Name: identification of novel regulators of plant transpiration by large-scale thermal imaging screening in helianthus annuus
Uploaded: 2020-01-30T15:00:00
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Il lavoro è stato sostenuto da Pomona College Start-up Funds e Hirsch Research Initiation Grants Fund (a FJ) così come dal Pomona College Molecular Biology Program attraverso lo Stellar Summer Research Assistant Program (al KG).

1. Coltivare le piante
<ol><li>Aggiungere uno strato di vermiculite fine di 4 cm ai vassoi di piantare standard da 10 x 20 pollici (254 mm x 501 mm) senza fori.</li>
	<li>Collocare i supporti dei semi (vedi Tabella dei materiali)a 2 cm di distanza nei vassoi dell'impianto.</li>
	<li>Riempire i supporti di semi con la vermiculite.</li>
	<li>Posizionare un seme di girasole con la sua estremità appuntita verso il basso in ogni supporto di semi, spingendo verso il basso in modo che metà del seme rimanga ...

<ol>
	<li>Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+adaptation+to+drought+stress.">Plant adaptation to drought stress.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gate+control:+guard+cell+regulation+by+microbial+stress.">Gate control: guard cell regulation by microbial stress.</a> The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).</li><li>Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+Plant's+Dilemma.">Revisiting the Plant's Dilemma.</a> Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).</li><li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+delivery+of+next+generation+therapeutics+from+high+throughput+screening+libraries.">Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+interrogation+of+natural+variation+uncovers+a+molecule+that+is+glycoactivated.">Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+inhibits+type+2C+protein+phosphatases+via+the+PYR/PYL+family+of+START+proteins.">Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins.</a> Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+PP2C+phosphatase+activity+function+as+abscisic+acid+sensors.">Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors.</a> Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).</li><li>Cao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ABA-mimicking+ligand+that+reduces+water+loss+and+promotes+drought+resistance+in+plants.">An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants.</a> Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).</li><li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dimeric+ABA+receptors+elicits+guard+cell+closure,+ABA-regulated+gene+expression,+and+drought+tolerance.">Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).</li><li>Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+agrochemical+ligands+for+engineered+abscisic+acid+receptors.">Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors.</a> Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).</li><li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+reveals+negative+regulation+of+abscisic+acid+signaling+by+a+plant+immune+response+pathway.">Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway.</a> Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Abscisic+Acid+Antagonists+Identified+with+Chemical+Array+Screening.">Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).</li><li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Chemical+Inhibitor+of+ABA+Signaling+Targets+All+ABA+Receptors.">A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).</li><li>Takeuchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+abscisic+acid+analogs+as+antagonists+of+PYL-PP2C+receptor+interactions.">Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions.</a> Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).</li><li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+modification+of+sunflower+oil+to+expand+its+industrial+value.">Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).</li><li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies:+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions.">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).</li><li>Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermography+to+explore+plant-environment+interactions.">Thermography to explore plant-environment interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).</li><li>Merlot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+infrared+thermal+imaging+to+isolate+Arabidopsis+mutants+defective+in+stomatal+regulation.">Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation.</a> The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).</li></ol>

Il numero di composti che possono essere testati in un dato giorno dipende principalmente (i) dallo spazio a controllo ambientale disponibile per far crescere le piante e per eseguire lo schermo, nonché dal numero (ii) del numero di individui che possono essere coinvolti nel passaggio 6 del protocollo. Raccomandiamo l'uso di tre repliche sperimentali per consolidare l'interpretazione dei risultati dopo il trattamento statistico. In una giornata tipo, da uno a due individui possono vagliare 60 composti in triplicati senz...

