Name: functional characterization of ring-type e3 ubiquitin ligases in vitro and in planta
Uploaded: 2019-12-05T13:30:00
Duration: 10 min 27 s
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हमारा काम कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल प्रतिस्पर्धी अनुदान (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर, यूएसडीए-एनआईएफए फार्म बिल, नॉर्थवेस्ट आलू से वित्तीय सहायता से संभव बनाया गया था । कंसोर्टियम, और आईएसडीए विशेषता फसल ।

<ol>
	<li>Freemont, P. S., Hanson, I. M., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gysteine-rich+sequence+motif.">A novel gysteine-rich sequence motif.</a> Cell. 64, 483-484 (1991).</li><li>Borden, K. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+fingers+and+B-boxes:+Zinc-binding+protein-protein+interaction+domains.">RING fingers and B-boxes: Zinc-binding protein-protein interaction domains.</a> Biochemistry and Cell Biology. 76, 351-358 (1998).</li><li>Barlow, P. N., Luisi, B., Milner, A., Elliott, M., Everett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+C3HC4+Domain+by+1H-nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy:+A+New+Structural+Class+of+Zinc-finger.">Structure of the C3HC4 Domain by 1H-nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: A New Structural Class of Zinc-finger.</a> Journal of Molecular Biology. 237, 201-211 (1994).</li><li>Borden, K. L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solution+structure+of+the+RING+finger+domain+from+the+acute+promyelocytic+leukaemia+proto-oncoprotein+PML.">The solution structure of the RING finger domain from the acute promyelocytic leukaemia proto-oncoprotein PML.</a> The EMBO Journal. 14, 1532-1541 (1995).</li><li>Lorick, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+fingers+mediate+ubiquitin-conjugating+enzyme+(E2)-dependent+ubiquitination.">RING fingers mediate ubiquitin-conjugating enzyme (E2)-dependent ubiquitination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96, 11364-11369 (1999).</li><li>Jim&#233;nez-L&#243;pez, D., Mu&#241;&#243;z-Belman, F., Gonz&#225;lez-Prieto, J. M., Aguilar-Hern&#225;ndez, V., Guzm&#225;n, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repertoire+of+plant+RING+E3+ubiquitin+ligases+revisited:+New+groups+counting+gene+families+and+single+genes.">Repertoire of plant RING E3 ubiquitin ligases revisited: New groups counting gene families and single genes.</a> PLoS ONE. 13, 1-28 (2018).</li><li>Sacco, M. 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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

रिंग प्रकार E3 सर्वव्यापी लिगैसों के जैव रासायनिक और मशीनी आधार को स्पष्ट करना विकास, तनाव संकेत, और होमोस्टोसिस के रखरखाव में उनके जैविक महत्व के बारे में हमारी समझ में बहुत योगदान दे सकता है। प्रोटोकॉल यहां वर्णित जोड़ों में विट्रो के साथ और planta कार्यात्मक अध्ययन में एक उत्पत्ति दृष्टिकोण । साइट-प्रत्यक्ष म्यूटाजेनेसिस के माध्यम से रिंग डोमेन के संरक्षित अवशेषों में एक अमीनो एसिड प्रतिस्थापन शुरू करके, जिसके परिणामस्वरूप E3-कमी उत्परिवर्ती का परीक्षण कार्यक्षमता के साथ एंजाइमैटिक गतिविधि को जोड़ने के लिए जंगली प्रकार प्रोटीन के समानांतर किया जा सकता है।
रिंग डोमेन, विशेष रूप से इसके संरक्षित Cys और उसके अवशेषों की ठीक से पहचान करना महत्वपूर्ण है। प्रोसाइट जैसे ऑनलाइन टूल का उपयोग10ऐसा करने के लिए किया जा सकता है। E2 एंजाइम की भर्ती के लिए जिम्मेदार रिंग डोमेन को अस्थिर करने के लिए, Cys आम तौर पर सेर के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है, जो इसके निकटतम संरचनात्मक प्रतिस्थापन में जिंक समन्वय के लिए उपयोग किए जाने वाले डिसुल्फिड बांड बनाने की क्षमता की कमी है। लॉरिक एट अल से पता चला है कि उन महत्वपूर्ण Cys अवशेषों में से किसी में उत्परिवर्तन एकल उपइकाई अंगूठी प्रकार E3liगैसों 5की सर्वव्यापकता गतिविधि को समाप्त करेगा । हालांकि कुछ Cys अवशेष ों को रिंग-प्रकार प्रोटीन युक्त बहुइकाई E3 लिगास परिसरों के लिए भी महत्वपूर्ण है, उन सर्वव्यापकता परिसरों की बहुआयामी और गतिशील त्रि-आयामी संरचना और रिंग-प्रकार प्रोटीन की विभिन्न भूमिका के कारण, बहुइकाई E3 लिगास में रिंग डोमेन में संरक्षित अवशेषों के एकल प्रतिस्थापन11
