Name: quantification of tumor cell adhesion in lymph node cryosections
Uploaded: 2020-02-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections at JoVE.com

Biz teknik yardım için Dr Rosana De Lima Pagano ve Ana Carolina Pinheiro Campos teşekkür ederiz. Bu çalışma: FAPESP - São Paulo Araştırma Vakfı (2016/07463-4) ve Ludwig Kanser Araştırma Enstitüsü (LICR) tarafından desteklenmiştir.

Ldns servikal çıkış tarafından kurban sağlıklı yetişkin Wistar sıçanların taze leşkurtarıldı. NIH Laboratuvar Hayvanlarında Ağrı ve Sıkıntı Rehberi'ni takip ettik ve tüm prosedürler Sírio-Libanês Hastanesi Araştırma ve Eğitim Enstitüsü Etik Komitesi ve Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylandı (CEUA P 2016-04).
NOT: Tüm taze dondurulmuş dokular biyolojik olarak tehlikeli olarak kabul edilir ve uygun biyogüvenlik önlemleri kullanılarak ele alınm...

<ol>
	<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast.">The distribution of secondary growths in cancer of the breast.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).</li><li>Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+involved+in+cancer+metastasis:+a+better+understanding+to+seed+and+soil+hypothesis.">Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).</li><li>Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphatic+System+in+Disease+Processes+and+Cancer+Progression.">The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).</li><li>Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+lymph+node+involvement+and+its+significance+in+the+development+of+distant+metastases+in+head+and+neck+carcinoma.">Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma.</a> Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).</li><li>Kowalski, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+the+distribution+of+neck+node+metastasis+from+oral+carcinoma.">Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma.</a> Head &amp; Neck. 22 (3), 207-214 (2000).</li><li>McGuire, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+factors+for+recurrence+and+survival+in+human+breast+cancer.">Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).</li><li>Gervasi, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+lymph+nodal+metastases+in+prostate+cancer.">Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer.</a> The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).</li><li>Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+and+curability+at+various+levels+of+metastasis+in+resected+lung+cancer.">Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).</li><li>Sasako, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D2+lymphadenectomy+alone+or+with+para-aortic+nodal+dissection+for+gastric+cancer.">D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).</li><li>Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+evaluation+and+survival+after+curative+resection+of+colon+cancer:+systematic+review.">Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review.</a> Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+lymphadenectomy+and+preoperative+radiotherapy+for+lower+rectal+cancers.">Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers.</a> Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).</li><li>Machens, A., Dralle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+the+number+of+lymph+node+metastases+and+lung+metastasis+in+papillary+thyroid+cancer.">Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).</li><li>Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Anatomy,+Histology,+Immunohistology,+and+Ultrastructure,+Lymph+Node,+Rat.">Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat.</a> Hemopoietic System. , 129-136 (1990).</li><li>Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cords,+channels,+corridors+and+conduits:+critical+architectural+elements+facilitating+cell+interactions+in+the+lymph+node+cortex.">Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex.</a> Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).</li><li>Podgrabinska, S., Skobe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lymphatic+vasculature+in+regional+and+distant+metastases.">Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases.</a> Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).</li><li>Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CC+chemokine+receptor-7+and+regional+lymph+node+metastasis+of+B16+murine+melanoma.">Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).</li><li>Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+and+their+extracellular+matrix+ligands+in+lymphangiogenesis+and+lymph+node+metastasis.">Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EblacZ+tumor+dormancy+in+bone+marrow+and+lymph+nodes:+active+control+of+proliferating+tumor+cells+by+CD8++immune+T+cells.">EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells.</a> Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).</li><li>Cady, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+lymph+node+metastases;+a+singular+manifestation+of+the+process+of+clinical+metastases+in+cancer:+contemporary+animal+research+and+clinical+reports+suggest+unifying+concepts.">Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).</li><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+systemic+progression+of+human+cancer:+a+focus+on+the+individual+disseminated+cancer+cell-the+unit+of+selection.">The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection.</a> Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).</li><li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels,+exit+the+node,+and+colonize+distant+organs+in+mice.">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li><li>Brodt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+adhesion+to+frozen+lymph+node+sections-an+in+vitro+correlate+of+lymphatic+metastasis.">Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction.">Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).</li><li>Jandrey, E. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDRG4+promoter+hypermethylation+is+a+mechanistic+biomarker+associated+with+metastatic+progression+in+breast+cancer+patients.">NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients.</a> NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).</li><li>Costa, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+heterogeneity+of+ADAM23+promotes+tumor+growth+and+metastasis+through+LGI4+and+nitric+oxide+signals.">Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals.</a> Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+of+secondary+lymphoid+organs+impacts+on+B-cell+fate+and+survival.">Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).</li><li>Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement-membrane+components+associated+with+the+extracellular+matrix+of+the+lymph+node.">Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node.</a> Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).</li><li>Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+extracellular+matrix+proteins+of+the+lymph+node+cortex:+evidence+supporting+the+reticular+network+as+a+pathway+for+lymphocyte+migration.">Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration.</a> BMC Immunology. 11, 42 (2010).</li><li>Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Node+Metastasis+in+Breast+Cancer+Xenografts+Is+Associated+with+Increased+Regions+of+Extravascular+Drain,+Lymphatic+Vessel+Area,+and+Invasive+Phenotype.">Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype.</a> Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).</li></ol>

