Name: functional characterization of ring-type e3 ubiquitin ligases in vitro and in planta
Uploaded: 2019-12-05T13:30:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta at JoVE.com

Vårt arbeid ble gjort mulig av finansiell støtte fra landbruk og mat Research Initiative konkurransedyktig stipend (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) av USDA National Institute of Food and Agriculture, USDA-NIFA Farm Bill, Northwest Potato Consortium, og ISDA spesialist crop.

1. Site-regissert mutagenese (figur 1)
<ol><li>Identifiser bevart cys og hans aminosyrer i RINGEN domenet (figur 1A) og design primere bærer substitusjon Codon av interesse flankert av 15 base par på hver side av mutasjon stedet (figur 1B).</li>
	<li>Innføre ønsket mutasjon av PCR-basert forsterkning av plasmider harboring genet av interesse ved hjelp av mutagent primere og High-Fidelity DNA polymerase inneholder PFU i 50 μL av total PCR reaksjons volum som vist i tabell 1 og tabell 2 i henhold til produsentens protokoll.</li>
	<li>Fordøye Escherichia coli-avledet foreldrenes denaturert og semi-denaturert DNA ved å tilsette 3 ΜL av DpnI BEGRENSNINGS enzym direkte til PCR-reaksjonen (trinn 1,2) og incubating ved 37 ° c for 2 t. Merk: metylering er en posttranscriptional protein modifikasjon som er lagt til plasmider produsert og isolert fra bakterier. Nye kopier av PCR-genererte plasmider mangler metylering, derfor vil de nye kopiene forbli intakte under behandling med DpnI .</li>
	<li>Rens mutagenized plasmider ved hjelp av et kommersielt DNA-avsugs sett basert på roterende søyle teknologi og eluere DNA med 50 μL vann.</li>
	<li>Transformer DH5α E. coli kjemisk kompetente celler med 0,5 μL av det gjenopprettede MUTAGENIZED plasmider DNA i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk, ruge kompetente celler med DNA på isen i 30 min, deretter varme-sjokk dem for 20 s ved 42 ° c, og plasser rørene igjen på isen i 2 min. ruge celler med 500 μL LB Media ved 37 ° c i 1 time ved 250 RPM og deretter spre dem på selektiv Pates.</li>
	<li>Bekreft ønsket mutasjon av sanger sekvensering DNA plasmider isolert fra E. coli.</li>
</ol>2. rekombinant protein rensing og in vitro ubiqitinering analysen
<ol><li>Klon den ville typen RING og mutert RING gener av interesse i pMAL-C2 vektor (følg produsentens protokoll; Tabell 3) å fusjonere disse genene med MBP epitope koden som tillater ett-trinns rensing ved hjelp av amylose harpiks. Presenter de resulterende konstruksjoner i E. coli BL21-belastningen som beskrevet i trinn 1,5.</li>
	<li>Grow E. coli stamme BL21 harboring ønsket konstruere i 50 ml lb flytende medium ved 37 ° c for 2 – 3 t til den når logaritmisk fase (OD600 på 0,4 – 0,6).</li>
	<li>Legg IPTH til en endelig konsentrasjon på 0,1 – 1 mM for å indusere uttrykket av MBP-Tagged rekombinant protein av interesse og ruge E. coli -kulturen for 2 – 3 timer ved 28 ° c. Plasser kulturen på isen etter inkubasjons. Merk: Utfør trinn 2.4 – 2.13 på is for å beskytte proteiner mot nedbrytning.</li>
	<li>For å kontrollere induksjon effektivitet, samle 1,5 mL indusert celler, snurre dem ned ved 13 000 x g i 2 min, fjerne supernatanten, og resuspend cellene i 20 μL av 2x SDS-side lasting buffer (24 mm Tris-HCl pH 6,8, 0,8% SDS, 10% (v/v) glyserol, 4 mm DTT, 0,04% (w/v) bromophenol blå).</li>
	<li>Kok prøvene i 5 min og kjøre dem på en 10% SDS-side gel. For å visuelt evaluere akkumulering av MBP-Fusion protein (molekylvekt av protein av interesse + 42,5 kDa MBP), beis gelen i 20 min ved agitating med Coomassie farge buffer (50% metanol, 10% eddiksyre, 0,1% Coomassie blå) og destaining over natten med destaining buffer (20% metanol, 10% eddiksyre).</li>
	<li>Harvest de resterende E. coli celler ved sentrifugering på 1 350 x g for 6 min, forkaste supernatanten, og resuspend cellen pellet med 5 ml kolonne buffer (20 mM Tris HCL, 200 mM NACL, 1 mm EDTA, bakteriell protease inhibitor). Merk: Dette er et godt sted å stoppe protokollen over natten. De frosne cellene kan oppbevares opp til 1 uke ved-20 ° c.</li>
	<li>Bryte ned E. coli celler ved å plassere røret som inneholder bakterier i et isvannbad og bruke 10 sonikering sykluser: 10 s sonikering på 30% amp etterfulgt av 20 s pauser.</li>
	<li>Sentrifuger prøve på 13 000 x g ved 4 ° c i 10 min og lagre supernatanten (rå ekstrakt).</li>
	<li>Klargjør 500 μL av amylose harpiks i et 15 mL rør. Vask harpiks ved å tilsette 10 mL kald søyle buffer og sentrifugering ved 1 800 x g, 4 ° c i 5 min. Gjør dette 2x.</li>
	<li>Tilsett 5 mL råolje ekstrakt til røret med amylose harpiks og ruge over natten ved 4 ° c.</li>
	<li>Sentrifuger ved 1 800 x g ved 4 ° c i 5 min og kast supernatanten.</li>
	<li>Tilsett 10 mL Kol onne buffer til harpiks pellet og ruge i 20 min. Deretter sentrifuge ved 1 800 x g ved 4 ° c i 5 min. Gjenta dette trinnet 2x.</li>
	<li>Eluere Fusion-proteinet med 0,5 mL søyle buffer som inneholder 10 mM maltose ved å incubating en prøve for 2 t ved 4 ° c. Sentrifuger ved 1 800 x g ved 4 ° c i 5 min og samle det eluert proteinet. Gjenta dette trinnet 2x.</li>
	<li>Dialyze 1 mL av proteinet brøkdel mot den kalde PBS. Alikvot protein inn i en gangs rør (10 – 20 μL) for å unngå frost-tine og oppbevar ved-80 ° c til det er nødvendig.</li>
	<li>Mål protein konsentrasjonen ved hjelp av Bradford analysen9.</li>
	<li>Sett opp in vitro ubiqitinering reaksjon i et total volum på 30 μL ved å blande opp 40 ng av E1 (f. eks, AtUBA1), 100 ng av E2 (f. eks, AtUBC8, SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/32), 1 μg MBP RING protein, og 2 mikrogram flagg-UB (eller HA-UB) i ubiqitinering buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 30 mm kreatin fosfat, 50 μg/ml kreatin phosphokinase). Ruge blandingen ved 30 ° c for 2 timer. Merk: Premake 20x ubiqitinering buffer og oppbevar den opp til 6 måneder ved-20 ° c i små alikvoter for engangsbruk. Den kreatin phosphokinase mister lett sin enzymatisk aktivitet når bufferen er Tint og frosset gjentatte ganger.</li>
	<li>Avslutt reaksjonen ved å blande de 30 μL prøvene med 7,5 μL av 5x SDS-side lastings buffer (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 25% (v/v) glyserol, 10 mM DTT, 0,1% (w/v) bromophenol blå) og kokende i 5 min.</li>
	<li>Skill proteinene med 7,5% SDS-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE), deretter overføre til PDVF membranen, og oppdage ubiqitinering av vestlig blotting ved hjelp av anti-FLAG (eller anti-HA).</li>
	<li>Stain PVDF membranen med Coomassie blå for å verifisere lik lasting av testet MBP-RING-type protein.</li>
</ol>3. Agrobacterium-mediert forbigående protein uttrykk i Nicotiana benthamiana blader og i planta ubiqitinering analysen
<ol><li>Stripe hensiktsmessig Agrobacterium tumefaciens stammer bærer epitope-merket genet av interesse (f. eks ha-RHA1B, ha-RHA1BC135S, ha-RHA1BK146R, ha-UB) og tom vektor som en kontroll på lb medium som inneholder riktig utvalg antibiotika.</li>
	<li>Etter 2 dager med vekst ved 28 ° c, plukke opp enkelt kolonier og dyrke dem i LB flytende medium med riktig antibiotika ved 28 ° c/250 RPM for en annen 24 h.</li>
	<li>Overføring 100 μL av agrobacterial kultur til 3 mL fersk LB med riktig antibiotika og ruge kulturen for ytterligere 4 – 6 timer ved 28 ° c med rotasjon (250 RPM) til sen eksponentiell vekstfase.</li>
	<li>Snurr ned agrobacterial celler ved 1 800 x g i 6 min, kast supernatanten og resuspend celler med 3 ml vaskebuffer (50 mm MES pH 5,6, 28 mm glukose, 2 mm NaH2PO4). Gjenta dette trinnet 2x.</li>
	<li>Etter den andre vasken, resuspend cellene i induksjon buffer (50 mM MES pH 5,6, 28 mM glukose, 2 mM NaH2PO4, 200 ΜM ACETOSYRINGONE, 37 mm NH4CL, 5 mm MgSO4. 7H2o, 4 mm KCl, 18 ΜM FeSO4. 7H2o, 2 mm CaCl2). Ruge cellene med induksjon buffer for ytterligere 10 – 12 h ved 28 ° c. Merk: Acetosyringone induserer overføring av T-DNA.</li>
	<li>Sentrifuger cellene ved 1 800 x g i 6 min, kast supernatanten og resuspend cellene med 2 ml infiltrasjon buffer (10 mm MES pH 5,5, 200 μM acetosyringone). Merk: Hvis Agrobacteria aggregat etter inkubasjons med induksjon buffer, la aggregerte celler synke til bunnen av røret ved å la den på benken i noen minutter, og overføre klare Agrobacterium suspensjon til et nytt rør før du fortsetter med trinn 3,6.</li>
	<li>Mål konsentrasjonen av bakterier ved hjelp av OD600 verdi (den optiske tettheten ved absorbansen av 600 NM). Juster OD600 til de ønskede verdiene. Merk: vanligvis en OD600 verdi mellom 0,2-0,4 fungerer best for en enkelt agrobacterial flekken uttrykk. Hvis en kombinasjon av forskjellige agrobacterial stammer påføres, bør den totale OD600 verdier av agrobacterial stammer ikke overstige 1.</li>
	<li>Agroinfiltrate 4-ukers-gamle N. bethamiana blader ved forsiktig pricking dem med en nål, etterfulgt av hånd-sprøytebruk Agrobacterium med en sprøyte uten nålen. Circle det infiltrere blad området med markøren (vanligvis 1-2 cm i diameter).</li>
	<li>Samle infiltrere Leaf vev 36 h post-infiltrasjon. Grind vevet til et fint pulver med flytende nitrogen.</li>
	<li>Resuspendert vevs pulver med 300 μL av protein utvinnings buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glyserol, 1% polyvinylpolypyrrolidone, 1 mM PMSF, plante protease inhibitor cocktail) og sentrifuge ved 15 000 x g i 15 min ved 4 ° c.</li>
	<li>Overfør supernatanten til et nytt rør. Legg 5x SDS-side lasting buffer til en endelig konsentrasjon av 1x og kok i 5 min.</li>
	<li>Skill råolje proteiner på 10% SDS-PAGE gels, Overfør til PVDF membraner, og sonde med anti-HA å oppdage i planta ubiqitinering.</li>
</ol>4. etablering av koblingen mellom enzymatisk aktivitet og funksjon i planta
Merk: for eksempel RHA1B fremmer nedbrytning av motstandsdyktig protein Gpa2 å undertrykke HR celle død. Dette trinnet viser hvordan du kan kontrollere at de ondartet aktivitetene til RHA1B er E3-avhengige.
<ol><li>Stripe hensiktsmessig Agrobacterium tumefaciens stammer bærer merket gener av interesse (i dette eksempelet ha-RHA1B, ha-RHA1BC135S, ha-RHA1BK146R, myC-Gpa2, RBP1) og tom vektor som en kontroll. Følg trinn 3.1 – 3.8 for Agrobacterium -tilberedning og injeksjon på N. bethamiana blader.</li>
	<li>For E3-avhengige substrat protein degradering, følger du trinn 3.9 – 3.12 og utfører den vestlige blotting ved hjelp av egnede antistoffer for å oppdage protein akkumulering i planteceller (f. eks, anti-HA og anti-MYC).</li>
	<li>For E3-avhengige overfølsom respons (HR) mediert celle død hemming, overvåke agroinfiltrated bladene for HR celle død symptomer 2-4 dager etter infiltrasjon.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Freemont, P. S., Hanson, I. M., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gysteine-rich+sequence+motif.">A novel gysteine-rich sequence motif.</a> Cell. 64, 483-484 (1991).</li><li>Borden, K. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+fingers+and+B-boxes:+Zinc-binding+protein-protein+interaction+domains.">RING fingers and B-boxes: Zinc-binding protein-protein interaction domains.</a> Biochemistry and Cell Biology. 76, 351-358 (1998).</li><li>Barlow, P. N., Luisi, B., Milner, A., Elliott, M., Everett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+C3HC4+Domain+by+1H-nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy:+A+New+Structural+Class+of+Zinc-finger.">Structure of the C3HC4 Domain by 1H-nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: A New Structural Class of Zinc-finger.</a> Journal of Molecular Biology. 237, 201-211 (1994).</li><li>Borden, K. L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solution+structure+of+the+RING+finger+domain+from+the+acute+promyelocytic+leukaemia+proto-oncoprotein+PML.">The solution structure of the RING finger domain from the acute promyelocytic leukaemia proto-oncoprotein PML.</a> The EMBO Journal. 14, 1532-1541 (1995).</li><li>Lorick, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+fingers+mediate+ubiquitin-conjugating+enzyme+(E2)-dependent+ubiquitination.">RING fingers mediate ubiquitin-conjugating enzyme (E2)-dependent ubiquitination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96, 11364-11369 (1999).</li><li>Jim&#233;nez-L&#243;pez, D., Mu&#241;&#243;z-Belman, F., Gonz&#225;lez-Prieto, J. M., Aguilar-Hern&#225;ndez, V., Guzm&#225;n, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repertoire+of+plant+RING+E3+ubiquitin+ligases+revisited:+New+groups+counting+gene+families+and+single+genes.">Repertoire of plant RING E3 ubiquitin ligases revisited: New groups counting gene families and single genes.</a> PLoS ONE. 13, 1-28 (2018).</li><li>Sacco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cyst+Nematode+SPRYSEC+Protein+RBP-1+Elicits+Gpa2-+and+RanGAP2-Dependent+Plant+Cell+Death.">The Cyst Nematode SPRYSEC Protein RBP-1 Elicits Gpa2- and RanGAP2-Dependent Plant Cell Death.</a> PLoS Pathogens. 5, 1-14 (2009).</li><li>Kud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potato+cyst+nematode+effector+RHA1B+is+a+ubiquitin+ligase+and+uses+two+distinct+mechanisms+to+suppress+plant+immune+signaling.">The potato cyst nematode effector RHA1B is a ubiquitin ligase and uses two distinct mechanisms to suppress plant immune signaling.</a> PLoS Pathogens. 15, 1007720 (2019).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Sigrist, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+continuing+developments+at+PROSITE.">New and continuing developments at PROSITE.</a> Nucleic Acids Research. 41, 344-347 (2013).</li><li>Dove, K. K., Stieglitz, B., Duncan, E. D., Rittinger, K., Klevit, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+insights+into+RBR+E3+ligase+ubiquitin+transfer+mechanisms.">Molecular insights into RBR E3 ligase ubiquitin transfer mechanisms.</a> EMBO Reports. 17, 1221-1235 (2016).</li><li>Metzger, M. B., Pruneda, J. N., Klevit, R. E., Weissman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING-type+E3+ligases:+Master+manipulators+of+E2+ubiquitin-conjugating+enzymes+and+ubiquitination.">RING-type E3 ligases: Master manipulators of E2 ubiquitin-conjugating enzymes and ubiquitination.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1843, 47-60 (2014).</li><li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SINAT5+promotes+ubiquitin-related+degradation+of+NAC1+to+attenuate+auxin+signals.">SINAT5 promotes ubiquitin-related degradation of NAC1 to attenuate auxin signals.</a> Nature. 419, 167-170 (2002).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Elucidating den biokjemiske og mekanistisk grunnlag av RING type E3 ubiquitin ligases kan bidra sterkt til vår forståelse av deres biologiske betydning i utvikling, stress signalering, og vedlikehold av homeostase. Protokollen beskrevet her par en mutagenese tilnærming med in vitro og i planta funksjonelle studier. Ved å innføre en enkelt aminosyre substitusjon i bevarte rester av RING domenet gjennom nettstedet-direkte mutagenese, den resulterende E3-mangelfull mutant kan testes parallelt med vill type protein for å koble enzymatisk aktivitet med funksjonalitet.
Det er avgjørende å riktig identifisere RING domene, spesielt sin bevarte cys og hans rester. Online verktøy som PROSITE kan brukes til å gjøre det10. Å destabilisere RING domenet ansvarlig for å rekruttere E2 enzymet, cys er normalt erstattes med ser, som er den nærmeste strukturelle erstatning mangler evnen til å skape en disulfide obligasjon brukes til sink koordinering. Lorick et al. viste at mutasjonen i noen av de kritiske cys rester ville avskaffe den ubiqitinering aktiviteten til singelen delenhet RING-type E3 ligases5. Selv om noen cys rester er også viktig for multiunit E3 ligase komplekser inneholder RING-type proteiner, på grunn av mangesidig og dynamisk tredimensjonal struktur av de ubiqitinering komplekser og annen rolle RING-type proteiner, enkelt erstatninger av bevarte rester i RINGEN domenet i multiunit E3 ligase har ikke vært vellykket i å generere en ligase mangelfull fenotype11.
For området-regissert mutagenese, fant vi at bruk av mindre plasmider vektorer og lavere forsterkning sykluser vanligvis gitt høyere effektivitet for mutagenese. Det PFU enzymet kan erstattes med alle andre High-Fidelity og høy processivity DNA polymerase. Videre, hvis genet av interesse inneholder sjeldne kodon, en annen E. coli stain, Rosetta, kan brukes til å oppnå høyere utbytte av rekombinant protein. I tillegg kan både inkubasjonstid og temperatur for IPTH induksjon bli ytterligere optimalisert. Lavere temperaturer redusere E. coli divisjon rente, som kan være gunstig for uttrykk for visse proteiner. Selv om høyere konsentrasjon av IPTH kan forbedre protein uttrykk, hemmer det også E. coli divisjon prosesser og anbefales ikke.
Single delenhet RING type E3 ligases fungerer ikke bare som et molekyl stillas som plasserer E2-UB-middels i umiddelbar nærhet av underlaget, men også stimulerer ubiquitin overføringsaktivitet i deres beslektet E2s. Videre, gitt at en E2/E3 kombinasjon er viktig for lengden og sammenhengene av polyubiquitin kjeden som bestemmer skjebnen til et modifisert substrat, enhver vurdering av RING-type E3s må inkludere sine enzymatisk partnere, E2s12. Som vist i Figur 3B, er ikke alle TESTEDE E2s kompatible med RHA1B-ligase. Derfor, in vitro ubiqitinering analyser bør gjennomføres parallelt med flere E2 enzymer som representerer ulike E2 klasser for å unngå falske negative resultater.
Presentert her er in vitro enzymatisk analysen som oppdager selv ubiqitinering evne til testet RING-type proteiner. Men med små modifikasjoner, kan denne protokollen enkelt tilpasses for å oppdage in vitro ubiqitinering av underlag. For dette formål bør in vitro ubiqitinering blanding fra trinn 2,15 suppleres med rekombinant protein av potensialet E3 ligase substrat (500 ng). Etter en 2 h inkubasjons ved 30 ° c, bør ubiquitinated protein fanges opp ved hjelp av 15 μL av anti-HA-affinitet matrise (hvis HA-UB brukes, eller anti-FLAG affinitet matrise hvis FLAG-UB brukes) ved omrøring for 2 h ved 4 ° c. Etter vask perlene 4X ganger med den kalde UB vaskebuffer (20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% mellom 20, 1x PMSF), forkaste alle unntatt 40 μL av bufferen og gå til trinn 2,16. Den ubiqitinering signal, oppdages av antistoffer som er spesifikke for epitope UB og substrat, henholdsvis, dukker opp fra Molekylvekten av underlaget protein, bekrefter underlaget/enzym spesifisitet.
Videre identifisering av E3 ligase underlag in vivo er vanligvis forbundet med flere utfordringer på grunn av forbigående enzym-substrat interaksjon og rask nedbrytning av ubiquitinated mål protein. Bruke en E3 ligase mangelfull mutant, som fortsatt samhandler med sitt mål, men ikke lenger ubiquitinates det13, er et svært nyttig alternativ til tillegg av PROTEASOMAL inhibitor MG132, som ikke alltid er tilstrekkelig forstyrre 26s proteasomet funksjon.
En felles karakteristikk av RING-type E3 ligases er en tendens til å forme og fungere som homo-og/eller heterodimerer. Interessant, er substitusjon i de bevarte rester av RING-domenet vanligvis forbundet med en dominerende negativ fenotype hvor mutert RING-type E3 ligase blokkerer enzymatisk aktivitet av en innfødt vill type protein13. Dermed kan overuttrykte av RING mutanter i planta være en alternativ tilnærming til å banke ut E3 ligase genet.

De aller fleste E3 ubiquitin ligases tilhører RING (Really jegnteresting NEW Gene)-type proteiner. RING-finger-domenet ble opprinnelig identifisert av Freemont et al. 1 og funksjonelt beskrevet som et domene formidling protein-protein interaksjon2. Den kanoniske RING finger er en spesiell type sink koordinerende domene definert som en konsensus sekvens av åtte bevarte cys (C) og hans (H) spesielt linjeavstand av andre aminosyrer rester (X), C-X2-c-x 9 – 39-c-X1 – 3-H-x2 – 3-c/H-x2-c-x4 – 48-c-x2-c. To Zn2 + -ioner stabiliseres av kjerne C og H-rester gjennom unik topologi for kryss seler med C1/c2 og C/H5/c6 som koordinerer den første Zn2 + ion, mensc 3/H4 og C7/c8 binder den andre (figur 1A)3,4. Avhengig av tilstedeværelsen av enten C eller H i den femte Zn2 +-koordinering området, to kanoniske underklasser av ring-finger proteiner ble definert: C3HC4 og C3H2C3 (ring-HC og ring-H2, henholdsvis). Fordi RING domenet til E3 ubiquitin ligase formidler samspillet mellom E2 bøye enzymer og underlag, har mutasjon av disse essensielle C-og H-rester blitt vist å forstyrre ligase aktivitet5. Ytterligere fem mindre vanlige underklasser av RING E3 ligases har blitt beskrevet (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T, og RING-G)6. RING-type E3 ubiquitin ligases kan videre deles inn i enkle og komplekse E3 enzymer. Den enkle singelen delenhet RING E3-ligases inneholder både substrat gjenkjennings stedet og E2-binding RING-domenet. I motsetning til dette har multisubunit RING-type E3-kompleks enten rekruttere substrat eller formidler binding av E2-ubiquitin mellomliggende til E3-komplekset. RINGEN domenet lys rester (er) som fungerer som en primær ubiquitin vedlegg nettsted (er) for selv-ubiqitinering kan også være viktig for E3 ligase aktivitet.
Ikke alle RING-inneholdende proteiner fungerer som E3-ligases. Dermed må Bioinformatic prediksjon av RING-finger domene og kapasitet for E2-avhengige protein ubiqitinering være biokjemisk validert og knyttet til den biologiske rollen til det testede proteinet. Her beskriver vi en trinnvis protokoll som beskriver hvordan du kan oppdage og funksjonelt karakterisere enzymatisk aktivitet av RING-type E3 ubiquitin ligases, både in vitro og i planta, gjennom en område styrt mutagenese tilnærming. Representanten resultatene fra denne rørledningen er vist for RING-type E3 ligase RHA1B. RHA1B er en effektor protein produsert av planten parasitt cyste nematode Globodera pallida å undertrykke plante immunitet og manipulere morfologi av plante rot celler. For å beskytte seg mot patogen/parasitt invasjon, har planter utviklet seg nukleotid-bindende domene og leucine gjenta (NB-LRR) type uimottakelig reseptorer som oppdager tilstedeværelsen av en patogen eller parasitt, og som en konsekvens, utvikle overfølsom respons (HR), som er en form for rask og lokaliserte celle død forekommer på infeksjonen stedet å arrestere kolonisering av patogener. En slik immun reseptor er potet Gpa2 protein som gir motstand mot noen isolerer av G. pallida (felt populasjoner D383 og D372)7.
Ved hjelp av presenterte protokoller, har det nylig blitt funnet at RHA1B forstyrrer anlegget immun signalering i en E3-avhengig måte ved å målrette anlegget Gpa2 immunoreceptor for ubiqitinering og degradering8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E8021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial protease inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol Blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>model: Avanti J-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commassie Blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphokinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA clean &#38; concentrator Kit</td>
			<td>ZYMO RESEARCH</td>
			<td>D4029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH5&#945; competent cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG-Ub</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-Ub</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model: 10153-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model: 1525 Digital Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>model: MaxQ 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10724815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquide nitrogen</td>
			<td>university chemistore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model: 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep plasmid purification kit</td>
			<td>ZYMO RESEARCH</td>
			<td>D4015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-HA antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-MYC antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004609M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>model: 2000 Spectrophotometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-5C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>model: C1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant protease inhibitor coctail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMAL-c2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N8076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpolypyrrolidone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1614363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica Sonicators</td>
			<td>model: Q125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional characterization of ring-type e3 ubiquitin ligases in vitro and in planta

Ubiqitinering, som en posttranslational modifikasjon av proteiner, spiller en viktig regulerende rolle i homeostase av eukaryote celler. Den kovalente vedlegg av 76 aminosyre ubiquitin bestemmelsesord til et mål protein, avhengig av lengden og topologi av polyubiquitin kjeden, kan resultere i ulike utfall fra protein degradering til endringer i lokalisering og/eller aktivitet av modifisert protein. Tre enzymer sekvensielt katalysere den ubiqitinering prosessen: E1 ubiquitin-aktivering enzym, E2 ubiquitin-bøye enzym, og E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase bestemmer substrat spesifisitet og representerer derfor en meget interessant studie emne. Her presenterer vi en helhetlig tilnærming for å studere forholdet mellom enzymatisk aktivitet og funksjon av RING-type E3 ubiquitin ligase. Denne fire-trinns protokollen beskriver 1) hvordan å generere en E3 ligase mangelfull mutant gjennom site-regissert mutagenese rettet mot bevarte RING domene; 2 – 3) hvordan undersøke ubiqitinering aktivitet både in vitro og i planta; 4) hvordan du kobler de biokjemiske analyse til biologisk betydning av testet protein. Generering av en E3 ligase-mangelfull mutant som fortsatt samhandler med sitt substrat, men ikke lenger ubiquitinates det for fornedrelse forenkler testing av enzymet-substrat interaksjoner in vivo. Videre gir mutasjonen i det bevarte RING-domenet ofte en dominerende negativ fenotype som kan benyttes i funksjonelle knockout-studier som en alternativ tilnærming til en RNA-interferens-tilnærming. Våre metoder ble optimalisert for å undersøke den biologiske rollen til planten parasitt nematode effektor RHA1B, som hijacks verts ubiqitinering systemet i planteceller for å fremme Parasitism. Med liten modifisering av in vivo uttrykks system, kan denne protokollen brukes til analyse av enhver RING-type E3 ligase uavhengig av dens opprinnelse.

I denne delen, representative resultater er gitt for protokollen som brukes til undersøkelse av en enkelt delenhet E3 ubiquitin ligase RHA1B som har en PROSITE-spådde RING-H2 type domene (132 – 176 aminosyrer)10. Som vist i figur 1, for å få en E3-mangelfull mutant protein, minst en av de åtte bevarte CS eller HS i ring domene (figur 1A) må mutagenized (figur 1B). Således, som et første skritt, to muterte versjoner av RHA1B, RHA1BC135S (en substitusjon av cys av ser i den bevarte C3 av ring domene) og RHA1BK146R (en substitusjon av lys av ARG i bare lys stede i RHA1B) ble generert. Selv om enkle delenhet E3 ligases megle ubiquitin overføring fra ubiquitin harboring E2 til underlaget i stedet for direkte samspill med ubiquitin, selv-ubiqitinering av E3 på lys kan være nødvendig for maksimal enzymatisk aktivitet.
Den vestlige blotting resulterer i figur 2a viser en typisk positiv in vitro ubiqitinering analysen utfall, med en multibanding smøre starter på Molekylvekten av testet protein (f. eks, MPB-smeltet RHA1B ~ 100 KDA) og framover oppover. Anti-HA antistoff anerkjent HA-Tagged UB innlemmet i Poly-ubiqitinering kjede av ulik lengde, skape denne typiske ubiquitin-assosiert stige-lignende smøre. For å validere de positive resultatene, figur 2A også presenterer alle viktige negative kontroller mangler individuelle komponenter (E1, E2, UB, eller MBP-RHA1B) eller bruke MBP som kontroll og mangler smurt ubiqitinering signal. Videre Coomassie blå farging av PVDF membranen viste lik lasting av MBP-RHA1B eller MBP i alle kontroller.
Figur 2B viser hvordan in vitro ubiqitinering resultatene varierte avhengig av den spesifikke E2/E3 kombinasjon. I dette eksempelet ble 11 forskjellige E2s som representerer 10 forskjellige E2-familier, testet. Den oppdagede ubiqitinering aktiviteten varierte fra ingen signal (ingen smøre) til en multibanding smøre starter på ulike molekylære vekter, indikerer ulike ubiqitinering mønstre.
Figur 3 viser ubiqitinering analysen utfall for ring-og K-mutant versjoner av testet protein. Mangel på enzymatisk aktivitet for RHA1BC135S er støttet av sin manglende evne til å enten generere en multibanding smøre in vitro (Figur 3a) eller fremme Poly-ubiqitinering signal i planta (Figur 3B). Det er bemerkelsesverdig at overuttrykte av HA-Tagged UB i planta på egen hånd ga basal nivå ubiqitinering i alle testede prøver, inkludert vektoren kontroll, i motsetning til den sterke ubiqitinering signal gitt av enzymatisk aktivitet av vill type RHA1B. Videre antyder analysen på RHA1BK146R mutant at K146 rester er også avgjørende for E3-AKTIVITETEN i RHA1B. Selv om en marginal selv ubiqitinering signal ble oppdaget in vitro (Figur 3a), i planta analysen fastslått mutant er E3-mangelfull (Figur 3B, bare bakgrunn ubiqitinering signal oppdaget).
Etter generering og biokjemisk validere E3-mangelfull mutant, kan funksjonelle studier utformes for å bestemme E3-assosiert biologisk rolle av testet RING E3 ubiquitin ligase. I tilfelle av RHA1B, denne nematode effektor undertrykker anlegget immun signalering, som manifestert ved undertrykkelse av Gpa2-utløst HR celle død. Som presentert i Figur 4A, i MOTSETNING til Wild type RHA1B, den RHA1BC135S mutant mangler E3 ligase aktivitet ikke forstyrrer HR celle død. Gitt at det vanligste utfallet av protein ubiqitinering er dens proteasomet-mediert degradering, mutasjoner bosatt i RING-domenet kan også brukes til å verifisere en E3-avhengig evne til å utløse nedbrytning av deres direkte og/eller indirekte underlag. Dermed betydelig, vestlig blotting resultater i Figur 4B bekrefte at Gpa2 ikke akkumuleres i nærvær av ville type RHA1B men RHA1BC135S hadde ingen innvirkning på Gpa2 protein stabilitet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig01.jpg"> Figur 1: skjematisk representasjon av prinsippet og trinnene som er involvert i område styrt mutagenese. (A) ring-ch/H2 domene med bevarte cys og hans aminosyrer uthevet. (B) et eksempel på mutagent primere design. (C) trinn av site-regissert mutagenese. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig02.jpg"> Figur 2: representative in vitro ubiqitinering-analysen. (A) topp gel viser ubiqitinering analysen inkludert alle negative kontroller, og bunnen gel viser lik lasting. (B) området av forventede resultater avhengig av E2 enzymer. Dette tallet har blitt modifisert fra Kud et al8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig03.jpg"> Figur 3: Ubiqitinering analyseresultater for RING-og K-mutanter (RHA1BC135S og RHA1BK146R). (A) in vitro ubiqitinering resultater for RHA1BC135S og RHA1BK146R. (B) i planta ubiqitinering analyseresultater for RHA1BC135S og RHA1BK146R. Dette tallet har blitt modifisert fra Kud et al8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig04.jpg"> Figur 4: representativ funksjons studie for E3-avhengige biologiske funksjoner. Et eksempel på funksjonelle studier som viser E3-avhengige biologiske funksjon. (A) E3-avhengige puls celle død undertrykkelse og (B) degradering av en plante immunoreceptor Gpa2. Dette tallet har blitt modifisert fra Kud et al8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">PCR satt opp</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 μL</td>
			<td>plasmider (~ 100 ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1,5 μL</td>
			<td>F mutagent primer (10 μM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1,5 μL</td>
			<td>R-mutagent primer (10 μM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 μL</td>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 μL</td>
			<td>buffer (10x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 μL</td>
			<td>Ultra PFU polymerase (2,5 U/μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>39 μL</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 μL</td>
			<td>TOTALT VOLUM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: PCR-reaksjonen er satt opp
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">thermocycler program</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>95 ° c</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>95 ° c</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>60 ° c</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>72 ° c</td>
			<td>5 min</td>
			<td>Gjenta 2-4 30 ganger</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>72 ° c</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: PCR-thermocycler program
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">ligation reaksjon satt opp for RHA1B eksempel</td>
		</tr>
<tr>
<td>1,5 μL</td>
			<td colspan="2">pMAL-C2:: MBP linearized vektor ved fordøyelsen med BamHI og SalI (60 ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>7 μL</td>
			<td colspan="2">RHA1B/RHA1BC135S eller RHA1BK146R sette fordøyd med BamHI og SalI (25 ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 μL</td>
			<td colspan="2">T4 ligase buffer (10x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 μL</td>
			<td colspan="2">T4-ligase (400 U/μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 μL</td>
			<td colspan="2">TOTALT VOLUM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: ligation reaksjonen satt opp for RHA1B eksempel.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta at JoVE.com

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Målet med dette manuskriptet er å presentere en skisse for omfattende biokjemiske og funksjonelle studier av RING-type E3 ubiquitin ligases. Dette flertrinns rørledning, med detaljerte protokoller, validerer en enzymatisk aktivitet av testet protein og demonstrerer hvordan å koble aktiviteten til funksjon.

Funksjonell karakterisering av RING-type E3 Ubiquitin Ligases in vitro og i planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Denne trinnvise protokollen viser hvordan man oppdager og karakteriserer den enzymatiske aktiviteten til RING-type E3 ubiquitin ligases, både in vitro og i planta, gjennom en stedsrettet mutagenese tilnærming. Ved å introdusere mutasjon i et RING-domene gjennom stedsrettet mutagenese, kan den resulterende E3-mangelfulle mutanten testes parallelt med det ville proteinet for å knytte den enzymatiske aktiviteten til funksjonalitet. Belyse det biokjemiske og mekaniske grunnlaget for RING-type E3 ubiquitin ligases kan bidra sterkt til vår forståelse av deres biologiske betydning i utvikling, stresssignalering og vedlikehold av homeostase.Med liten endring av in vivo-uttrykkssystemet, kan denne protokollen brukes på analyse av hvilken som helst RING-type E3 ligase uavhengig av opprinnelsen. Begynn med å identifisere de bevarte Cys og hans aminosyrer i RING-domenet og designe primere som bærer substitusjonskodon av interesse flankert av 15 basepar på hver side av mutasjonsstedet. Det er viktig å identifisere RING-domenet riktig, spesielt dens bevarte cystein og histidinrester.Nettbaserte verktøy som PROSITE kan brukes til å gjøre det. Bruk mutagente primere i PCR-forsterkning til å introdusere ønsket mutasjon i plasmiden som huser genet av interesse, og sørg for å bruke en high-fidelity DNA polymerase, som Pfu. Etter PCR, fordøye E.coli-avledet foreldremetylert og semi-metylert DNA ved å legge til tre mikroliter av Dpnl begrensning enzymet direkte til PCR reaksjon og inkubere den på 37 grader Celsius i to timer.Rens mutageniserte plasmider med et kommersielt DNA-ekstraksjonssett, og elute DNA i 50 mikroliter vann. Deretter forvandle DH5-alfa E.coli kjemisk kompetente celler med 0,5 mikroliter av gjenvunnet mutagenisert plasmid DNA i henhold til produsentens protokoll. Klone villtype RING og muterte RING gener av interesse i pMAL-c2 vektor for å smelte disse genene med MBP epitop tag.Deretter setter du opp in vitro ubiquitination-reaksjonen i et totalt volum på 30 mikroliter, som beskrevet i manuskriptet, og inkubere blandingen ved 30 grader Celsius i to timer. Avslutt reaksjonen ved å blande prøven med 7,5 mikroliter 5x SDS-PAGE lasting buffer og koke den i fem minutter, og deretter skille proteinene med 7,5% SDS-polyakrylamid gel elektroforese. Overfør til PVDF-membranen, og oppdag ubiquitination med vestlig blotting og anti-FLAG.Beis membranen med Coomassie blå for å verifisere lik belastning av testet MBP-RING-type protein. Strek Agrobacterium tumefaciens stammer bærer epitop-merket genet av interesse på LB medium som inneholder riktig utvalg antibiotika. Etter to dager med vekst på 28 grader Celsius, plukke enkeltkolonier, og vokse dem i LB flytende medium med antibiotika på 28 grader Celsius og 250 rpm for en annen 24 timer.Overfør 100 mikroliter av agrobakteriell kultur til tre milliliter frisk LB med antibiotika, og inkuber kulturen i ytterligere fire til seks timer. Spinn ned cellene på 1, 800 ganger g i seks minutter, kast supernatanten og gjenoppuss cellene med tre milliliter vaskebuffer. Gjenta vasken to ganger, og gjenoppusst cellene i induksjonsbufferen, og inkuber dem i ytterligere 10 til 12 timer ved 28 grader Celsius.Etter inkubasjonen sentrifuger cellene ved 1, 800 ganger g i seks minutter, og kast det overnaturlige. Resuspend cellene med to milliliter infiltrasjonbuffer, og bestemme konsentrasjonen av bakterier ved hjelp av OD600-verdien. Agroinfiltrere fire uker gamle Nicotiana benthamiana blader ved å forsiktig stikke dem med en nål, og hånd-injisere Agrobacterium med en sprøyte, deretter sirkle infiltrert området med en markør.Etter 36 timer, samle infiltrert bladvev, og male det til et fint pulver med flytende nitrogen. Gjenoppusst vevspulveret med 300 mikroliter proteinekstraksjonsbuffer, og sentrifuger det ved 15 000 ganger g i 15 minutter ved fire grader Celsius. Overfør det overnaturlige til et friskt rør, tilsett 5x SDS-PAGE lasting buffer til en endelig konsentrasjon på 1x, og kok prøven i fem minutter.Deretter utfører du vestlig flekkanalyse for å oppdage i planta ubiquitination. Strek de riktige Agrobacterium tumefaciens stammer bærer taggete gener av interesse eller tom vektor, og injisere Agrobacterium på Nicotiana benthamiana blader, som tidligere beskrevet. For E3-avhengig substrat protein nedbrytning, følg den tidligere beskrevne protokollen, og utfør vestlig blotting med passende antistoffer for å oppdage proteinakkumulering i planteceller.For E3-avhengig overfølsom responsmediert celledødshemming, overvåk de agroinfiltrerte bladene for celledødssymptomer to til fire dager etter infiltrasjon. Et typisk in vitro ubiquitination analyseutfall inneholder et multiband smøre som starter ved den molekylære vekten av det testede proteinet og utvikler seg oppover. Som forventet viste negative kontroller manglende individuelle komponenter eller bruk av MBP ikke det smurte signalet.Videre viste Coomassie blå farging av PVDF-membranen lik lasting av MBP-RHA1B eller MBP i alle kontroller. 11 forskjellige E2-ere ble testet for å undersøke hvordan in vitro ubiquitination varierer avhengig av den spesifikke E2- til E3-kombinasjonen. Den oppdagede ubiquitination aktiviteten varierte fra ingen signal til en multiband smøre starter på forskjellige molekylvekter, noe som indikerer ulike ubiquitination mønstre.RING-og K-mutant-versjonene av RHA1B ble testet for ubiquitination in vitro og i planta. Mangelen på enzymatisk aktivitet av RING-mutant versjonen støttes av sin manglende evne til å enten generere en multiband smøre in vitro eller fremme poly-ubiquitination signal i planta. Selv om et marginalt selvopplysningssignal ble oppdaget in vitro for K-mutanten, ble det kun oppdaget bakgrunnsubiquitination i planta, noe som tyder på at K146-rester også er avgjørende for E3-aktivitet.I motsetning til den ville typen RHA1B, påvirket ringmutanten som manglet E3-ligaseaktivitet ikke overfølsom responscelledød. Vestlig blotting bekreftet at Gpa2 ikke akkumuleres i nærvær av villtype RHA1B, men RING mutant hadde ingen innvirkning på proteinstabilitet. Gitt at en riktig E2-E3-kombinasjon er nødvendig for ubiquitination-reaksjonen, bør in vitro ubiquitination-analyser bæres parallelt med flere E2-enzymer som representerer forskjellige E2-klasser for å unngå falske negative resultater.En E3 ligase-mangelfull mutant forenkler testing av enzym-substrat interaksjoner in vivo. Videre gir denne mutanten ofte en dominerende negativ fenotype som kan benyttes i funksjonelle knockout-studier som en alternativ tilnærming til RNAi. Ved hjelp av denne protokollen har det nylig blitt funnet at RHA1B nematode effektor forstyrre anlegget immunsignalering på en E3-avhengig måte ved å målrette anlegget Gpa2 immunoreceptor for ubiquitination og nedbrytning.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Utarbeidelse av Keratin hydrolyse fra kylling fjær og dens anvendelse i kosmetikk

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Funksjonell karakteristikk av Carboxylesterases i insektmiddel resistente hus fluer, Musca Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifisering av Hypopigmentation aktivitet i Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheter (SUBEs) som verktøy for berikelse, isolasjon, identifisering og karakterisering av SUMO proteom i leverkreft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Profilering Ubiquitin og Ubiquitin-lignende avhengige post-translational modifikasjoner og identifisering av vesentlige endringer

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Rask og kostnadseffektiv RNA-ekstraksjon av rottepanasittvev

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Merking og visualisering av mitokondriegenomuttrykksprodukter i Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...