साइट निर्देशित म्यूटाजेनेसिस के लिए, हमने पाया कि छोटे प्लाज्मिड वेक्टर और कम प्रवर्धन चक्रों का उपयोग करने से आमतौर पर म्यूटाजेनेसिस के लिए उच्च दक्षता प्राप्त होती है। Pfu एंजाइम किसी भी अन्य उच्च निष्ठा और उच्च प्रक्रिया डीएनए बहुलक के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, यदि ब्याज के जीन दुर्लभ कोडन शामिल हैं, एक और ई. कोलाई दाग, रोसेटा, recombinant प्रोटीन की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, आईपीटीजी इंडक्शन के लिए ऊष्मायन समय और तापमान दोनों को और अनुकूलित किया जा सकता है। कम तापमान ई. कोलाई डिवीजन दर को कम करते हैं, जो कुछ प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूल हो सकता है । हालांकि आईपीटीजी की उच्च एकाग्रता प्रोटीन अभिव्यक्ति में सुधार कर सकती है, यह ई कोलाई डिवीजन प्रक्रियाओं को भी रोकती है और इसकी सिफारिश नहीं की जाती है।
एकल उपइकाई रिंग प्रकार E3 लिगैसन न केवल एक आणविक पाड़ के रूप में कार्य करती है जो सब्सट्रेट के करीब निकटता में ई 2-यूबी मध्यवर्ती की स्थिति है बल्कि उनके कॉग्नेट E2s की सर्वव्यापी हस्तांतरण गतिविधि को भी प्रोत्साहित करती है। इसके अलावा, यह देखते हुए कि एक E2/E3 संयोजन पॉलीयूबिक्विटिन श्रृंखला की लंबाई और संबंधों के लिए महत्वपूर्ण है जो एक संशोधित सब्सट्रेट के भाग्य को निर्धारित करता है, रिंग-प्रकार ई3एस के किसी भी विचार में उनके एंजाइमैटिक पार्टनर, E2s12शामिल होने चाहिए । जैसा कि चित्रा 3बीमें दिखाया गया है, सभी परीक्षण किए गए ई2एस RHA1B लिगाज़ के साथ संगत नहीं हैं। इसलिए, झूठे नकारात्मक परिणामों से बचने के लिए विभिन्न E2 वर्गों का प्रतिनिधित्व करने वाले कई E2 एंजाइमों के साथ समानांतर में इन विट्रो सर्वव्यापी परख किया जाना चाहिए।
यहां प्रस्तुत इन विट्रो एंजाइमैटिक परख है जो परीक्षण किए गए रिंग-प्रकार प्रोटीन की आत्म-सर्वव्यापीता क्षमता का पता लगाता है। हालांकि, छोटे संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल को आसानी से सब्सट्रेट्स के इन विट्रो सर्वव्यापकता का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए, चरण 2.15 से इन विट्रो सर्वव्यापकता मिश्रण को संभावित E3 लिगाज़ सब्सट्रेट (500 एनजी) के पुनर्संयोजन प्रोटीन के साथ पूरक किया जाना चाहिए। 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे ऊष्मायन के बाद, सर्वव्यापी प्रोटीन विरोधी हा आत्मीयता मैट्रिक्स के 15 μL का उपयोग कर पर कब्जा कर लिया जाना चाहिए (यदि एचए-यूबी का उपयोग किया जाता है, या विरोधी झंडा आत्मीयता मैट्रिक्स अगर ध्वज-Ub प्रयोग किया जाता है) 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए आंदोलन द्वारा । ठंडयू वॉश बफर (20 एमएम ट्रिस पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 0.1 एम एम ईटीए, 0.05% ट्वीन 20, 1x PMSF) के साथ मोती 4x बार धोने के बाद, बफर के सभी लेकिन 40 माइक्रोन को त्यागें और 2.16 कदम पर जाएं। सर्वव्यापकता संकेत, जो क्रमशः एपिटोप-टैग यूबी और सब्सट्रेट के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा पाया गया, सब्सट्रेट प्रोटीन के आणविक वजन से उभर रहा है, सब्सट्रेट/एंजाइम विशिष्टता की पुष्टि करता है ।
इसके अलावा, वीवो में E3 लिगाज सब्सट्रेट्स की पहचान आमतौर पर क्षणिक एंजाइम-सब्सट्रेट इंटरैक्शन और सर्वव्यापी लक्ष्य प्रोटीन के तेजी से क्षरण के कारण कई चुनौतियों से जुड़ी होती है। एक E3 ligase कमी उत्परिवर्ती का उपयोग करना, जो अभी भी अपने लक्ष्य के साथ बातचीत लेकिन अब यह13सर्वव्यापी, प्रोटेसोमल अवरोधक MG132 के अलावा एक बहुत ही उपयोगी विकल्प है, जो हमेशा पर्याप्त रूप से 26S प्रोटेसोम समारोह के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ।
रिंग-टाइप E3 लिगैसों की एक आम विशेषता होमो-और/या विषमता के रूप में बनाने और कार्य करने की प्रवृत्ति है। दिलचस्प बात यह है कि रिंग डोमेन के संरक्षित अवशेषों में प्रतिस्थापन आमतौर पर एक प्रमुख नकारात्मक फेनोटाइप से जुड़ा होता है जहां उत्परिवर्तित रिंग-प्रकार ई3 लिगास देशी जंगली प्रकार प्रोटीन13की एंजाइमैटिक गतिविधि को अवरुद्ध करता है। इस प्रकार, प्लांटा में रिंग म्यूटेंट की अतिअभिव्यक्ति E3 लिगाज जीन को खटखटाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण हो सकता है।