Kanser hücrelerinin lenfatik sistem yayılması karmaşık hücre odaklı olaylar çeşitli gerektirir. Onlar primer tümör hücre ayrılması ve ekstrasellüler matriks remodeling ile başlar (ECM) mimarisi, ve kalıcı kemotaksis ve sentinel NNs yolda afferent lenfatikler aracılığıyla aktif göç tarafından desteklenir. Kanser hücreleri bağlı ve LNs hayatta, kolayca diğer ikincil organlara yayılabilir. Burada tümör hücreleri ve dondurulmuş NN'ler arasındaki özel yapışkan etkileşimlerin hızlı ve d...

Kanser metastazı tedavi başarısızlığının ana nedeni ve kanserin yaşamı tehdit eden yönüdür. 130 yıl önce öne sürüldüğünde, metastatik yayılma sonuçları, yaygın tümör hücrelerinin elit (DTCs, "tohumlar") onları birincil siteleri kaçınmak ve uzak bölgelerde kötü huylu büyüme kurmak için izin belirli biyolojik yetenekler elde ("toprak")1. Son zamanlarda, premetastatik nişler indüksiyon ("tohum" gelişmek için gerekli bir "verimli toprak" olarak kavramsallaştırılmış), DTCs tarafından birincil tümörlerin kendi kendine tohumlama, ikincil organlarda "tohum" uykuhali ve metastazparalelilerleme modeli 2 gibi "tohum ve toprak" ilişkileri ile ilgili çeşitli yeni kavramlar ortaya çıkmıştır 2 .
Çoğu katı maligniteiçin, DTC'ler klinik metastaz bulgusu olan veya olmayan hastalarda kemik iliği ve lenf düğümleri (LN) gibi birçok mezenkimal organda bulunabilir ve saptanabilir. Tümör drenaj LNs DTCs bölgesel yayılmasının ilk yer olduğundan, LN durumu önemli bir prognostik göstergesidir ve genellikle adjuvan tedavi kararları ile ilişkilidir3. Bazı tümör tipleri için, LN durumu ve kötü sonuçlar arasındaki korelasyon güçlü, baş ve boyun dahil4,5, meme6, prostat7, akciğer8, mide9, kolorektal10,11 ve tiroid kanserleri12.
NNs retiküler hücrelerle kaplı ve lenfatik damarlar ile çevrili lenfatik sistemin küçük oval organlardır. Bu organlar kesinlikle bağışıklık sisteminin işleyişi için gereklidir13. NNs birlikte lenfositler ve antijen sunan hücreleri getirerek, bağışıklık dolaşan hücreler için çekici platformlar olarak hareket14. Ancak, LNs da dolaşan tümör hücrelerini çekmek. On yıllar boyunca, LNs metastatik tümör hücreleri için ulaşım pasif yolları olarak resmedildi. Ancak, son çalışmalar tümör hücrelerinin de kemotaktik (kemokinler) ve / veya haptotaktik (ekstrasellüler matriks elemanları) ipuçları lenfatik endotel15tarafından salgılanan lNs doğru yönlendirilmiş olabileceğini göstermiştir. Örnek olarak, tümör hücrelerinde CCR7 reseptörünün aşırı ekspresyonu tümör drenaj LNs16doğru metastatik melanom hücrelerinin rehberlik kolaylaştırır. Buna ek olarak, ekstrasellüler LN proteinleri işe alma ve dolaşım da dahil olmak üzere bir yapışkan iskele sağlamak17. Aslında, tümör drenaj LNs belirli LN mikroçevresel sinyaller18tarafından proliferatif veya atıl devletlerde muhafaza edilebilir DTCs, tohumlama için verimli toprak sağlamak. Bu LN ikamet Eden DTCs nihai kaderi tartışmalıdır; bazı çalışmalar bu hücrelerin metastatik ilerleme pasif göstergeler olduğunu düşündürmektedir19, diğerleri direnç daha olası kurucuları olduğunu düşündürmektedir (kendi kendine tohumlama birincil siteleri) ve / veya metastaziçin hücresel rezervuarlar olarak hareket (üçüncül kanser büyümesi için "tohum" yayılıyor)20,21. Son zamanlarda, preklinik modeller kullanılarak, bu LN ikamet DTCs aktif kan damarları işgal, kan dolaşımına girdi ve akciğerlerkolonize birkısmını gösterilmiştir 21 .
