+tumor+growth+and+metastasis+through+LGI4+and+nitric+oxide+signals.">Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals.</a> Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+of+secondary+lymphoid+organs+impacts+on+B-cell+fate+and+survival.">Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).</li><li>Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement-membrane+components+associated+with+the+extracellular+matrix+of+the+lymph+node.">Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node.</a> Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).</li><li>Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+extracellular+matrix+proteins+of+the+lymph+node+cortex:+evidence+supporting+the+reticular+network+as+a+pathway+for+lymphocyte+migration.">Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration.</a> BMC Immunology. 11, 42 (2010).</li><li>Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Node+Metastasis+in+Breast+Cancer+Xenografts+Is+Associated+with+Increased+Regions+of+Extravascular+Drain,+Lymphatic+Vessel+Area,+and+Invasive+Phenotype.">Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype.</a> Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).</li></ol>

がん細胞のリンパ系普及には、さまざまな複雑な細胞駆動の事象が必要です。原発性腫瘍からの細胞剥離と細胞外マトリックス(ECM)アーキテクチャの再構築を開始し、センチネルLNへの途中で持続性走化と積極的なリンパ球を介した活発な移動によって支えられている。がん細胞が付着して、NNで生き残った場合、他の二次臓器に容易に広がることができます。ここでは、腫瘍細胞と凍結したL...

癌転移は、治療の失敗の主な理由であり、癌の支配的な生命を脅かす側面である。130年前に仮定したように、転移性拡散は、普及した腫瘍細胞(DTC、種子)のエリートが、彼らが一次部位を回避し、遠くの部位(「土壌」)で悪性成長を確立することを可能にする特定の生物学的能力を獲得したときに生じる(「土壌」)1。近年、前転移性ニッチの誘導(「種子」が繁栄するために必要な「肥沃な土壌」として概念化された)、DCによる原発性腫瘍の自己播種、二次臓器での「種子」休眠、転移2の並行進行モデルなど、「種子と土壌」関係に関するいくつかの新しい概念が出現している。
ほとんどの固形悪性腫瘍では、DTCは、臨床転移の有無にかかわらず、骨髄およびリンパ節(LN)のような多くの間葉器官に存在し、検出することができる。腫瘍流出のLNは、DTCの地域的な広がりの最初の場所であるため、LNステータスは重要な予後指標であり、しばしばアジュバント療法の決定に関連付けられている3。いくつかの腫瘍タイプに対して、LNの状態と悪い結果との間の相関は強く、頭頸部4、5、乳房6、前立腺7、肺8、胃9、大腸10、11および甲状腺癌12を含む。
LNは、網状細胞で覆われ、リンパ管で囲まれたリンパ系の小さな卵器官である。これらの器官は、免疫系13の機能のために絶対に必要である。LNは、免疫循環細胞の誘引プラットフォームとして機能し、リンパ球と抗原提示細胞を14個集める。しかし、LNはまた、循環腫瘍細胞を引き付ける。何十年もの間、Nは転移性腫瘍細胞の受動的な輸送ルートとして描かれました。しかし、最近の研究では、腫瘍細胞は、リンパ系内皮15によって分泌される化学療法(ケモカイン)および/またはハプトタクティク(細胞外マトリックス要素)キューによってLNに誘導される可能性も示されている。例として、腫瘍細胞におけるCCR7受容体の過剰発現は、腫瘍流出性LN16に対する転移性黒色腫細胞の誘導を容易にする。また、細胞外LNタンパク質は、循環腫瘍細胞17のリクルートおよび生存のための接着足場を提供する。実際、腫瘍流出LNは、特定のLN微小環境信号18によって増殖状態または休眠状態で維持することができるDTCの播種のための肥沃な土壌を提供する。LN に居住するこれらの DTC の最終的な運命は議論の余地があります。いくつかの作品は、これらの細胞が転移進行19の受動的な指標であることを示唆しているが、他の人は、彼らが抵抗性の創始者である可能性が高いことを提案する(自己播種一次部位によって)および/または転移のための細胞貯蔵所として作用する(第三次癌の成長のための「種子」を広げる)20、21。最近、前臨床モデルを用いて、これらのLN居住DCの一部が積極的に血管に侵入し、血液循環に入り、肺21を植民地化することが実証されている。
この研究では、RNにおけるがん細胞の存在が癌の攻撃性と侵襲性のマーカーであることを考慮して、Brodt22が開発した古典的な方法を最適化し、インビトロでのLNに対する腫瘍細胞接着を定量的に測定した。蛍光ベースのアッセイを使用することで、腫瘍細胞とLN凍結細胞間の接着変化の検出のための低コスト、迅速、高感度、環境に優しい(非放射性)プロトコルを開発することができました。この方法を例示するために異なるレベルのNDRG4遺伝子発現およびラットLN凍結切片を発現するMCF−7乳癌細胞を用いて、このプロトコルが乳癌患者24で観察されたインビトロにおけるLNsとLN転移に対する腫瘍細胞接着との良好な相関関係を認めた。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Laminar Flow</td>
			<td>Esco Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bin for Disc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020139126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T-25 cm2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1860 UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat-Brush with magnet</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14018340426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC18 Cell Traker Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>V-22885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse 80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Profile Disposable Razor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035838926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Cube (IHC)</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K560030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran 100 mL</td>
			<td>Crist&#225;lia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Bloquer Super Pap Pen</td>
			<td>Abcam, Life Science Reagents</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature &#34;OCT&#34; compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 1 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 10 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 2 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 5 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 50 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettor Easypet 3</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek cryomold</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Instituto Adolfo Lutz</td>
			<td>ATV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of tumor cell adhesion in lymph node cryosections

腫瘍排出リンパ節(LN)は、腫瘍が産生する廃棄物のフィルターだけではありません。彼らは、異なるタイプの癌患者における播種腫瘍細胞の暫定的な居住地の最も一般的な地域サイトの1つである。これらのLN存在性腫瘍細胞の検出は、予後不良およびアジュバント療法の決定に関連する重要なバイオマーカーである。最近のマウスモデルは、LN-常駐腫瘍細胞が遠隔転移のための悪性細胞の実質的な供給源であり得る可能性を示している。LN parenchymaに対する腫瘍細胞の接着性を定量化する能力は、リンパ/転移に関連する遺伝子またはシグナル伝達経路の同定に焦点を当てた実験研究において重要なゲージである。LNは、断面の平面に応じて組織セクション内の様々な外観および組成物を有する複雑な3D構造であるため、それらの行列は完全に制御された方法で実験的にインビトロで複製することは困難である。ここでは、粘着腫瘍細胞をLN凍結片に定量化できる簡単で安価な方法について説明する。同じLNのシリアルセクションを使用して、我々は非放射性ラベルを使用し、直接LN表面積あたりの接着腫瘍細胞の数を数えるためにBrodtによって開発された古典的な方法を適応させます。LN付着性腫瘍細胞は、光顕微鏡によって容易に同定され、蛍光ベースの方法で確認され、LNパレンチマに対する細胞結合親和性を明らかにする接着性を示す接着指数を与え、インテグリンとそれらの相関性LN-リガンドへの結合における分子変化の示唆的証拠である。

このアッセイは、細胞表面24でβ1-インテグリンクラスタリングの陰性変調であるNDRG4遺伝子(NDRG4陽性およびNDRG4陰性細胞と呼ばれる)の異なるレベルを発現する赤蛍光MCF-7乳癌細胞のLN接着電位を評価し、ラットLN付着腫瘍細胞の画分を調べることによって説明する。このプロトコルの生画像の例を、図2に示します。<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections at JoVE.com

Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections

ここでは、接着性腫瘍細胞をリンパ節(LN)凍結片に定量化できる簡単で安価な方法について説明する。LN付着性腫瘍細胞は、光顕微鏡によって容易に同定され、蛍光ベースの方法で確認され、LNパレンチマに対する腫瘍細胞結合親和性を明らかにする接着指数を与える。

リンパ節凍結部における腫瘍細胞接着の定量

Tumor-draining lymph nodes (LNs) are not merely filters of tumor-produced waste. They are one of the most common regional sites of provisional residence ...

転移の最も頻繁な部位は、元のリンパ節である。ソマチドは、インビトロで腫瘍細胞リンパ節間の接着親和性を検出するために使用することができる。この技術の利点の1つは、新鮮なリンパ節セクションが元の組織の自然な複雑さを提供し、精製されたタンパク質を使用して再現できないことです。この方法は、リンパ節のような転移性標的器官における腫瘍細胞の接着を妨げる遺伝子または治療法を同定しようとする分子腫瘍学研究に有用である可能性がある。犠牲から30分以内にリンパ節を収穫するには、成人のウィスターラットを室温のきれいな解剖板の上に後回しの精液に置き、毛皮に70%イソプロピルアルコールを噴霧する。滅菌された器具を使用して、腹部の皮膚を持ち上げ、内側皮膚切開を行い、腹部内臓を露出させます。胸部および腹部リンパ節が見えるまで腸を抽出する。鈍い先端のはさみを使用して、下層の上腸間膜動脈を傷つけずにリンパ節を慎重に切除し、リンパ節を5mLの無菌PBSを含む15 mLチューブに入れる。すべてのリンパ節が採取されたら、各型の基部にクリオマール1個のリンパ節を下に置き、組織を覆うのに十分な最適な切断温度媒体を加える。スナップ凍結後、クライオスタットを使用して22°Cで5〜8マイクロメートルの厚さのセクションを取得し、ガラス顕微鏡スライドにセクションを収集します。同じリンパ節の連続したスライスからの良好な品質の凍結部分は、スライス間の違いを最小限に抑え、一貫した細胞接着率を促進するために重要です。腫瘍細胞標識の場合、目的の細胞を適宜ステージングされた細胞培養から収穫し、1x10で細胞をmL濃度および無血清培地の6細胞に再懸濁する。1 mLの細胞を新しい15 mL円錐形チューブに移し、細胞に37°Cで10分間10分間、細胞沈沈を避けるために10分間、10マイクログラム/mL DiI(C18)で細胞にラベルを付けます。インキュベーションの終了時に、遠心分離により細胞をペレット化し、10mLの新鮮な無血清培地で標識細胞を2回洗浄し、余分な染料を除去する。2回目の洗浄後、1 x 10で細胞を血清フリー培地のmL当たり6細胞に再懸濁し、0.1%ウシ血清アルブミン濃度を補った。標識された腫瘍細胞を採取したリンパ節組織切片に進み、PBSで2回静かに切片を洗浄し、続いて室温で15分間新鮮なPBSで再水和した。インキュベーションの最後に、綿棒を使用してスライドを乾燥させる前に、2.5%のウシ血清アルブミンを37°Cで30分間非特異的な結合をブロックします。疎水性ペンを使用して各セクションの周りに障壁を描き、各囲まれたリンパ節に100マイクロリットルの標識細胞を追加します。加湿チャンバーで摂氏37度で1~2時間後、PBSで4回の緩やかな洗い流しで非付着細胞を取り除き、残りの接着性蛍光細胞をPBSで3.7%ホルムアルデヒドで室温で15分間固定します。接着剤指数の定量化には、蛍光顕微鏡で10xの目的を使用して、明るい蛍光界と赤色の蛍光場の各セクションの個々のTIFF画像を取得します。次に、フィジーで画像を開く前に、画像に名前を付けて体系的に保存します。スケールを設定したら、ポリゴン ツールを使用して、定量化する対象地域を選択します。リンパ節領域を定量化する場合に選択します。データは平方ミリメートルで表されます。次に、プラグイン、分析、セルカウンターを選択し、定量化する写真をクリックします。[初期化] をクリックし、[カウンターの種類] を選択します。次に、写真のセルをクリックします。リンパ節接着指数は、対象領域のリンパ節あたりの接着性腫瘍細胞数として表される。次の写真を初期化するには、次の写真を開き、実例に示すように定量化を繰り返します。観察されるように、接着細胞の形態は形で丸められ、細胞は目的のリンパ節全体に不均一に分散される。リンパ節の接着指数は、対応するNDRG4陽性細胞について測定したものと比較して、NDRG4陰性乳癌細胞株において2〜3倍高い。この手順は、脳や肺のような他の転移性標的組織における接着率を補助し、授精腫瘍細胞に対する接着の二次的優先部位を評価するように適合させることができる。新鮮な組織と凍結組織の両方が生体有害であると考えられ、適切な生体安全対策を講じて処理する必要があることを覚えておいてください。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

肺腫瘍細胞募集試験

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

人間マントル細胞リンパ腫の異種移植マウス モデルにおける腫瘍生着

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

細胞膜の拡張機能と癌細胞の接着の役割を勉強のキャラクタリゼーション

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

生体内でPH、 pO2、酸化還元状態とリン酸濃度および腫瘍微小環境におけるグルタチオンの EPR 評価

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

住セルイメージ投射アッセイ研究神経膠腫脳腫瘍幹細胞の遊走と浸潤に

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells