Name: identification of novel regulators of plant transpiration by large-scale thermal imaging screening in helianthus annuus
Uploaded: 2020-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus at JoVE.com

Die Arbeit wurde durch pomona College Start-up Funds und Hirsch Research Initiation Grants Fund (to FJ) sowie das Pomona College Molecular Biology Program durch das Stellar Summer Research Assistant Program (to KG) unterstützt.

1. Anbau der Pflanzen
<ol><li>Fügen Sie eine 4 cm dicke Schicht feinen Vermiculit s. auf Standard 10 in. x 20 in (254 mm x 501 mm) Pflanzenschalen ohne Löcher.</li>
	<li>Legen Sie die Saatguthalter (siehe Materialtabelle)2 cm voneinander entfernt in die Pflanzenschalen.</li>
	<li>Säwerthalter mit Vermiculit füllen.</li>
	<li>Legen Sie einen Sonnenblumenkern mit seinem spitzen Ende nach unten in jeden Samenhalter, drücken Sie nach unten, so dass die Hälfte des Samens ausgesetzt bleibt. HINWEIS:...

<ol>
	<li>Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+adaptation+to+drought+stress.">Plant adaptation to drought stress.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gate+control:+guard+cell+regulation+by+microbial+stress.">Gate control: guard cell regulation by microbial stress.</a> The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).</li><li>Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+Plant's+Dilemma.">Revisiting the Plant's Dilemma.</a> Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).</li><li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+delivery+of+next+generation+therapeutics+from+high+throughput+screening+libraries.">Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+interrogation+of+natural+variation+uncovers+a+molecule+that+is+glycoactivated.">Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+inhibits+type+2C+protein+phosphatases+via+the+PYR/PYL+family+of+START+proteins.">Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins.</a> Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+PP2C+phosphatase+activity+function+as+abscisic+acid+sensors.">Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors.</a> Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).</li><li>Cao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ABA-mimicking+ligand+that+reduces+water+loss+and+promotes+drought+resistance+in+plants.">An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants.</a> Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).</li><li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dimeric+ABA+receptors+elicits+guard+cell+closure,+ABA-regulated+gene+expression,+and+drought+tolerance.">Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).</li><li>Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+agrochemical+ligands+for+engineered+abscisic+acid+receptors.">Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors.</a> Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).</li><li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+reveals+negative+regulation+of+abscisic+acid+signaling+by+a+plant+immune+response+pathway.">Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway.</a> Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Abscisic+Acid+Antagonists+Identified+with+Chemical+Array+Screening.">Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).</li><li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Chemical+Inhibitor+of+ABA+Signaling+Targets+All+ABA+Receptors.">A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).</li><li>Takeuchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+abscisic+acid+analogs+as+antagonists+of+PYL-PP2C+receptor+interactions.">Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions.</a> Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).</li><li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+modification+of+sunflower+oil+to+expand+its+industrial+value.">Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).</li><li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies:+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions.">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).</li><li>Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermography+to+explore+plant-environment+interactions.">Thermography to explore plant-environment interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).</li><li>Merlot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+infrared+thermal+imaging+to+isolate+Arabidopsis+mutants+defective+in+stomatal+regulation.">Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation.</a> The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).</li></ol>

Die Anzahl der Verbindungen, die an einem bestimmten Tag getestet werden können, hängt hauptsächlich von (i) dem umweltkontrollierten Raum ab, der für den Anbau der Pflanzen und die Durchführung des Bildschirms zur Verfügung steht, sowie von (ii) von der Anzahl der Personen, die an Schritt 6 des Protokolls beteiligt werden können. Wir empfehlen die Verwendung von drei experimentellen Replikaten, um die Interpretation der Ergebnisse nach der statistischen Behandlung zu konsolidieren. An einem typischen Tag können ...

Die Stresstoleranz bei Pflanzen ist ein polygener Merkmal, das durch eine Vielzahl molekularer, zellulärer, entwicklungs- und physiologischer Merkmale und Mechanismen beeinflusst wird1. Pflanzen in einer schwankenden Umgebung müssen ihre stomatoalen Bewegungen kontinuierlich modulieren, um den photosynthetischen Kohlenstoffbedarf auszugleichen und gleichzeitig ausreichend Wasser zu erhalten und eine Invasion von Krankheitserregern zu verhindern2; die Mechanismen, mit denen diese "Entscheidungen" zwischen diesen Kompromissen getroffen werden, werden jedoch schlecht verstanden3. Die Einführung bioaktiver Moleküle in Pflanzen kann ihre Physiologie modulieren und bei der Untersuchung neuer Regulationsmechanismen helfen.
Das groß angelegte Screening kleiner Moleküle ist eine effektive Strategie, die bei der Entdeckung von Krebsmedikamenten und pharmakologischen Assays verwendet wird, um die physiologischen Wirkungen von Hunderten bis Tausenden von Molekülen in kurzer Zeit zu testen4,5. In der Pflanzenbiologie hat das Hochdurchsatz-Screening seine Wirksamkeit beispielsweise bei der Identifizierung des synthetischen Moleküls Pyrabactin6sowie bei der Entdeckung des lang ersehnten Rezeptors von Abscisinsäure (ABA)7,8gezeigt. Seitdem wurden Agonisten und Antagonisten von ABA-Rezeptoren und kleinen Molekülen identifiziert, die in der Lage sind, die Expression von ABA-induzierbaren Reportergenen zu modulieren9,10,11,12,13,14,15. Derzeit verfügbare Hochdurchsatz-Screening-Ansätze zur Identifizierung kleiner Verbindungen, die die stomatole Blendung modulieren können, haben einige Nachteile: (i) Protokolle, die sich um den ABA-Signalweg drehen, können die Identifizierung neuartiger ABA-unabhängiger Mechanismen verhindern, und (ii) In-vivo-Strategien zur Identifizierung bioaktiver kleiner Moleküle beruhen in erster Linie auf deren physiologischen Auswirkungen auf die Samenkeimung oder das Sämlingswachstum und nicht auf die Regulierung der Pflanzentranspiration.
Darüber hinaus gibt es viele Möglichkeiten, Pflanzen mit bioaktiven Molekülen zu behandeln, aber die meisten von ihnen sind nicht gut für eine groß angelegte Studie der stomatoalen Bewegung geeignet. Kurz gesagt, die drei häufigsten Techniken sind Blattanwendung durch Sprühen oder Tauchen, Behandlung des Wurzelsystems und Wurzelbewässerung. Die Blattanwendung ist nicht mit den gebräuchlichsten und schnellsten Methoden zur Messung der stomatalen Blende kompatibel, da das Vorhandensein von Tröpfchen an der Blattoberfläche die großangelegte Datenerfassung beeinträchtigt. Die Haupteinschränkungen der Wurzelbewässerung sind die großen Probenvolumenanforderungen, die potenzielle Retention der Verbindungen durch Elemente in der Rhizosphäre und die Abhängigkeit von aktiver Wurzelaufnahme.
Hier stellen wir eine groß angelegte Methode zur Identifizierung neuer Verbindungen vor, die die Pflanzentranspiration regulieren, die nicht unbedingt ABA- oder bekannte Trockenheitsreaktionsmechanismen beinhalten und eine effiziente und zuverlässige Behandlung von Anlagen ermöglichen. In diesem System werden Helianthus Annuus-Pflanzen mit einem Wurzelfütterungsansatz behandelt, der darin besteht, die Primärwurzel von hydroponisch angebauten Sämlingen zu schneiden und die schnittstelle in die Probenlösung zu tauchen. Nach der Behandlung wird die Wirkung jeder Verbindung auf die Transpiration von Pflanzen mit einer Infrarot-Wärmebildkamera gemessen. Da eine wesentliche Determinante der Blattoberflächentemperatur die Verdunstungsrate des Blattes ist, können Wärmebilddaten direkt mit der stomatalischen Leitfähigkeit korreliert werden. Die relative Veränderung der Blatttemperatur nach chemischer Behandlung bietet somit eine direkte Möglichkeit, die Pflanzentranspiration zu quantifizieren.
H. annuus ist eine der fünf größten Ölsaaten pflanzen in der Welt16 und Entdeckungen direkt auf dieser Pflanze gemacht kann zukünftige Transfer von Technologie zu erleichtern. Darüber hinaus haben H. annuus Sämlinge große und flache Kotyledonen, sowie eine dicke Primärwurzel, die ideal für die Entwicklung dieses Protokolls war. Diese Methode kann jedoch leicht an andere Pflanzen und eine Vielzahl von Verbindungen angepasst werden.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Moleküle effektiv zu identifizieren, die in der Lage sind, stomatale Verschluss zu lösen oder die stomasale Öffnung zu fördern, was erhebliche Auswirkungen auf das Verständnis der Signale hat, die die stomatole Leitfähigkeit und Die Anpassung der Anlage an die Umwelt regulieren. Betont.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 plastic growing trays without drain holes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Standard 10 x 20 inch trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microtubes, capless</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-283NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abscisic acid (ABA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Active Aqua</td>
			<td>AAPA7.8L</td>
			<td>2 Outlets, 3W, 7.8 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airstones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical compound library</td>
			<td>MicroSource Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Natural Product Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creative Versa-Tool (wood burning tool)</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>9724549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dwarf Sunspot Sunflower seeds</td>
			<td>Outsidepride.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>200964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro)</td>
			<td>General Hydroponics</td>
			<td>GL51GH1421.31.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ResearchIR Software</td>
			<td>FLIR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board</td>
			<td>Insulfoam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedholders</td>
			<td>Araponics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Tub (plastic utility tub)</td>
			<td>Maccourt</td>
			<td>ST3608</td>
			<td>36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>FLIR-T62101</td>
			<td>Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water filter</td>
			<td>SunSun</td>
			<td>HW-304B Pro Canister Filter</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel regulators of plant transpiration by large-scale thermal imaging screening in helianthus annuus

Die Anpassung der Pflanzen an biotische und abiotische Belastungen wird durch eine Vielzahl von Faktoren bestimmt, unter denen die Regulierung der stomatalen Öffnung als Reaktion auf Wasserdefizit oder Krankheitserreger eine entscheidende Rolle spielt. Die Identifizierung kleiner Moleküle, die die stomasale Bewegung regulieren, kann daher dazu beitragen, die physiologische Nergrundlage zu verstehen, auf der sich Pflanzen an ihre Umgebung anpassen. Groß angelegte Screening-Ansätze, die zur Identifizierung von Regulatoren der stomatalen Bewegung verwendet wurden, haben potenzielle Einschränkungen: Einige verlassen sich stark auf den Signalweg des Abbscisinsäure(ABA)-Hormons, wodurch ABA-unabhängige Mechanismen ausgeschlossen werden, während andere auf die Beobachtung indirekter, langfristiger physiologischer Effekte wie Pflanzenwachstum und -entwicklung angewiesen sind. Das hier vorgestellte Screening-Verfahren ermöglicht die großflächige Behandlung von Anlagen mit einer Bibliothek von Chemikalien in Verbindung mit einer direkten Quantifizierung ihrer Transpiration durch Wärmebildgebung. Da die Verdunstung von Wasser durch Transpiration zu einer Blattoberflächenkühlung führt, bietet die Wärmebildgebung einen nicht-invasiven Ansatz, um Veränderungen der stomataalen Leitfähigkeit im Laufe der Zeit zu untersuchen. In diesem Protokoll werden Helianthus annuus Sämlinge hydroponisch angebaut und dann durch Wurzelfütterung behandelt, bei der die Primärwurzel geschnitten und in die zu prüfende Chemikalie getaucht wird. Die Wärmebildgebung mit anschließender statistischer Analyse von kotyledonären Temperaturänderungen im Laufe der Zeit ermöglicht die Identifizierung bioaktiver Moleküle, die die stomamale Öffnung modulieren. Unsere Proof-of-Concept-Experimente zeigen, dass eine Chemikalie innerhalb von 10 Minuten von der geschnittenen Wurzel zum Kotyledon des Sonnenblumensämlings getragen werden kann. Darüber hinaus kann bei der Behandlung von Pflanzen mit ABA als Positivkontrolle innerhalb von Minuten ein Anstieg der Blattoberflächentemperatur festgestellt werden. Unsere Methode ermöglicht somit die effiziente und schnelle Identifizierung neuartiger Moleküle, die die stomatole Öffnung regulieren.

Ein Experiment mit dem roten Farbstoff Erythrosin B (0,8 kDa) zeigt die Fähigkeit von Chemikalien, durch eine geschnittene Wurzel innerhalb von 10 Minuten sichtbar durch eine geschnittene Wurzel in die Kotyledonen eines Sonnenblumensämlings aufgenommen zu werden (Abbildung 1).
Wenn Pflanzen mit ABA behandelt werden, wird innerhalb weniger Minuten ein Anstieg der Blatttemperatur in Sonnenblumen-Cot...

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Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Wir bieten eine Methode zur Identifizierung von Modulatoren der Blatttranspiration durch großangelegtes Screening einer zusammengesetzten Bibliothek.

Identifizierung neuartiger Regulatoren der Pflanzentranspiration durch großangelegtes Thermisches Bildgebungsscreening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Dieses Protokoll verwendet Wärmebildgebung, um neue Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, die Pflanzentranspiration zu regulieren. Diese Technik ist vielseitig in Bezug auf die Pflanzenarten, die getestet werden können, die Art der Verbindung, und die Art der Bildgebung. Um die Pflanzen für den Anbau aufzustellen, fügen Sie zunächst eine vier Zentimeter dicke Schicht feinen Vermiculits zu Standard 10 mal 20 Zoll Pflanzenschalen ohne Löcher hinzu und legen Sie Die Samenhalter zwei Zentimeter voneinander entfernt in die Schalen.Füllen Sie die Samenhalter mit Vermiculit und legen Sie ein Sonnenblumenkernspitzein dein Ende in jeden Halter, so dass die Hälfte des Samens freigelegt bleibt. Wenn alle Samen plattiert sind, bedecken Sie sie mit weiteren zwei Zentimeterfeiner Vermiculit und Nebel mit Wasser von oben. Nach einer Stunde die Schalen mit Deckeln bedecken und die Pflanzen in einer Wachstumskammer in einem Gewächshaus platzieren.Um das Hydroponiksystem einzurichten, füllen Sie einen entsprechend großen Behälter, der für den Anbau von Pflanzen hydroponisch mit destilliertem Wasser geeignet ist, und fügen Sie den vom Hersteller angegebenen allgemeinen Hydroponikdünger hinzu. Verwenden Sie dann Luft- und Wasserpumpen, um die resultierende Hydroponiklösung mit konstanter Bewegung zu belüften. Um die Hydroponik Schwimmer vorzubereiten, schneiden Sie ein Blatt von zwei Zentimeter dicke expandiertem Polystyrolschaum auf die Abmessungen des Behälters und verwenden Holzverbrennungswerkzeug, um Ein bis zwei Zentimeter Durchmesser Löcher im Schaum zu machen.Dann legen Sie die Schwimmer in das Hydroponiksystem. Fünf Tage nach der Pflanzung die Sämlinge vorsichtig aus dem Vermiculit ziehen. Die Sämlinge sofort 30 Minuten lang in einen Behälter mit Wasser geben, um überschüssigevermiculit zu entfernen und die restlichen Perikarpfen zu erweichen.Wenn die entstehenden Primärwurzeln sichtbar sind, entfernen Sie die Perikarpfen bei Bedarf von Hand. Die Sämlinge innerhalb der Samenhalter in die vorbereiteten Polystyrolschaumschwimmer im Hydroponiksystem geben. Wachsen Sie die Pflanzen in Hydroponik für zwei Tage.Lassen Sie die Chemikalien aus der kleinen Verbundbibliothek bei Raumtemperatur auftauen. Etikettieren Sie sechs kaplose Zwei-Milliliter-Mikroröhren für die Negativkontrollbehandlung, drei Röhren für die ABA-Behandlung und die abschließenden 60 Tuben zur Analyse der Auswirkungen der 20 Chemikalien, die für Triplicate von Interesse sind. Fügen Sie 10 Mikroliter jeder Chemikalie in jedes der Reagenzgläser, 10 Mikroliter 10 Millimolar ABA und Dimethylsulfoxid in die drei ABA-Röhren und 10 Mikroliter Dimethylsulfoxid in die sechs Kontrollröhrchen.Dann 990 Mikroliter 10 Millimolar MES Kaliumhydroxid sorgfältig in jede Röhre mischen. Legen Sie die Rohre in ein Rohrgestell mit der positiven und negativen Kontrolle und Experimentelle Norden gleichmäßig innerhalb des Racks verteilt, um positionbezogene Verzerrung zu berücksichtigen. Um die Wärmebildkamera einzurichten, montieren Sie die Kamera zuerst an einem Kopierständer und schließen Sie alle Kabel an einen Laptop an.Schalten Sie die Kamera ein, bevor Sie den Laptop einschalten, und öffnen Sie die Wärmebildanalysesoftware. Um die Aufnahmeparameter anzupassen, rollen Sie mit der Maus über die Aufnahmetaste, um die Auswahl des Schraubenschlüsselsymbols unter Aufnahmeeinstellungen zu ermöglichen, und wählen Sie den entsprechenden Aufnahmemodus und die entsprechenden Optionen aus. Für die Behandlung der Sämlinge den Samenhalter vorsichtig anheben und die Wurzel schnell in die flache, wasserhaltige Schale tauchen.Schneiden Sie die Primärwurzel jedes Sämlings unter Wasser 0,8 bis 1 Zentimeter unter dem basalsten Ende des Saatguthalters, um eine Versenkung zu verhindern, und legen Sie die frisch geschnittene Pflanze in eine Röhre mit Chemikalien ein. Wenn alle Sämlinge übertragen wurden, stellen Sie die Pflanzen unter die Wärmebildkamera und bestätigen Sie, dass sich alle Pflanzen im Sichtfeld der Kamera befinden. Um die Kamera auf die Oberfläche der Cotyledons zu fokussieren, drücken Sie Control Alt A und klicken Sie auf Film aufnehmen.Ein neues Fenster, das die Aufzeichnung bestätigt, wird geöffnet. Beenden Sie nach ein bis zwei Stunden die Aufnahme. Öffnen Sie für die Datenanalyse die richtigen seq-Dateien, und halten Sie den Film an.Klicken Sie auf den Messcursorbereich von Interesse drei mal drei Pixel und bewegen Sie die Maus über die Mitte eines Cotyledons der ersten Pflanze. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Bild, um das Cotyledon zu beschriften. Etikettieren Sie das zweite Cotyledon der ersten Pflanze auf die gleiche Weise.Wenn alle Pflanzen mit zwei Cursorn beschriftet wurden, klicken Sie auf das Symbol "Segmente von Interesse bearbeiten", und klicken Sie mit der linken Maustaste auf "Halten" und scrollen Sie, um alle Interessenbereiche auszuwählen. Rollen Sie als Nächstes mit der Maus über das Statistik-Viewer-Symbol, und wählen Sie das zeitliche Diagramm aus. Ein neues Fenster wird geöffnet.Führen Sie den Film aus, wird ein Diagramm mit den Daten gefüllt. Klicken Sie dann im Diagrammfenster auf den Doppelpfeil, um ein neues Menü zu öffnen, und klicken Sie auf das Symbol speichern, um die Daten zu speichern. Die Verwendung des roten Farbstoffs Erythrosin B zeigt die Fähigkeit von Chemikalien, innerhalb von 10 Minuten durch eine geschnittene Wurzel sichtbar in die Cotyledons eines Sonnenblumensämlings aufgenommen zu werden.Wenn Pflanzen mit ABA behandelt werden, wird innerhalb von 30 Minuten ein Anstieg der Blatttemperatur in Sonnenblumen-Cotyledons festgestellt, der mit der Abnahme der stomataalen Blende und der stomatalen Leitfähigkeit verbunden ist. Darüber hinaus wird eine erhöhte Blatttemperatur 15 Minuten nach der Behandlung mit 10 Mikromolaren ABA und 20 Minuten nach der Behandlung mit fünf mikromolaren ABA beobachtet, die zeigen, dass die Messung der Blatttemperatur durch Wärmebildgebung ein guter Proxy für die Messung der stomataalen Blende und Leitfähigkeit ist. In diesem repräsentativen Experiment ermöglicht eine standardscorebasierte statistische Behandlung die Identifizierung von Chemikalien, die das stomatoale Schließen oder Öffnen fördern.Um die Auswirkungen von Verbindungen auf die Transpiration zu messen, ist es wichtig, Pflanzen unter optimalen Bedingungen von Licht, Feuchtigkeit und Temperatur zu züchten. Dieses Protokoll kann auf die meisten Dicots angewendet werden. Es kann auch verwendet werden, um die Wirkung neuer Verbindungen auf die photosynthetische Leistung zu bewerten, z. B. durch Messung der Chlorophyllfluoreszenz.

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