NNs kanser hücrelerinin varlığı kanser saldırganlık ve invazivite için bir belirteç olduğunu göz önünde bulundurarak, Bu çalışmada, biz kantitatif in IN NNs tümör hücre adezyonu ölçmek için Brodt22 tarafından geliştirilen klasik bir yöntem optimize. Floresan tabanlı bir testin kullanılması, tümör hücreleri ile LN kriyokesitleri arasındaki yapışkan değişikliklerin tespiti için düşük maliyetli, hızlı, hassas ve çevre dostu (radyoaktif olmayan) bir protokol geliştirmemize olanak sağladı. YÖNTEMe örnek vermek için NDRG4 gen ekspresyonu ve sıçan LN dondurulmuş bölümleri farklı düzeylerde ifade MCF-7 meme kanseri hücreleri kullanarak, bu protokol in vitro ve LN metastaz meme kanseri hastalarında gözlenen LN'ler için tümör hücre adezyonu arasında iyi bir korelasyon izin gösterdi24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Laminar Flow</td>
			<td>Esco Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bin for Disc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020139126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T-25 cm2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1860 UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat-Brush with magnet</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14018340426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC18 Cell Traker Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>V-22885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse 80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Profile Disposable Razor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035838926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Cube (IHC)</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K560030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran 100 mL</td>
			<td>Crist&#225;lia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Bloquer Super Pap Pen</td>
			<td>Abcam, Life Science Reagents</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature &#34;OCT&#34; compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 1 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 10 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 2 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 5 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes 50 mL</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettor Easypet 3</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek cryomold</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Instituto Adolfo Lutz</td>
			<td>ATV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of tumor cell adhesion in lymph node cryosections

Tümör drenaj lenf düğümleri (LNs) sadece tümör üretilen atık filtreleri değildir. Farklı kanser türlerine sahip hastalarda disemine tümör hücrelerinin geçici ikamet en yaygın bölgesel sitelerinden biridir. Bu LN-ikamet eden tümör hücrelerinin tespiti kötü prognoz ve adjuvan tedavi kararları ile ilişkili önemli bir biyobelirteçtir. Son fare modelleri LN-ikamet tümör hücrelerinin uzak metastazlar için malign hücrelerin önemli bir kaynak olabileceğini göstermiştir. Tümör hücrelerinin LN parankim'e yapışmasını ölçebilme yeteneği, genlerin tanımlanmasına veya lenfatik/metastatik yayma ile ilgili sinyal yollarına odaklanan deneysel araştırmalarda kritik bir göstergedir. LN'ler, kesit düzlemine bağlı olarak doku kesitlerinde çeşitli görünüm ve kompozisyonlara sahip karmaşık 3B yapılar olduğundan, matrislerinin deneysel olarak in vitro'yu tam kontrollü bir şekilde kopyalaması zordur. Burada, yapışkan tümör hücrelerinin LN kriyokesilerine nicelleştirilmesini sağlayan basit ve ucuz bir yöntemi tanımlıyoruz. Aynı LN'nin seri bölümlerini kullanarak Brodt tarafından geliştirilen klasik yöntemi radyoaktif olmayan etiketler kullanmak ve LN yüzey alanına göre bağlı tümör hücrelerinin sayısını doğrudan saymak için uyarlıyoruz. LN-yapışık tümör hücreleri ışık mikroskobu ile kolayca tanımlanır ve floresan tabanlı bir yöntemle doğrulanır, ln parenkim için hücre bağlayıcı lık ortaya koyan bir adezyon indeksi vererek, integrinlerin bağlaçlarına bağlanmasında moleküler değişikliklerin düşündürücü kanıtıdır.

Biz ndrg4 geninin farklı düzeylerde ifade kırmızı floresan MCF-7 meme kanseri hücrelerinin LN yapışkan potansiyelini değerlendirerek test göstermek (NDRG4-pozitif ve NDRG4-negatif hücreler olarak anılacaktır), hücre yüzeyinde beta1-integrin kümeleme negatif bir modülatör24, sıçan LN-adheren tümör hücrelerinin fraksiyonları inceleyerek. Bu protokolün ham görüntüleriörnekleri Şekil 2'degösterilmiştir. <str...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections at JoVE.com

Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections

Burada, lenf nodu (LN) kriyokesilere yapışkan tümör hücrelerinin sayısallaştırılmasını sağlayan basit ve ucuz bir yöntemi tanımlıyoruz. LN-yapışık tümör hücreleri ışık mikroskobu ile kolayca tanımlanır ve floresan tabanlı bir yöntemle doğrulanır, tümör hücre bağlayıcılığını LN parenkime bağlayan bir adezyon indeksi verir.

Lenf Nodu Kriyosiyonlarında Tümör Hücre Adezyonunun Ölçülmesi

Tumor-draining lymph nodes (LNs) are not merely filters of tumor-produced waste. They are one of the most common regional sites of provisional residence ...

Metastaz için en sık görülen bölgeler orijinal lenf düğümleridir. Somatids in vitro tümör hücrelerinin lenf nodu bölümleri arasındaki yapışkan afiyeti tespit etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin bir avantajı taze lenf nodüllerinin orijinal dokunun doğal bir karmaşıklığını sağlamasıdır, bu da saflaştırılmış proteinler kullanılarak yeniden oluşması mümkün değildir.Bu yöntem, lenf düğümleri gibi metastatik hedef organlarda tümör hücrelerinin adhezyonunu engelleyen genleri veya tedavileri tanımlamayı amaçlayan moleküler onkoloji çalışmaları için yararlı olabilir. Kurban otuz dakika içinde lenf düğümleri hasat için, oda sıcaklığında temiz bir diseksiyon tahtası üzerinde dorsal recumbency yetişkin Wistar sıçan yerleştirin ve% 70 izopropil alkol ile kürk sprey. Sterilize aletleri kullanarak, karın derisi asansör ve karın vissera ortaya çıkarmak için bir medial cilt kesi yapmak.Torasik ve abdominal lenf düğümleri görünür hale gelene kadar bağırsak ayıklayın. Künt uçlu makas kullanarak, altta yatan superior mezenterik arteri yaralamadan lenf düğümlerini dikkatlice çıkarın ve lenf düğümünü 5 mL steril PBS içeren 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Tüm lenf düğümleri hasat edildiğinde, cryomold başına bir lenf düğümü her kalıbın tabanına aşağı yüz yerleştirin ve dokuları kapsayacak kadar optimum kesme sıcaklığı orta ekleyin.Ani donma sonra, 22 santigrat derece 5 ila 8 mikrometre kalınlığında bölümleri elde etmek ve cam mikroskop slaytlar üzerine bölümleri toplamak için bir kriyostat kullanın. Aynı lenf nodu ardışık dilimleri gelen kaliteli kriyokes dilimler arasındaki farkları en aza indirmek için kritik, ve tutarlı hücre yapışma oranları kolaylaştırmak. Tümör hücre etiketleme için, uygun şekilde sahnelenmiş bir hücre kültüründen ilgi hücreleri hasat ve mL konsantrasyonu ve serumsuz orta başına 6 hücre ye 1 x 10 hücreleri yeniden askıya.1 mL'lik hücreyi yeni bir 15 mL konik tüpe aktarın ve hücreleri mL DiI(C18) başına 2 mikrogram ile 37 santigrat derecede on dakika etiketleyin ve hücre çökeltisi önlemek için beş dakikada hafif ajitasyon ile. Kuluçka sonunda, hücreleri santrifüj ile pelet ve herhangi bir fazla boya kaldırmak için taze serum içermeyen orta 10 mL ile etiketli hücreleri iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, serumsuz ortamın mL başına 6 hücresi ne kadar olan 1 x 10'da hücreleri yeniden askıya alın ve %0.1 büyükbaş hayvan serum albumin konsantrasyonu ile tamamlanır.Hasat lenf düğümleri doku bölümleri üzerine etiketli tümör hücrelerinin proceeding, yavaşça PBS iki kez bölümleri yıkayın, oda sıcaklığında on beş dakika taze PBS yeniden hidrasyon izledi. Kuluçka sonunda, slaytları kurutmak için pamuklu bir bez kullanmadan önce, 37 santigrat derecede otuz dakika boyunca %2,5 büyükbaş serum albumini ile spesifik olmayan herhangi bir bağlamayı engelleyin. Her bölümün etrafında bir bariyer çizmek ve her kuşatılmış lenf düğümü üzerine etiketli hücrelerin 100 mikrolitre eklemek için bir hidrofobik kalem kullanın.Nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede bir ila iki saat sonra, PBS'de dört nazik yıkama ile yapışmayan hücreleri çıkarın ve kalan yapışık floresan hücreleri oda sıcaklığında on beş dakika boyunca PBS'de %3,7 formaldehit ile düzeltin. Yapışkan indeksinin sayısallaştırılması için, parlak ve kırmızı floresan alanlarda her bölümün tek tek TIFF görüntülerini elde etmek için floresan mikroskop üzerindeki 10x hedefini kullanın. Daha sonra, Fiji'deki görüntüleri açmadan önce görüntüleri sistematik olarak adlandırın ve kaydedin.Ölçeği ayarladıktan sonra, sayısallaştırılacak ilgi bölgesini seçmek için çokgen aracını kullanın. Lenf bezi alanını ölçmek için seçin. Veriler milimetre kare cinsinden ifade edilecektir.Ardından, Eklentileri, Analiz et, Hücre Sayacı'nı seçin ve sayısallaştırılmış olmak için fotoğrafı tıklatın. Initialize'i tıklatın ve Sayaç Türünü seçin. Ardından, fotoğraftaki hücrelere tıklayın.Lenf nodu adezyon indeksi lenf nodu kaplı alan başına yapışık tümör hücrelerinin sayısı olarak ifade edilecektir. Bir sonraki fotoğrafı açmak için bir sonraki fotoğrafı açın ve nicelleştirmeyi gösterildiği gibi tekrarlayın. Görüldüğü gibi, yapışık hücrelerin morfolojisi şeklinde yuvarlanır ve hücreler ilgi lenf düğümü boyunca heterojen olarak dağılır.Lenf nodu adezyon indeksi NDRG4 negatif meme kanseri hücre hatlarında iki ila üç kat daha yüksektir, buna karşılık gelen NDRG4 pozitif hücreler için ölçülen ile karşılaştırıldığında. Bu prosedür, beyin veya akciğer gibi diğer metastatik hedef dokularda yapışma oranlarıyardımcı olmak için uyarlanabilir, döllenmiş tümör hücreleri için yapışma ikincil tercihli siteleri değerlendirmek için. Hem taze hem de dondurulmuş dokuların biyolojik olarak tehlikeli olarak düşünülmesi ve uygun biyo-güvenlik önlemleri kullanılarak ele alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Akciğer tümör hücre işe alım tahlil

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tümör Engraftment insan Mantle hücreli lenfoma, Xenograft fare modeli

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya