Name: quantification of tumor cell adhesion in lymph node cryosections
Uploaded: 2020-02-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections at JoVE.com

Vi takker Dr. Rosana De Lima Pagano og Ana Carolina Pinheiro Campos for teknisk hjelp. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra: FAPESP - São Paulo Research Foundation (2016/07463-4) og Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).

LN-er ble gjenfunnet fra friske skrotter av friske voksne Wistar rotter ofret ved cervical dislokasjon. Vi fulgte NIH-retningslinjene for smerte og nød i laboratoriedyr, og alle prosedyrer ble godkjent av etikkkomiteen og dyreforskningen ved Forsknings- og utdanningsinstituttet ved Sírio-Libanês sykehus (CEUA P 2016-04).
MERK: Alle friske frosne vev anses som biologisk farlige og bør håndteres ved hjelp av egnede forholdsregler for biosikkerhet.
1. Lymphadenectom...

<ol>
	<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast.">The distribution of secondary growths in cancer of the breast.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).</li><li>Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+involved+in+cancer+metastasis:+a+better+understanding+to+seed+and+soil+hypothesis.">Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).</li><li>Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphatic+System+in+Disease+Processes+and+Cancer+Progression.">The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).</li><li>Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+lymph+node+involvement+and+its+significance+in+the+development+of+distant+metastases+in+head+and+neck+carcinoma.">Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma.</a> Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).</li><li>Kowalski, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+the+distribution+of+neck+node+metastasis+from+oral+carcinoma.">Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma.</a> Head &amp; Neck. 22 (3), 207-214 (2000).</li><li>McGuire, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+factors+for+recurrence+and+survival+in+human+breast+cancer.">Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).</li><li>Gervasi, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+lymph+nodal+metastases+in+prostate+cancer.">Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer.</a> The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).</li><li>Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+and+curability+at+various+levels+of+metastasis+in+resected+lung+cancer.">Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).</li><li>Sasako, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D2+lymphadenectomy+alone+or+with+para-aortic+nodal+dissection+for+gastric+cancer.">D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).</li><li>Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+evaluation+and+survival+after+curative+resection+of+colon+cancer:+systematic+review.">Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review.</a> Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+lymphadenectomy+and+preoperative+radiotherapy+for+lower+rectal+cancers.">Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers.</a> Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).</li><li>Machens, A., Dralle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+the+number+of+lymph+node+metastases+and+lung+metastasis+in+papillary+thyroid+cancer.">Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).</li><li>Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Anatomy,+Histology,+Immunohistology,+and+Ultrastructure,+Lymph+Node,+Rat.">Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat.</a> Hemopoietic System. , 129-136 (1990).</li><li>Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cords,+channels,+corridors+and+conduits:+critical+architectural+elements+facilitating+cell+interactions+in+the+lymph+node+cortex.">Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex.</a> Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).</li><li>Podgrabinska, S., Skobe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lymphatic+vasculature+in+regional+and+distant+metastases.">Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases.</a> Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).</li><li>Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CC+chemokine+receptor-7+and+regional+lymph+node+metastasis+of+B16+murine+melanoma.">Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).</li><li>Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+and+their+extracellular+matrix+ligands+in+lymphangiogenesis+and+lymph+node+metastasis.">Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EblacZ+tumor+dormancy+in+bone+marrow+and+lymph+nodes:+active+control+of+proliferating+tumor+cells+by+CD8++immune+T+cells.">EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells.</a> Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).</li><li>Cady, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+lymph+node+metastases;+a+singular+manifestation+of+the+process+of+clinical+metastases+in+cancer:+contemporary+animal+research+and+clinical+reports+suggest+unifying+concepts.">Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).</li><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+systemic+progression+of+human+cancer:+a+focus+on+the+individual+disseminated+cancer+cell-the+unit+of+selection.">The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection.</a> Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).</li><li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels,+exit+the+node,+and+colonize+distant+organs+in+mice.">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li><li>Brodt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+adhesion+to+frozen+lymph+node+sections-an+in+vitro+correlate+of+lymphatic+metastasis.">Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction.">Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).</li><li>Jandrey, E. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDRG4+promoter+hypermethylation+is+a+mechanistic+biomarker+associated+with+metastatic+progression+in+breast+cancer+patients.">NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients.</a> NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).</li><li>Costa, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+heterogeneity+of+ADAM23+promotes+tumor+growth+and+metastasis+through+LGI4+and+nitric+oxide+signals.">Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals.</a> Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+of+secondary+lymphoid+organs+impacts+on+B-cell+fate+and+survival.">Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).</li><li>Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement-membrane+components+associated+with+the+extracellular+matrix+of+the+lymph+node.">Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node.</a> Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).</li><li>Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+extracellular+matrix+proteins+of+the+lymph+node+cortex:+evidence+supporting+the+reticular+network+as+a+pathway+for+lymphocyte+migration.">Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration.</a> BMC Immunology. 11, 42 (2010).</li><li>Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Node+Metastasis+in+Breast+Cancer+Xenografts+Is+Associated+with+Increased+Regions+of+Extravascular+Drain,+Lymphatic+Vessel+Area,+and+Invasive+Phenotype.">Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype.</a> Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).</li></ol>

Lymfatisk systemformidling av kreftceller krever en rekke komplekse celledrevne hendelser. De initierer med celleavløsning fra primær svulst og ombygging av den ekstracellulære matrisen (ECM) arkitektur, og støttes av vedvarende chemotaxis og aktiv migrasjon gjennom afferent lymfater på vei til sentinel LNer. Hvis kreftceller holder seg og overlever i LN-er, kan de lett spre seg til andre sekundære organer. Her beskriver vi en enkel metode for rask og rimelig funksjonell analyse av spesifikke selvklebende interaksj...

Kreftmetastase er hovedårsaken til behandlingssvikt og det dominerende livstruende aspektet ved kreft. Som postulert for 130 år siden, den metastatiske spredningen resultater når en elite av spredte tumorceller (DTCs, "frø") skaffe spesifikke biologiske evner som tillater dem å unngå primære steder og etablere ondartet vekst på fjerne steder ("jord")1. Nylig har flere nye konsepter om "frø og jord" relasjoner dukket opp, for eksempel induksjon av premetastatiske nisjer (konseptualisert som en "fruktbar jord" som trengs for "frø" for å trives), selvsåing av primære svulster av DTCer, "frø" dvale i sekundære organer og parallell progresjonsmodell av metastase2.
For de fleste solide maligniteter kan DTCer bo og oppdages i mange mesenchymale organer, som benmarg og lymfeknuter (LAN) hos pasienter med eller uten tegn på klinisk metastase. Fordi tumordrenerende LN-er er den første plasseringen av den regionale spredningen av DTCer, er LN-status en viktig prognoseindikator og er ofte forbundet med adjuvant terapibeslutninger3. For noen tumortyper er korrelasjonen mellom LN-status og verre utfall sterk, inkludert hode og nakke4,5, bryst6, prostata7, lunge8, gastrisk9, kolorektal10,11 og skjoldbruskkjertelkreft12.
LNer er små ovale organer i lymfesystemet, som er dekket med retikulære celler og vedlagt med lymfatiske kar. Disse organene er helt nødvendige for immunsystemets funksjon13. LNer fungerer som tiltrekkende plattformer for immunsirkulerende celler, og bringer lymfocytter og antigenpresenterende celler sammen14. LNs tiltrekker seg imidlertid også sirkulerende tumorceller. Over flere tiår ble LN-er avbildet som passive transportruter for metastatiske tumorceller. Nyere studier har imidlertid indikert at tumorceller også kan styres mot LN-er ved kjemotaktisk (chemokiner) og/eller haptotaktiske (ekstracellulære matriseelementer) signaler utskilt av lymfeendotelet15. Som eksempler forenkler overuttrykk av CCR7-reseptoren i tumorceller veiledning av metastatiske melanomceller mot tumordrenerendeLN-er 16. I tillegg gir ekstracellulære LN-proteiner et selvklebende stillas for rekruttering og overlevelse av sirkulerende tumorceller17. Faktisk gir tumordrenerende LNer fruktbar jord for såing av DTCer, som kan opprettholdes i proliferative eller sovende tilstander ved spesifikke LN mikromiljøsignaler18. Den endelige skjebnen til disse LN-bosatte DTCs er kontroversiell; noen arbeider tyder på at disse cellene er passive indikatorer på metastatisk progresjon19, mens andre foreslår at de er mer sannsynlig ei grunnleggere av resistens (ved selvsåing primære steder) og / eller fungere som cellulære reservoarer for metastaser (spre "frø" for høyere kreftvekst)20,21. Nylig, ved hjelp av prekliniske modeller, har det blitt vist at en brøkdel av disse LN-bosatte DTCene aktivt invaderte blodkar, gikk inn i blodsirkulasjonen og koloniserte lungene21.
Tatt i betraktning at tilstedeværelsen av kreftceller i LN er en markør for kreft aggressivitet og invasivitet, i denne studien, optimaliserte vi en klassisk metode utviklet av Brodt22 for å kvantitativt måle tumorcellevedheking til LN in vitro. Bruken av en fluorescensbasert analyse tillot oss å utvikle en rimelig, rask, følsom og miljøvennlig (ikke-radioaktiv) protokoll for påvisning av klebende endringer mellom tumorceller og LN kryoseksjoner. Ved hjelp av MCF-7 brystkreftceller som uttrykker ulike nivåer av NDRG4 genuttrykk og rotte LN frosne seksjoner for å eksemplifisere metoden, viste vi at denne protokollen tillot en god sammenheng mellom tumorcellevedheking til LN in vitro og LN metastase observert hos brystkreftpasienter24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Laminar Flow</td>
			<td>Esco Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bin for Disc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020139126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T-25 cm2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1860 UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat-Brush with magnet</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14018340426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC18 Cell Traker Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>V-22885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse 80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Profile Disposable Razor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035838926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Cube (IHC)</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K560030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran 100 mL</td>
			<td>Crist&#225;lia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Bloquer Super Pap Pen</td>
			<td>Abcam, Life Science Reagents</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature &#34;OCT&#34; compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 1 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 10 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 2 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 5 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 50 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettor Easypet 3</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek cryomold</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Instituto Adolfo Lutz</td>
			<td>ATV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of tumor cell adhesion in lymph node cryosections

Tumordrenerende lymfeknuter (LAN) er ikke bare filtre for tumorprodusert avfall. De er en av de vanligste regionale stedene for midlertidig residens av spredte tumorceller hos pasienter med ulike typer kreft. Påvisning av disse LN-bosatte tumorcellene er en viktig biomarkør forbundet med dårlig prognose og adjuvant terapi beslutninger. Nyere musemodeller har indikert at LN-bosatte tumorceller kan være en betydelig kilde til ondartede celler for fjerne metastaser. Evnen til å kvantifisere adhesivity av tumorceller til LN parenchyma er en kritisk måler i eksperimentell forskning som fokuserer på identifisering av gener eller signalveier som er relevante for lymfatisk / metastatisk formidling. Fordi LN er komplekse 3D-strukturer med en rekke utseender og komposisjoner i vevsseksjoner avhengig av delens plan, er deres matriser vanskelige å gjenskape eksperimentelt in vitro på en fullt kontrollert måte. Her beskriver vi en enkel og rimelig metode som gjør det mulig å kvantifisere klebende tumorceller til LN kryoseksjoner. Ved hjelp av seriedeler av samme LN tilpasser vi den klassiske metoden utviklet av Brodt for å bruke ikke-radioaktive etiketter og teller direkte antall adhering tumorceller per LN overflateareal. LN-tilhenger tumorceller er lett identifisert av lys mikroskopi og bekreftet av en fluorescensbasert metode, noe som gir en vedhesjonsindeks som avslører cellebindende affinitet til LN parenchyma, som er tankevekkende bevis på molekylære endringer i affinitetbindingen av integrins til deres korrelerln-ligands.

Vi illustrerer analysen ved å evaluere LN-limpotensialet til røde fluorescerende MCF-7 brystkreftceller som uttrykker ulike nivåer av NDRG4-genet (referert til som NDRG4-positive og NDRG4-negative celler), en negativ modulator av beta1-integrinklynger på celleoverflaten24, ved å undersøke fraksjonene av rotte LN-tilhenger tumorceller. Eksempler på råbildene av denne protokollen vises i figur 2. Som observert i <strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections at JoVE.com

Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections

Her beskriver vi en enkel og rimelig metode som gjør det mulig å kvantifisere klebende tumorceller til lymfeknute (LN) kryoseksjoner. LN-tilhenger tumorceller identifiseres lett ved lysmikroskopi og bekreftes av en fluorescensbasert metode, noe som gir en vedhesindeks som avslører tumorcellebindende affinitet til LN parenchyma.

Kvantifisering av tumorcellevedheft i lymfeknute kryoseksjoner

Tumor-draining lymph nodes (LNs) are not merely filters of tumor-produced waste. They are one of the most common regional sites of provisional residence ...

De vanligste stedene for metastase er de opprinnelige lymfeknuter. Somatids kan brukes til å oppdage klebende affinitet mellom tumorceller lymfeknute seksjoner in vitro. En fordel med denne teknikken er at friske lymfeknuteseksjoner gir en naturlig kompleksitet av det opprinnelige vevet, som ikke ville være mulig å gjenskape ved hjelp av rensede proteiner.Denne metoden kan være nyttig for molekylære onkologistudier som søker å identifisere gener eller terapier som forstyrrer tumorcellers vedheft ved metastatiske målorganer, som lymfeknuter. For å høste lymfeknuter innen tretti minutter etter offer, legg den voksne Wistar-rotten i dorsal recumbency på et rent disseksjonsbrett ved romtemperatur og spray pelsen med 70% isopropylalkohol. Ved hjelp av steriliserte instrumenter, løft bukhuden og lag et mediale hud snitt for å avsløre abdominal viscera.Trekk ut tarmen til thorax- og abdominallymfeknuter blir synlige. Ved hjelp av stump-tips saks, forsiktig avgiftsdirektoratet lymfeknuter uten å skade den underliggende overlegen mesenterisk arterie, og plassere lymfeknuten i en 15 ml rør som inneholder 5 ml steril PBS. Når alle lymfeknuter er høstet, plasser en lymfeknute per kryomold med forsiden ned på bunnen av hver mugg og legg til akkurat nok optimalt skjæretemperaturmedium for å dekke vevet.Etter snap frysing, bruk en kryostat for å skaffe 5 til 8 mikrometer tykke seksjoner ved 22 grader Celsius og samle seksjonene på glassmikroskop lysbilder. Kryoseksjoner av god kvalitet fra påfølgende skiver av samme lymfeknute er avgjørende for å minimere forskjeller mellom skiver, og legge til rette for konsistente celleforheftsrater. For tumorcellemerking høster du cellene av interesse fra en passende iscenesatt cellekultur og re-suspenderer cellene ved en 1 x 10 til 6 celler per ml konsentrasjon og serumfritt medium.Overfør 1 ml celler til et nytt konisk rør på 15 ml og merk cellene med 2 mikrogram per ml DiI(C18)i ti minutter ved 37 grader Celsius, med mild agitasjon på fem minutter for å unngå cellesedimentering. På slutten av inkubasjonen pellet cellene ved sentrifugering og vask de merkede cellene to ganger med 10 ml friskt serumfritt medium for å fjerne overflødig fargestoff. Etter den andre vasken, re-suspendere cellene på en 1 x 10 til 6 celler per ml serum-fri medium, supplert med 0,1% storfe serum albumin konsentrasjon.Videre behandling av de merkede tumorcellene på de høstede lymfeknuter vevsseksjonene, vask forsiktig seksjonene to ganger i PBS, etterfulgt av rehydrering i fersk PBS i femten minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, blokkere eventuelle ikke-spesifikke bindinger med 2,5% storfe serum albumin i tretti minutter ved 37 grader Celsius, før du bruker en bomullspinne for å tørke lysbildene. Bruk en hydrofob penn til å tegne en barriere rundt hver seksjon og tilsett 100 mikroliter merkede celler på hver omkranset lymfeknute.Etter en til to timer ved 37 grader Celsius i et fuktet kammer, fjern eventuelle ikke-tilslutningsceller med fire milde vasker i PBS og fest de gjenværende tilhengerne fluorescensceller med 3,7% formaldehyd i PBS i femten minutter ved romtemperatur. For kvantifisering av klebeindeksen, bruk 10x-målet på et fluorescensmikroskop for å få individuelle TIFF-bilder av hver seksjon i de lyse og røde fluorescerende feltene. Deretter, navngi og lagre bildene systematisk før du åpner bildene i Fiji.Når du har satt skalaen, bruker du det mangekantede verktøyet til å velge interesseområdet som skal kvantifiseres. Velg for å kvantifisere lymfeknuteområdet. Dataene vil bli uttrykt i kvadratimender.Deretter velger du Plugins, Analyser, Cell Counter og klikker på bildet for å kvantifiseres. Klikk Initialiser, og velg Tellertype. Deretter klikker du på cellene på bildet.Lymfeknuteadhesjonsindeksen vil bli uttrykt som antall tilføyde tumorceller per lymfeknute dekket område. For å initialisere neste bilde, åpne neste bilde og gjenta kvantifiseringen som demonstrert. Som observert avrundes morfologien til de tilføyde cellene i form, og cellene er heterogent spredt over hele lymfeknuten av interesse.Lymfeknute vedheftsindeksen er to til tre ganger høyere i NDRG4 negative brystkreftcellelinjer, sammenlignet med den som måles for tilsvarende NDRG4-positive celler. Denne prosedyren kan tilpasses for å hjelpe vedheftsrater i andre metastatiske målvev, som hjerne eller lunger, for å evaluere sekundære fortrinnsrett steder for vedheft for inseminerte tumorceller. Husk at både ferskt og frosset vev bør betraktes som biofarlig og bør håndteres ved hjelp av egnede forholdsregler for biosikkerhet.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Lunge svulst celle rekruttering analysen

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Svulst Engraftment i en Xenograft musemodell av menneskelig mantelen celle lymfomer

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Målet cellen pre berikelse og hele genomet forsterkning for enkeltcelle nedstrøms karakteristikk

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Karakteristikk av cellemembranen utvidelser og studere deres roller i kreft celle vedheft Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

I Vivo EPR vurdering av pH, pO2, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8+ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler