Name: identification of novel regulators of plant transpiration by large-scale thermal imaging screening in helianthus annuus
Uploaded: 2020-01-30T15:00:00
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这项工作得到了波莫纳学院创业基金和赫希研究启动赠款基金（对FJ）以及波莫纳学院分子生物学项目的支持，该计划通过恒星暑期研究助理计划（到KG）。

1. 种植植物
<ol><li>将 4 厘米厚的细玉层添加到标准 10 英寸 x 20 英寸（254 毫米 x 501 毫米）无孔的植物托盘中。</li>
	<li>将种子支架（见材料表）分开2厘米放在植物托盘中。</li>
	<li>用紫石填充种子支架。</li>
	<li>在每个种子持有人中放置一个尖端的葵花籽，向下推，使一半的种子仍然暴露。 注：向日葵种子是不对称的，从辐射出现处的尖端应指向向下。正确的种子放置很重要，因?...

<ol>
	<li>Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+adaptation+to+drought+stress.">Plant adaptation to drought stress.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gate+control:+guard+cell+regulation+by+microbial+stress.">Gate control: guard cell regulation by microbial stress.</a> The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).</li><li>Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+Plant's+Dilemma.">Revisiting the Plant's Dilemma.</a> Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).</li><li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+delivery+of+next+generation+therapeutics+from+high+throughput+screening+libraries.">Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+interrogation+of+natural+variation+uncovers+a+molecule+that+is+glycoactivated.">Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+inhibits+type+2C+protein+phosphatases+via+the+PYR/PYL+family+of+START+proteins.">Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins.</a> Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+PP2C+phosphatase+activity+function+as+abscisic+acid+sensors.">Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors.</a> Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).</li><li>Cao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ABA-mimicking+ligand+that+reduces+water+loss+and+promotes+drought+resistance+in+plants.">An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants.</a> Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).</li><li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dimeric+ABA+receptors+elicits+guard+cell+closure,+ABA-regulated+gene+expression,+and+drought+tolerance.">Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).</li><li>Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+agrochemical+ligands+for+engineered+abscisic+acid+receptors.">Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors.</a> Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).</li><li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+reveals+negative+regulation+of+abscisic+acid+signaling+by+a+plant+immune+response+pathway.">Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway.</a> Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Abscisic+Acid+Antagonists+Identified+with+Chemical+Array+Screening.">Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).</li><li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Chemical+Inhibitor+of+ABA+Signaling+Targets+All+ABA+Receptors.">A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).</li><li>Takeuchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+abscisic+acid+analogs+as+antagonists+of+PYL-PP2C+receptor+interactions.">Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions.</a> Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).</li><li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+modification+of+sunflower+oil+to+expand+its+industrial+value.">Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).</li><li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies:+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions.">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).</li><li>Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermography+to+explore+plant-environment+interactions.">Thermography to explore plant-environment interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).</li><li>Merlot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+infrared+thermal+imaging+to+isolate+Arabidopsis+mutants+defective+in+stomatal+regulation.">Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation.</a> The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).</li></ol>

在给定一天可以测试的化合物数量主要取决于（i） 可用于种植植物和执行屏幕的环境控制空间，以及 （ii） 可以参与协议步骤 6 的人数。我们建议使用三个实验复制来合并统计处理后对结果的解释。在典型的一天中，一到两个人可以通过测试（例如[60 种化学品 + 6 个阴性 （DMSO） 控制 + 3 个阳性 （ABA） 控制] 在早上、中午和下午进行测试，从而毫无困难地筛选出 60 种化合物。
<p class="jove_cont...

植物耐应力性是一种多基因性特征，受各种分子、细胞、发育和生理特征及机制的影响。在波动环境中的植物需要不断调节其口腔运动，以平衡碳的光合需求，同时保持足够的水，防止病原体入侵2;然而，这些权衡"决定"的机制被人们所理解的还很薄弱。将生物活性分子引入植物可以调节其生理，并有助于探索新的调节机制。
大规模筛选小分子是抗癌药物发现和药理学测定的有效策略，用于在短时间内测试数百至数千个分子的生理效应。在植物生物学中，高通量筛选在鉴定合成分子皮拉巴辛6以及发现长期寻求的抗性酸受体（ABA）7、8）方面已显示出其有效性。从那时起，ABA受体的激动剂和拮抗剂，以及能够调节ABA诱导报告基因表达的小分子，已经识别了9、10、11、12、13、14、15。目前可用于识别可调节孔径的小化合物的高通量筛选方法有一些缺点：（i） 围绕 ABA 信号通路旋转的协议可能妨碍识别新的 ABA 独立机制;（ii） 用于鉴定生物活性小分子的体内策略主要依赖于其对种子发芽或幼苗生长的生理影响，而不是植物蒸腾的调节。
此外，虽然有许多方法可以用生物活性分子治疗植物，但大多数方法并不适合大规模研究口腔运动。简而言之，三种最常见的技术是通过喷洒或浸渍、根系处理和根灌来应用叶面。叶面应用与测量孔径的最常用和快速的方法不兼容，因为叶表面存在液滴会干扰大规模数据收集。根灌的主要局限性是样品量要求大，根圈中元素对化合物的潜在保留，以及对主动根的采集的依赖。
在这里，我们提出了一种大规模的方法，以识别调节植物蒸腾的新化合物，这些化合物不一定涉及ABA或已知的抗旱机制，并允许对植物进行高效和可靠的处理。在此系统中，使用根喂养方法处理Helianthus 年幼植物，该方法包括切割水培生长的幼苗的主要根部，并将切地浸入样品溶液中。一旦处理，使用红外热像仪测量每种化合物对植物蒸腾的影响。由于叶片表面温度的一个主要决定因素是叶片的蒸发速率，热成像数据可与口腔电导率直接相关。因此，化学处理后叶面温度的相对变化为工厂蒸腾提供了直接的量化手段。
H. 年金是世界五大油籽作物之一，直接在该工厂上进行的发现可能促进未来的技术转让。此外，H. 年幼苗有大而平坦的幼苗，以及厚厚的原根，这是开发该协议的理想选择。然而，这种方法可以很容易地适应其他植物和各种化合物。
该协议可用于有效识别能够触发气孔闭合或促进气孔开口的分子，这对理解调节气孔传导和植物适应环境的信号具有重大影响应力。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 plastic growing trays without drain holes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Standard 10 x 20 inch trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microtubes, capless</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-283NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abscisic acid (ABA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Active Aqua</td>
			<td>AAPA7.8L</td>
			<td>2 Outlets, 3W, 7.8 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airstones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical compound library</td>
			<td>MicroSource Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Natural Product Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creative Versa-Tool (wood burning tool)</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>9724549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dwarf Sunspot Sunflower seeds</td>
			<td>Outsidepride.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>200964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro)</td>
			<td>General Hydroponics</td>
			<td>GL51GH1421.31.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ResearchIR Software</td>
			<td>FLIR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board</td>
			<td>Insulfoam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedholders</td>
			<td>Araponics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Tub (plastic utility tub)</td>
			<td>Maccourt</td>
			<td>ST3608</td>
			<td>36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>FLIR-T62101</td>
			<td>Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water filter</td>
			<td>SunSun</td>
			<td>HW-304B Pro Canister Filter</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel regulators of plant transpiration by large-scale thermal imaging screening in helianthus annuus

植物对生物和非生物胁迫的适应受多种因素的制约，其中，针对水缺乏或病原体调节气孔孔起着至关重要的作用。因此，识别调节口腔运动的小分子有助于了解植物适应其环境的生理基础。用于识别口腔运动调节器的大规模筛查方法具有潜在的局限性：有些方法严重依赖腹酸 （ABA） 激素信号通路，因此排除了 ABA 独立的机制，而另一些则依赖于对植物生长和发育等间接长期生理影响的观察。这里介绍的筛选方法允许对具有化学库的植物进行大规模处理，并通过热成像直接定量其蒸腾。由于通过蒸腾蒸发的水会导致叶片表面冷却，热成像提供了一种非侵入性的方法来研究口腔电导随时间的变化。在此协议中，Helianthus 年幼幼被水培生长，然后通过根部喂养进行处理，其中主要根被切割并浸入被测试的化学品中。热成像，然后统计分析随时间变化的粘结温度变化，可以识别生物活性分子调节造血孔径。我们的概念验证实验证明，一种化学物质可以在10分钟内从切根带到向日葵幼苗的幼苗。此外，当植物被ABA视为阳性对照时，可以在几分钟内检测到叶片表面温度升高。因此，我们的方法能够高效、快速地识别调节口腔孔径的新型分子。

使用红色染料Erythrosine B（0.8 kDa）的实验表明，在10分钟内，通过切根将化学物质吸收到向日葵幼苗的幼苗中，这种化学物质能够被明显吸收（图1）。
当植物使用ABA处理时，在几分钟内检测到向日葵的叶温升高。叶片温度的升高与口腔孔径和口腔电导率的下降有关。使用 10 μM ABA（p 值 = 0.02）和 20 分钟（...

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Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

通过对化合物库进行大规模筛选，提供一种识别叶面蒸腾调节器的方法。

赫连图斯安努斯大型热成像筛选装置新稳压器的鉴定

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

该协议使用热成像技术来识别能够调节植物蒸腾的新化合物。这种技术在可测试的植物种类、化合物的性质和成像类型方面是通用的。要建立种植植物，首先在标准10至20英寸的植物托盘中加入一层四厘米厚的细紫土，没有孔，并在托盘中放置两厘米分开的种子。将种子持有人填入紫流石，将一个向日葵种子尖端放入每个种子持有人中，使一半的种子保持暴露。当所有种子都镀上时，再用两厘米的细紫刚石和雾气覆盖它们，上面是水。一小时后，用盖子盖住托盘，将植物放在温室的生长室中。要建立水培系统，请用蒸馏水填充适合生长植物的合适容器，并加入制造商指示的一般水培肥料。然后使用空气和水泵对产生的水培溶液进行持续运动。要准备水培浮子，将一块两厘米厚的膨胀聚苯乙烯泡沫切成容器的尺寸，并使用木材燃烧工具在泡沫上打一到两厘米直径的孔。然后将浮子放入水培系统中。种植五天后，轻轻地把幼苗从紫菜中拉出来。立即将幼苗放在一个水容器中 30 分钟，以清除多余的紫土，并软化剩余的紫土。当新兴的主根可见时，请按手删除 pericarp。将种子架内的幼苗转移到水培系统中准备好的聚苯乙烯泡沫浮子中。在水培中种植植物两天。让小复合库中的化学物质在室温下解冻。标签六无帽两毫升微管的负对控制处理，三管为 ABA 治疗，最后 60 管用于分析 20 种感兴趣的三钙化化学物质的影响。在每个试管中加入每种化学品的10微升，在三个BA管中加入10微升10毫摩尔BA和二甲基硫化物，在六个控制管中加入10微升二甲基硫化物。然后小心地将 990 微升 10 毫摩尔 MES 氢氧化钾混合到每个管中。将管子放入管架中，将正负控制和实验管均匀地分布在机架内，以考虑位置相关偏差。要设置热像仪，请先将摄像机安装在复印支架上，然后将所有电缆连接到笔记本电脑。在打开笔记本电脑并打开热成像分析软件之前打开相机。要调整录制参数，请将鼠标滚动到"录制"按钮上，以允许在"录制设置"下选择扳手图标，并选择适当的记录模式和选项。为了处理幼苗，小心地抬起种子架，并迅速将根浸入含水的浅盘中。将每个幼苗在水下的根部切成0.8至1厘米，在种子架最基底的末端下方，以防止被吸收，并将新切的植物插入一管化学品中。当所有幼苗都转移后，将植物放在热像仪下，并确认所有植物都在摄像机的视野内。要将相机对焦到胶卷表面，请按"控制 Alt A"，然后单击"录制影片"。将打开确认录制的新窗口。一到两个小时后，停止录制。对于数据分析，请打开正确的 seq 文件并暂停影片。单击添加感兴趣的测量光标区域三 x 三像素图标，并将鼠标移到第一个工厂的科蒂顿中心。左键单击图像，为科蒂顿贴上标签。以相同的方式标记第一种植物的第二个科蒂顿。当所有工厂都标有两个光标时，单击兴趣图标的编辑区域并左键单击按住并滚动以选择所有感兴趣的区域。接下来，将鼠标滚动到统计查看器图标上并选择时间绘图。将打开一个新窗口。运行影片时，图形将填充数据。然后在图形窗口中，单击双箭头打开新菜单，然后单击保存图标以保存数据。使用红色染料红红素B表明，化学品在10分钟内通过切根明显吸收到向日葵幼苗的科蒂莱顿中。当植物用 ABA 处理时，在 30 分钟内在向日葵中检测到叶温升高，这与口腔孔径和口腔传导的减少有关。此外，使用10微摩尔 ABA 治疗后 15 分钟和 5 微摩尔 ABA 治疗后 20 分钟观察到叶面温度升高，证明通过热成像测量叶温是测量口腔孔径和电导率的一个很好的代理。在这个具有代表性的实验中，基于分数的标准统计处理允许识别促进口腔闭合或开口的化学品。为了测量化合物对蒸腾的影响，在光线、湿度和温度的最佳条件下种植植物非常重要。该协议可以应用于大多数二元。它还可用于评估新化合物对光合作用性能的影响，例如通过测量叶绿素荧光。

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