E3 सर्वव्यापी liगैसों के विशाल बहुमत अंगूठी के हैं(आरeally मैंnteresting New Gene)- प्रकार प्रोटीन । रिंग-फिंगर डोमेन को मूल रूप से फ्रीमोंट एट अलद्वारा पहचाना गया था। 1 और कार्यात्मक प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन2मध्यस्थता के रूप में वर्णित है । विहित रिंग फिंगर एक विशेष प्रकार का जिंक समन्वय डोमेन है जिसे आठ संरक्षित सीवाईएस (सी) और उनके (एच) के सर्वसम्मति अनुक्रमके रूप में परिभाषित किया गया है, जो विशेष रूप से अन्य अमीनो एसिड अवशेषों (एक्स), सी-एक्स 2-सी-एक्स9-39-सी-एक्स1-3-एच-एक्स2-सी-एच-एक्स2-सी-एक्स 2-सी-एक्स4-सी-एक्स-सी-सी-सीद्वारा स्थान पर है । दो Zn2 + आयनों सी1/सी2 और सी/एच5/सी6 के साथ अद्वितीय "क्रॉस-ब्रेस" टोपोलॉजी के माध्यम से कोर सी और एच अवशेषों द्वारा स्थिर कर रहे है पहले Zn2 + आयन जबकि सी3/एच4 और सी7/सी8 दूसरे बांध(चित्रा 1ए)3,4। पांचवें Zn2 +-समंवय साइट में सी या एच की उपस्थिति के आधार पर, रिंग-फिंगर प्रोटीन के दो विहित उपवर्गों को परिभाषित किया गया था: C3HC4 और C3H2C3 (रिंग-एचसी और रिंग-एच 2, क्रमशः)। क्योंकि E3 सर्वव्यापी लिगास का रिंग डोमेन E2 conjugating एंजाइमों और सब्सट्रेट्स के बीच बातचीत में मध्यस्थता करता है, इन आवश्यक सी और एच अवशेषों के उत्परिवर्तन को लिगास गतिविधि5को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। रिंग E3 लिगैसों के एक अतिरिक्त पांच कम आम उपवर्गों का वर्णन किया गया है (रिंग-वी, रिंग-सी 2, रिंग-डी, रिंग-एस/टी, और रिंग-जी)6। रिंग-टाइप E3 सर्वव्यापी लिगैसों को सरल और जटिल E3 एंजाइमों में और अधिक विभाजित किया जा सकता है। सरल एकल उपइकाई रिंग E3 लिगैसों में सब्सट्रेट मान्यता साइट और ई 2-बाध्यकारी रिंग डोमेन दोनों होते हैं। इसके विपरीत, मल्टीसबयूनिट रिंग-टाइप ई 3 कॉम्प्लेक्स या तो ई 2-सर्वव्यापक मध्यवर्ती के बाध्यकारी के सब्सट्रेट की भर्ती करता है। रिंग डोमेन लायस अवशेष (एस) जो स्वयं-सर्वव्यापकता के लिए प्राथमिक सर्वव्यापी लगाव साइट (एस) के रूप में कार्य करता है, E3 लिगाज़ गतिविधि के लिए भी महत्वपूर्ण हो सकता है।
सभी रिंग युक्त प्रोटीन E3 लिगैसके रूप में कार्य नहीं करते हैं। इस प्रकार, रिंग-फिंगर डोमेन की बायोइन्फॉर्मेटिक भविष्यवाणी और ई 2-निर्भर प्रोटीन सर्वव्यापकता के लिए क्षमता को जैव रासायनिक रूप से मान्य किया जाना चाहिए और परीक्षण किए गए प्रोटीन की जैविक भूमिका से जोड़ा जाना चाहिए। यहां, हम एक चरण-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस दृष्टिकोण के माध्यम से रिंग-प्रकार ई 3 सर्वव्यापी लिगैसों की एंजाइमैटिक गतिविधि का पता लगाने और कार्यात्मक रूप से विशेषता है। इस पाइपलाइन से प्रतिनिधि परिणाम रिंग-प्रकार E3 लिगाज़ RHA1B के लिए दिखाए जाते हैं। RHA1B पौधे की प्रतिरक्षा को दबाने और पौधे की जड़ कोशिकाओं की आकृति विज्ञान में हेरफेर करने के लिए पौधे परजीवी पुटी नेमाटोड ग्लोबोडेरा पैलिडा द्वारा उत्पादित एक प्रभावक प्रोटीन है। रोगजनक/परजीवी आक्रमण से खुद को बचाने के लिए, पौधों ने न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी डोमेन और ल्यूसिन-रिच रिपीट (एनबी-एलआरआर) प्रकार के प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स विकसित किए हैं जो रोगजनक या परजीवी की उपस्थिति का पता लगाते हैं और परिणामस्वरूप, अतिसंवेदनशील प्रतिक्रिया (एचआर) विकसित करते हैं, जो रोगजनकों के उपनिवेशको रोकने के लिए संक्रमण स्थल पर होने वाली तीव्र और स्थानीयकृत कोशिका मृत्यु का एक रूप है। ऐसा ही एक प्रतिरक्षा रिसेप्टर आलू Gpa2 प्रोटीन है जो जी पैलिडा (क्षेत्र की आबादी D383 और D372)7के कुछ अलग-अलग लोगों के प्रतिरोध प्रदान करता है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हाल ही में पाया गया है कि RHA1B सर्वव्यापकता और क्षरण8के लिए संयंत्र Gpa2 इम्यूनोरिसेप्टर को लक्षित करके ई 3-निर्भर तरीके से पौधे प्रतिरक्षा संकेत के साथ हस्तक्षेप करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E8021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial protease inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol Blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>model: Avanti J-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commassie Blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphokinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA clean &#38; concentrator Kit</td>
			<td>ZYMO RESEARCH</td>
			<td>D4029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH5&#945; competent cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG-Ub</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-Ub</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model: 10153-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model: 1525 Digital Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>model: MaxQ 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10724815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquide nitrogen</td>
			<td>university chemistore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model: 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep plasmid purification kit</td>
			<td>ZYMO RESEARCH</td>
			<td>D4015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-HA antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-MYC antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004609M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>model: 2000 Spectrophotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-5C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>model: C1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant protease inhibitor coctail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMAL-c2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N8076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpolypyrrolidone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1614363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica Sonicators</td>
			<td>model: Q125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional characterization of ring-type e3 ubiquitin ligases in vitro and in planta

सर्वव्यापकता, प्रोटीन के एक पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन के रूप में, यूकेरियोटिक कोशिकाओं के होमोस्टिसिस में एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभाती है। पॉलीयूबिक्विटिन श्रृंखला की लंबाई और टोपोलॉजी के आधार पर 76 अमीनो एसिड सर्वव्यापकता के सहसंयोजक लगाव के परिणामस्वरूप प्रोटीन क्षरण से लेकर स्थानीयकरण में परिवर्तन और/या संशोधित प्रोटीन की गतिविधि तक विभिन्न परिणाम हो सकते हैं। तीन एंजाइम क्रमिक रूप से सर्वव्यापी प्रक्रिया को उत्प्रेरक करते हैं: E1 सर्वव्यापी-सक्रिय एंजाइम, E2 सर्वव्यापी-conjugating एंजाइम, और E3 सर्वव्यापक लिगासे। E3 सर्वव्यापी लिगासे सब्सट्रेट विशिष्टता निर्धारित करता है और इसलिए, एक बहुत ही दिलचस्प अध्ययन विषय का प्रतिनिधित्व करता है। यहां हम रिंग-टाइप ई3 सर्वव्यापक लिगास के एंजाइमैटिक गतिविधि और कार्य के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। यह चार चरण प्रोटोकॉल 1 का वर्णन करता है) संरक्षित रिंग डोमेन पर लक्षित साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस के माध्यम से ई 3 लिगास की कमी उत्परिवर्ती कैसे उत्पन्न करें; 2-3) विट्रो और प्लांटा दोनों में सर्वव्यापी गतिविधि की जांच कैसे करें; 4) उन जैव रासायनिक विश्लेषण को परीक्षण प्रोटीन के जैविक महत्व से कैसे जोड़ें। एक E3 लिगाज-कमी उत्परिवर्ती की पीढ़ी जो अभी भी अपने सब्सट्रेट के साथ बातचीत करती है लेकिन अब इसे गिरावट के लिए सर्वव्यापी नहीं करती है, वीवो में एंजाइम-सब्सट्रेट इंटरैक्शन के परीक्षण की सुविधा प्रदान करती है। इसके अलावा, संरक्षित रिंग डोमेन में उत्परिवर्तन अक्सर एक प्रमुख नकारात्मक फेनोटाइप प्रदान करता है जिसका उपयोग आरएनए-हस्तक्षेप दृष्टिकोण के वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में कार्यात्मक नॉकआउट अध्ययनमें किया जा सकता है। हमारे तरीकों को पौधे परजीवी सूत्रकृमि प्रभावक RHA1B की जैविक भूमिका की जांच करने के लिए अनुकूलित किया गया था, जो परजीवीवाद को बढ़ावा देने के लिए पौधे की कोशिकाओं में मेजबान सर्वव्यापकता प्रणाली का अपहरण करता है। वीवो अभिव्यक्ति प्रणाली में मामूली संशोधन के साथ, इस प्रोटोकॉल को इसके मूल की परवाह किए बिना किसी भी रिंग-प्रकार E3 लिगाज़ के विश्लेषण पर लागू किया जा सकता है।

इस खंड में, एक उपइकाई E3 सर्वव्यापी लिगासे RHA1B की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल के लिए प्रतिनिधि परिणाम प्रदान किए जाते हैं जिसमें प्रोसाइट-भविष्यवाणी रिंग-एच 2 प्रकार डोमेन (132-176 अमीनो एसिड)10है। जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है, E3-कमी वाले उत्परिवर्ती प्रोटीन प्राप्त करने के लिए, रिंग डोमेन में आठ संरक्षित सीएस या एचएस में से कम से कम एक(चित्रा 1ए)को उत्परिवर्तनित करने की आवश्यकता है(चित्रा 1बी)। इस प्रकार, पहले चरण के रूप में, RHA1B के दो उत्परिवर्ती संस्करण, RHA1BC135S (रिंग डोमेन के संरक्षित सी3 में सेर द्वारा सीवाईएस का प्रतिस्थापन) और RHA1BK146R (RHA1B में मौजूद एकमात्र Lys में एआरजी द्वारा Lys का प्रतिस्थापन) उत्पन्न किया गया था। हालांकि एकल उपइकाई E3 liगैस मध्यस्थता सर्वव्यापी से सर्वव्यापकता हस्तांतरण E2 बंदरगाह के बजाय सीधे सर्वव्यापी के साथ बातचीत, Lys में E3 के आत्म सर्वव्यापीअपनी अधिकतम एंजाइमैटिक गतिविधि के लिए आवश्यक हो सकता है ।
चित्रा 2ए में पश्चिमी दाग परिणाम एक ठेठ सकारात्मक इन विट्रो सर्वव्यापकता परख परिणाम दिखाते हैं, जिसमें एक बहुबंधन धब्बा परीक्षण प्रोटीन (जैसे, एमपीबी-फ्यूज्ड आरएचए1बी ~ 100 केडीए) के आणविक वजन से शुरू होता है और ऊपर की ओर बढ़ रहा है। एंटी-हा एंटीबॉडी ने एचए-टैग यूबी को विभिन्न लंबाई की पॉली-सर्वव्यापकता श्रृंखला में शामिल किया, जिससे यह विशिष्ट सर्वव्यापी-संबंधित सीढ़ी जैसी धब्बा बन गई। सकारात्मक परिणामों को मान्य करने के लिए, चित्रा 2ए व्यक्तिगत घटकों (E1, E2, Ub, या MBP-RHA1B) लापता सभी महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण ों को भी प्रस्तुत करता है या नियंत्रण के रूप में एमबीपी का उपयोग कर रहा है और गंदा सर्वव्यापकता संकेत की कमी है। इसके अलावा, पीवीडीएफ झिल्ली के कूमासी नीले धुंधला सभी नियंत्रणों में बीपी-RHA1B या एमबीपी के बराबर लोडिंग दिखाया ।
चित्रा 2बी से पता चलता है कि कैसे इन विट्रो सर्वव्यापकता परिणाम विशिष्ट E2/E3 संयोजन के आधार पर विविध । इस उदाहरण में, 10 विभिन्न E2 परिवारों का प्रतिनिधित्व करने वाले 11 विभिन्न E2s का परीक्षण किया गया था। पता चला सर्वव्यापकता गतिविधि कोई संकेत (कोई धब्बा) से लेकर एक बहुबैंडिंग धब्बा के लिए विभिन्न आणविक वजन पर शुरू, विभिन्न सर्वव्यापकता पैटर्न का संकेत है ।
चित्रा 3 अंगूठी के लिए सर्वव्यापकता परख परिणामों से पता चलता है-और कश्मीर परीक्षण प्रोटीन के उत्परिवर्ती संस्करणों । RHA1BC135S के लिए एंजाइमैटिक गतिविधि की कमी या तो विट्रो में एक बहुबैंडिंग धब्बा उत्पन्न करने में असमर्थता द्वारा समर्थित है(चित्रा 3ए)या प्लांटा में पॉली-सर्वव्यापकता संकेत को बढ़ावा देने(चित्रा 3बी)। यह उल्लेखनीय है कि अपने दम पर प्लांटा में एचए-टैग यूबी की अतिअभिव्यक्ति ने जंगली प्रकार RHA1B की एंजाइमैटिक गतिविधि द्वारा प्रदत्त मजबूत सर्वव्यापी संकेत के विपरीत, वेक्टर नियंत्रण सहित सभी परीक्षण किए गए नमूनों में बेसल स्तर का सर्वव्यापीकरण दिया। इसके अलावा, RHA1BK146R उत्परिवर्ती पर विश्लेषण से पता चलता है कि RHA1B की E3 गतिविधि के लिए K146 अवशेष भी आवश्यक है। यद्यपि विट्रो(चित्रा 3ए)में एक सीमांत आत्म-सर्वव्यापी संकेत का पता चला था, लेकिन प्लांटा परख में निर्धारित उत्परिवर्ती E3-कमी है(चित्रा 3बी,केवल पृष्ठभूमि सर्वव्यापकता संकेत का पता चला)।
E3-कमी उत्परिवर्ती उत्पन्न करने और जैव रासायनिक रूप से मान्य करने के बाद, कार्यात्मक अध्ययनों को परीक्षण रिंग E3 सर्वव्यापक लिगास की E3-संबद्ध जैविक भूमिका निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। RHA1B के मामले में, यह सूत्रकृमि प्रभावक पौधे प्रतिरक्षा सिग्नलिंग को दबा देता है, जैसा कि GPa2-ट्रिगर एचआर सेल मौत के दमन से प्रकट होता है। जैसा कि जंगली प्रकार RHA1B के विपरीत चित्रा 4एमें प्रस्तुत किया गया है, RHA1BC135S उत्परिवर्ती E3 लिगाज़ गतिविधि की कमी एचआर सेल मौत में हस्तक्षेप नहीं करती थी। यह देखते हुए कि प्रोटीन सर्वव्यापकता का सबसे आम परिणाम इसकी प्रोटेसोम-मध्यस्थता क्षरण है, रिंग डोमेन में रहने वाले म्यूटेशन का उपयोग उनके प्रत्यक्ष और/या अप्रत्यक्ष सब्सट्रेट्स के क्षरण को ट्रिगर करने के लिए E3-निर्भर क्षमता को सत्यापित करने के लिए भी किया जा सकता है । इस प्रकार, महत्वपूर्ण रूप से, चित्रा 4बी में पश्चिमी दाग परिणाम इस बात की पुष्टि करते हैं कि GPa2 जंगली प्रकार RHA1B की उपस्थिति में जमा नहीं हुआ लेकिन RHA1BC135S का GPa2 प्रोटीन स्थिरता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig01.jpg"> चित्रा 1: सिद्धांत और साइट निर्देशित म्यूटाजेनेसिस में शामिल कदमों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (A)संरक्षित Cys और उसके अमीनो एसिड के साथ रिंग-CH/H2 डोमेन पर प्रकाश डाला । (ख)म्यूटाजेनिक प्राइमर डिजाइन का एक उदाहरण। (ग)साइट निर्देशित म्यूटाजेनेसिस के कदम। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig02.jpg"> चित्रा 2: विनी इन विट्रो सर्वव्यापकता परख में प्रतिनिधि । (A)शीर्ष जेल सभी नकारात्मक नियंत्रणसहित सर्वव्यापी परख दिखाता है, और नीचे जेल समान लोडिंग दिखाता है। (ख)ई 2 एंजाइमों के आधार पर अपेक्षित परिणामों की सीमा। इस आंकड़े को कुड एट एएल8से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig03.jpg"> चित्रा 3: रिंग और कश्मीर-म्यूटेंट (RHA1BC135S और RHA1BK146R)के लिए सर्वव्यापी परख परिणाम। (A) इन विट्रो सर्वव्यापकता के परिणाम RHA1BC135S और RHA1BK146Rके लिए परिणाम । (ख)प्लांटा सर्वव्यापकता परख में RHA1BC135S और RHA1BK146Rके लिए परिणाम । इस आंकड़े को कुड एट एएल8से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig04.jpg"> चित्रा 4: E3 निर्भर जैविक कार्यों के लिए प्रतिनिधि कार्यात्मक अध्ययन। E3-निर्भर जैविक कार्य को दिखाने वाले कार्यात्मक अध्ययनों का एक उदाहरण। (A)E3-निर्भर एचआर सेल डेथ दमन और(ख)एक संयंत्र इम्यूनोरिसेप्टर GPa2 का क्षरण । इस आंकड़े को कुड एट एएल8से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">पीसीआर की स्थापना</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 μL</td>
			<td>प्लाज्मिड (~ 100 एनजी)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.5 माइक्रोन</td>
			<td>एफ म्यूटाजेनिक प्राइमर (10 माइक्रोन)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.5 माइक्रोन</td>
			<td>आर म्यूटाजेनिक प्राइमर (10 माइक्रोन)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 μL</td>
			<td>डीएनटीपी (10 एमएम)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 माइक्रोन</td>
			<td>बफर (10x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 μL</td>
			<td>अल्ट्रा Pfu बहुलक (२.५ U/μl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>39 माइक्रोन</td>
			<td>डीडीएच2ओ</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 माइक्रोन</td>
			<td>कुल मात्रा</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: पीसीआर प्रतिक्रिया स्थापित
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">थर्मोसाइकिलर कार्यक्रम</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>95 डिग्री सेल्सियस</td>
			<td>30 एस</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>95 डिग्री सेल्सियस</td>
			<td>30 एस</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>60 डिग्री सेल्सियस</td>
			<td>30 एस</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>72 डिग्री सेल्सियस</td>
			<td>5 मिन</td>
			<td>दोहराएं 2-4 30 बार</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>72 डिग्री सेल्सियस</td>
			<td>5 मिन</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 2: पीसीआर थर्मोसाइकिलर कार्यक्रम
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">RHA1B उदाहरण के लिए स्थापित लिगेशन रिएक्शन</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.5 माइक्रोन</td>
			<td colspan="2">PMAL-c2:: एमएमबी ने बाम्बी और साली (60 एनजी) के साथ पाचन द्वारा वैक्टर को लाइनर किया</td>
		</tr>
<tr>
<td>7 माइक्रोन</td>
			<td colspan="2">RHA1B/RHA1BC135S या RHA1BK146R BamHI और Sali (25 एनजी) के साथ पचा डालने</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 μL</td>
			<td colspan="2">T4 लिगाज़ बफर (10x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 माइक्रोन</td>
			<td colspan="2">T4 लिगास (400 U/μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 माइक्रोन</td>
			<td colspan="2">कुल मात्रा</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 3: RHA1B उदाहरण के लिए स्थापित लिगेशन रिएक्शन।

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Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

इस पांडुलिपि का लक्ष्य रिंग-प्रकार ई 3 सर्वव्यापक लिगैसों के व्यापक जैव रासायनिक और कार्यात्मक अध्ययनों के लिए एक रूपरेखा पेश करना है। विस्तृत प्रोटोकॉल के साथ यह मल्टीस्टेप पाइपलाइन, परीक्षण किए गए प्रोटीन की एक एंजाइमैटिक गतिविधि को मान्य करती है और यह दर्शाती है कि गतिविधि को कार्य करने के लिए कैसे लिंक किया जाए।

रिंग-टाइप E3 सर्वव्यापी लिगैसइन विट्रो और प्लांटा में कार्यात्मक लक्षण वर्णन

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

इस कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल से पता चलता है कि साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस दृष्टिकोण के माध्यम से रिंग-प्रकार E3 सर्वव्यापी लि गैसों की एंजाइमेटिक गतिविधि का पता कैसे लगाया जाए और इसके लिए, दोनों विट्रो और प्लांटा में। साइट निर्देशित म्यूटेनेसिस के माध्यम से रिंग डोमेन में उत्परिवर्तन शुरू करके, जिसके परिणामस्वरूप E3-कमी उत्परिवर्ती को कार्यक्षमता के साथ एंजाइमेटिक गतिविधि को जोड़ने के लिए जंगली प्रकार के प्रोटीन के समानांतर परीक्षण किया जा सकता है। रिंग-प्रकार ई 3 सर्वव्यापी लि गैसों के जैव रासायनिक और यांत्रिक आधार को स्पष्ट करना विकास, तनाव संकेत और होमोसेस्टेसिस के रखरखाव में उनके जैविक महत्व के बारे में हमारी समझ में बहुत योगदान दे सकता है।वीवो अभिव्यक्ति प्रणाली में मामूली संशोधन के साथ, इस प्रोटोकॉल को किसी भी रिंग-प्रकार के E3 ligase के विश्लेषण पर लागू किया जा सकता है, भले ही इसकी उत्पत्ति की परवाह किए बिना। रिंग डोमेन में संरक्षित सीवाईएस और उसके अमीनो एसिड की पहचान करके शुरू करें और म्यूटेशन साइट के दोनों ओर 15 आधार जोड़े द्वारा ब्याज के प्रतिस्थापन कोडन ले जाने वाले प्राइमर डिजाइन करें। रिंग डोमेन, विशेष रूप से इसके संरक्षित सिस्टीन और हिस्टीडीन अवशेषों की ठीक से पहचान करना महत्वपूर्ण है।ऐसा करने के लिए प्रोसाइट जैसे ऑनलाइन टूल का उपयोग किया जा सकता है। पीसीआर प्रवर्धन में म्यूटाजेनिक प्राइमर का उपयोग ब्याज के जीन को शरण देने वाले प्लाज्मिड में वांछित उत्परिवर्तन पेश करने के लिए, जिससे पीफू जैसे उच्च निष्ठा वाले डीएनए पॉलीमरेज का उपयोग करना सुनिश्चित हो सके। पीसीआर के बाद, डीपीएनएल प्रतिबंध एंजाइम के तीन माइक्रोलीटर को सीधे पीसीआर रिएक्शन में जोड़कर ई.कोलाई-व्युत्पन्न माता-पिता मिथाइलेटेड और अर्ध-मिथाइलेटेड डीएनए को पचा लें और इसे दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करें।एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट के साथ म्यूटेजेनाइज्ड प्लाज्मिड को शुद्ध करें, और डीएनए को पानी के 50 माइक्रोलीटर में एल्यूट करें। फिर, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार बरामद म्यूटेजेनाइज्ड प्लाज्मिड डीएनए के 0.5 माइक्रोलीटर के साथ डीएच5-अल्फा ई.कोलाई रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं को बदलें। MBP epitope टैग के साथ इन जीन फ्यूज करने के लिए PMAL-c2 वेक्टर में ब्याज की जंगली प्रकार की अंगूठी और उत्परिवर्तित अंगूठी जीन क्लोन ।फिर, पांडुलिपि में वर्णित 30 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में इन विट्रो सर्वव्यापकता प्रतिक्रिया स्थापित करें, और मिश्रण को दो घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 5x SDS-पेज लोडिंग बफर के 7.5 माइक्रोलीटर के साथ नमूना मिश्रण और पांच मिनट के लिए उबलते द्वारा प्रतिक्रिया समाप्त, तो 7.5% एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेलफोरेसिस के साथ प्रोटीन अलग। पीवीडीएफ झिल्ली पर स्थानांतरण करें, और पश्चिमी ब्लॉटिंग और एंटी-फ्लैग के साथ सर्वव्यापी का पता लगाएं।परीक्षण MBP-रिंग-प्रकार प्रोटीन के समान लोडिंग को सत्यापित करने के लिए कूमासी नीले रंग के साथ झिल्ली को दाग दें। लकीर एग्रोबैक्टीरियम tumefaciens उचित चयन एंटीबायोटिक दवाओं युक्त पौंड माध्यम पर ब्याज की epitope टैग जीन ले उपभेदों । 28 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि के दो दिनों के बाद, एकल कालोनियों उठाओ, और उंहें एलबी तरल माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 28 डिग्री सेल्सियस और २५० आरपीएम में एक और 24 घंटे के लिए हो जाना ।एंटीबायोटिक दवाओं के साथ ताजा पौंड के तीन मिलीलीटर के लिए कृषि जीवाणु संस्कृति के १०० माइक्रोलीटर हस्तांतरण, और एक अतिरिक्त चार से छह घंटे के लिए संस्कृति इनक्यूबेट । कोशिकाओं को छह मिनट के लिए 1, 800 बार जी पर स्पिन करें, सुपरनैट को त्यागें, और तीन मिलीलीटर वॉश बफर के साथ कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। धोने को दो बार दोहराएं, फिर कोशिकाओं को इंडक्शन बफर में फिर से खर्च करें, और उन्हें 28 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 10 से 12 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को छह मिनट के लिए 1, 800 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें, और सुपरनेट को त्याग दें। घुसपैठ बफर के दो मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और OD600 मूल्य का उपयोग कर बैक्टीरिया की एकाग्रता निर्धारित करें। एग्रोइनफिल्ट चार सप्ताह पुरानी निकोटियाना बेंथामियाना धीरे-धीरे उन्हें सुई से चुभने से छोड़ देती है, और सिरिंज के साथ एग्रोबैक्टीरियम को हाथ से इंजेक्ट करती है, फिर एक मार्कर के साथ घुसपैठ वाले क्षेत्र को सर्कल करती है।36 घंटे के बाद, घुसपैठ की पत्ती के ऊतकों को इकट्ठा करें, और इसे तरल नाइट्रोजन के साथ एक महीन पाउडर में पीस लें। प्रोटीन निष्कर्षण बफर के 300 माइक्रोलीटर के साथ ऊतक पाउडर को फिर से खर्च करें, और इसे चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15, 000 बार ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें, 5x एसडीएस-पेज लोडिंग बफर को 1x की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें, और नमूना को पांच मिनट के लिए उबालें।फिर, प्लांटा सर्वव्यापकता में पता लगाने के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण करें। लकीर उपयुक्त एग्रोबैक्टीरियम tumefaciens ब्याज या खाली वेक्टर के टैग जीन ले उपभेदों, और निकोटियाना बेंथामियाना पत्तियों पर एग्रोबैक्टीरियम सुई, जैसा कि पहले वर्णित है । E3-निर्भर सब्सट्रेट प्रोटीन क्षरण के लिए, पहले वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें, और पौधों की कोशिकाओं में प्रोटीन संचय का पता लगाने के लिए उचित एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी ब्लॉटिंग करें।E3-निर्भर अतिसंवेदनशील प्रतिक्रिया-मध्यस्थता सेल मृत्यु निषेध के लिए, घुसपैठ के दो से चार दिन बाद सेल मौत के लक्षणों के लिए एग्रोइंफिलट्रेटेड पत्तियों की निगरानी करें। एक विशिष्ट इन विट्रो सर्वव्यापकता परख परिणाम में परीक्षण किए गए प्रोटीन के आणविक वजन से शुरू होने वाला एक बहुबैंड धब्बा होता है और ऊपर की ओर प्रगति होती है। जैसा कि अपेक्षित था, नकारात्मक नियंत्रण व्यक्तिगत घटकों को गायब करते हैं या एमबीपी का उपयोग करते हुए गंदा संकेत प्रदर्शित नहीं करते थे।इसके अलावा, पीवीडीएफ झिल्ली के कूमासी ब्लू स्टेनिंग ने सभी नियंत्रणों में एमबीपी-आरएचए 1बी या एमबीपी की समान लोडिंग दिखाई। 11 अलग-अलग ई 2एस का परीक्षण यह जांचने के लिए किया गया था कि विशिष्ट E2 से E3 संयोजन के आधार पर इन विट्रो सर्वव्यापकता कैसे भिन्न होती है। पता चला सर्वव्यापकता गतिविधि कोई संकेत से लेकर एक बहुबैंड धब्बा के लिए अलग आणविक वजन पर शुरू, अलग सर्वव्यापकता पैटर्न का संकेत है ।RHA1B के रिंग और कश्मीर-उत्परिवर्ती संस्करणों को विट्रो और प्लांटा में सर्वव्यापीता के लिए परीक्षण किया गया था। रिंग-उत्परिवर्ती संस्करण की एंजाइमेटिक गतिविधि की कमी को या तो विट्रो में एक बहुबैंड धब्बा उत्पन्न करने या प्लांटा में पॉली-सर्वव्यापकता संकेत को बढ़ावा देने में असमर्थता का समर्थन किया जाता है। यद्यपि कश्मीर उत्परिवर्ती के लिए विट्रो में एक सीमांत आत्म-सर्वव्यापकता संकेत का पता चला था, लेकिन प्लांटा में केवल पृष्ठभूमि सर्वव्यापीता का पता चला, जिसमें यह सुझाव दिया गया था कि E3 गतिविधि के लिए K146 अवशेष भी आवश्यक हैं।जंगली प्रकार RHA1B के विपरीत, अंगूठी उत्परिवर्ती E3 ligase गतिविधि की कमी अतिसंवेदनशील प्रतिक्रिया सेल मौत के साथ हस्तक्षेप नहीं किया । पश्चिमी ब्लॉटिंग ने पुष्टि की कि Gpa2 जंगली प्रकार RHA1B की उपस्थिति में जमा नहीं हुआ, लेकिन रिंग म्यूटेंट का प्रोटीन स्थिरता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। यह देखते हुए कि सर्वव्यापी प्रतिक्रिया के लिए एक उचित E2-E3 संयोजन आवश्यक है, इन विट्रो सर्वव्यापकता परख झूठे नकारात्मक परिणामों से बचने के लिए विभिन्न E2 वर्गों का प्रतिनिधित्व करने वाले कई E2 एंजाइमों के समानांतर किया जाना चाहिए।एक E3 ligase कमी उत्परिवर्ती वीवो में एंजाइम-सब्सट्रेट इंटरैक्शन के परीक्षण की सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, यह उत्परिवर्ती अक्सर एक प्रमुख नकारात्मक फेनोटाइप प्रदान करता है जिसका उपयोग आरएनएआई के वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में कार्यात्मक नॉकआउट अध्ययन में किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, यह हाल ही में पाया गया है कि RHA1B सूत्रकीय प्रभावक सर्वव्यापी और गिरावट के लिए संयंत्र Gpa2 इम्यूनोरिसेप्टर को लक्षित करके E3-निर्भर तरीके से संयंत्र प्रतिरक्षा संकेत में हस्तक्षेप करता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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चूहा अग्नाशय के ऊतकों की तेजी से और लागत प्रभावी आरएनए निष्कर्षण

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

बेकर के खमीर सैचरोमाइसेस सेरेविसिया में माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम अभिव्यक्ति उत्पादों की लेबलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...