La tolleranza allo stress nelle piante è un tratto poligenico influenzato da una varietà di caratteristiche molecolari, cellulari, di sviluppo e fisiologiche e meccanismi1. Le piante in un ambiente fluttuante devono modulare continuamente i loro movimenti stomatali per bilanciare la domanda fotosintetica di carbonio pur mantenendo acqua sufficiente e impedendo l'invasione degli agenti patogeni2; tuttavia, i meccanismi con cui vengono prese queste "decisioni" di compromesso sono poco compresi3. L'introduzione di molecole bioattive nelle piante può modulare la loro fisiologia e aiutare a sondare nuovi meccanismi di regolazione.
Lo screening su larga scala di piccole molecole è una strategia efficace utilizzata nella scoperta di farmaci anti-cancro e nei saggi farmacologici per testare gli effetti fisiologici di centinaia-migliaia di molecole in un breve periodo di tempo4,5. Nella biologia vegetale, lo screening ad alto rendimento ha dimostrato la sua efficacia, ad esempio nell'identificazione della molecola sintetica pyrabactin6, così come nella scoperta del recettore a lungo ricercato dell'acido asscissico (ABA)7,8. Da allora, agonisti e antagonisti dei recettori ABA, e piccole molecole in grado di modulare l'espressione dei geni reporter ABA-inducibili sono stati identificati9,10, 11,12,13,14,15. Gli approcci di screening ad alta velocità attualmente disponibili per identificare piccoli composti che possono modulare l'apertura stomatica hanno alcuni inconvenienti: (i) i protocolli che ruotano intorno alla via di segnalazione delle sementi possono impedire l'identificazione di nuovi meccanismi indipendenti dall'ABA e (ii) strategie in vivo utilizzate per l'identificazione di piccole molecole bioattive si basano principalmente sui loro effetti fisiologici sulla germinazione delle sementi o sulla crescita delle sementi, e non sulla regolazione del sepira toro della pianta.
Inoltre, mentre ci sono molti modi per trattare le piante con molecole bioattive, la maggior parte di esse non sono adatte per uno studio su larga scala del movimento stomatale. In breve, le tre tecniche più comuni sono l'applicazione del fogliame spruzzando o immersione, il trattamento del sistema radicale e l'irrigazione delle radici. L'applicazione foliare non è compatibile con le metodologie più comuni e rapide per misurare l'apertura stomatale poiché la presenza di goccioline sulla superficie fogliare interferisce con la raccolta di dati su larga scala. I principali limiti dell'irrigazione delle radici sono i grandi requisiti di volume del campione, la potenziale ritenzione dei composti da parte di elementi nella rizosfera e la dipendenza dall'assorbimento attivo della radice.
Qui, presentiamo un metodo su larga scala per identificare nuovi composti che regolano la traspirazione delle piante che non implica necessariamente meccanismi di risposta alla siccità ABA o noti e consente un trattamento efficiente e affidabile delle piante. In questo sistema, le piante di Helianthus annuus vengono trattate utilizzando un approccio di alimentazione delle radici che consiste nel tagliare la radice primaria delle piantine coltivate idroponicamente e immergere il sito di taglio nella soluzione campione. Una volta trattata, l'effetto di ogni composto sulla traspirazione delle piante viene misurato utilizzando una termocamera a infrarossi. Poiché un fattore determinante della temperatura superficiale della foglia è il tasso di evaporazione dalla foglia, i dati di imaging termico possono essere direttamente correlati alla conduttanza stomatale. Il cambiamento relativo della temperatura del fogliare dopo il trattamento chimico fornisce quindi un mezzo diretto per quantificare la traspirazione dell'impianto.
H. annuus è una delle cinque più grandi colture di semi oleosi nel mondo16 e le scoperte fatte direttamente su questa pianta possono facilitare i futuri trasferimenti di tecnologia. Inoltre, le piantine H. annuus hanno cotiledoni grandi e piatte, così come una spessa radice primaria, che era ideale per lo sviluppo di questo protocollo. Tuttavia, questo metodo può essere facilmente adattato ad altre piante e una varietà di composti.
Questo protocollo può essere utilizzato per identificare efficacemente le molecole in grado di innescare la chiusura stomatale o promuovere l'apertura stomatale, che ha importanti implicazioni per la comprensione dei segnali che regolano la conduttanza stomatale e l'adattamento delle piante all'ambiente Sottolinea.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 plastic growing trays without drain holes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Standard 10 x 20 inch trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microtubes, capless</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-283NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abscisic acid (ABA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Active Aqua</td>
			<td>AAPA7.8L</td>
			<td>2 Outlets, 3W, 7.8 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airstones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical compound library</td>
			<td>MicroSource Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Natural Product Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creative Versa-Tool (wood burning tool)</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>9724549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dwarf Sunspot Sunflower seeds</td>
			<td>Outsidepride.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>200964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro)</td>
			<td>General Hydroponics</td>
			<td>GL51GH1421.31.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ResearchIR Software</td>
			<td>FLIR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board</td>
			<td>Insulfoam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedholders</td>
			<td>Araponics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Tub (plastic utility tub)</td>
			<td>Maccourt</td>
			<td>ST3608</td>
			<td>36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>FLIR-T62101</td>
			<td>Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water filter</td>
			<td>SunSun</td>
			<td>HW-304B Pro Canister Filter</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel regulators of plant transpiration by large-scale thermal imaging screening in helianthus annuus

L'adattamento delle piante alle sollecitazioni biotiche e abiotiche è regolato da una varietà di fattori, tra i quali la regolazione dell'apertura stomatica in risposta al deficit idrico o agli agenti patogeni svolge un ruolo cruciale. L'identificazione di piccole molecole che regolano il movimento stomatale può quindi contribuire a comprendere la base fisiologica con cui le piante si adattano al loro ambiente. Gli approcci di screening su larga scala che sono stati utilizzati per identificare i regolatori del movimento stomatale hanno potenziali limitazioni: alcuni si basano fortemente sul percorso di segnalazione dell'ormone dell'acido asscisico (ABA), escludendo quindi i meccanismi indipendenti dall'ABA, mentre altri si basano sull'osservazione di effetti fisiologici indiretti e a lungo termine come la crescita e lo sviluppo delle piante. Il metodo di screening qui presentato consente il trattamento su larga scala di piante con una biblioteca di sostanze chimiche accoppiate con una quantificazione diretta della loro traspirazione mediante imaging termico. Poiché l'evaporazione dell'acqua attraverso la traspirazione si traduce nel raffreddamento della superficie delle foglie, l'imaging termico fornisce un approccio non invasivo per studiare i cambiamenti nella conduttanza stomatale nel tempo. In questo protocollo, le piantine Helianthus annuus vengono coltivate idroponically e quindi trattate mediante alimentazione della radice, in cui la radice primaria viene tagliata e immersa nella sostanza chimica testata. L'imaging termico seguito dall'analisi statistica delle variazioni di temperatura cotiledonaria nel tempo consente l'identificazione di molecole bioattive che modulano l'apertura stomatale. I nostri esperimenti proof-of-concept dimostrano che una sostanza chimica può essere trasportata dalla radice tagliata al cotileno della piantina di girasole entro 10 minuti. Inoltre, quando le piante vengono trattate con ABA come un controllo positivo, un aumento della temperatura superficiale delle foglie può essere rilevato in pochi minuti. Il nostro metodo consente così l'identificazione efficiente e rapida di nuove molecole che regolano l'apertura stomatale.

Un esperimento con la tintura rossa Erythrosine B (0,8 kDa) dimostra la capacità delle sostanze chimiche di essere visibilmente assorbite attraverso una radice tagliata nei cotiledoni di una piantina di girasole entro 10 minuti (Figura 1).
Quando le piante vengono trattate con ABA, viene rilevato un aumento della temperatura delle foglie nei cotiledoni di girasole in pochi minuti. Questo aumento de...

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Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Forniamo un metodo per identificare i modulatori della traspirazione fogliare mediante lo screening su larga scala di una libreria composta.

Identificazione di nuovi regolatori della traspirazione vegetale mediante screening termico su larga scala in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Questo protocollo utilizza la termografia per identificare nuovi composti in grado di regolare la traspirazione delle piante. Questa tecnica è versatile per quanto riguarda le specie vegetali che possono essere testate, la natura del composto e il tipo di imaging. Per impostare le piante per la coltivazione, aggiungere prima uno strato di vermiculite fine dello spessore di quattro centimetri ai vassoi di piante standard da 10 per 20 pollici senza fori e posizionare i portapei a due centimetri di distanza nei vassoi.Riempire i portasementi con vermiculite e posizionare un seme di girasole puntato verso il basso in ogni supporto in modo che metà del seme rimanga esposto. Quando tutti i semi sono stati placcati, coprili con altri due centimetri di vermiculite fine e nebbia con acqua dall'alto. Dopo un'ora, coprire i vassoi con coperchi e posizionare le piante in una camera di crescita in una serra.Per impostare il sistema idroponico, riempire un contenitore di dimensioni adeguate adatto alla coltivazione idroponica delle piante con acqua distillata e aggiungere fertilizzante idroponico generale come indicato dal produttore. Quindi utilizzare pompe aria e acqua per aerare la soluzione idroponica risultante con movimento costante. Per preparare i galleggianti idroponici, tagliare un foglio di schiuma di polistirolo espanso spessa due centimetri alle dimensioni del contenitore e utilizzare lo strumento di combustione del legno per creare fori di diametro da uno a due centimetri nella schiuma.Quindi posizionare i galleggianti nel sistema idroponica. Cinque giorni dopo la semina, estrarre delicatamente le piantine dalla vermiculite. Posizionare immediatamente le piantine in un contenitore d'acqua per 30 minuti per rimuovere la vermiculite in eccesso e ammorbidire i pericarpi rimanenti.Quando le radici primarie emergenti sono visibili, rimuovere i pericarpi a mano se necessario. Trasferire le piantine all'interno dei portasementi nei galleggianti in schiuma di polistirolo preparati nel sistema idroponico. Far crescere le piante in idroponica per due giorni.Lasciare che le sostanze chimiche della piccola libreria composta si scongelno a temperatura ambiente. Etichettare sei microtubi a due millilitri senza cappuccio per il trattamento di controllo negativo, tre tubi per il trattamento ABA e gli ultimi 60 tubi per l'analisi degli effetti delle 20 sostanze chimiche di interesse per il triplicato. Aggiungere 10 microlitri di ciascuna sostanza chimica in ciascuna provetta, 10 microlitri di 10 millimolare ABA e solfossido di dimetile nei tre tubi ABA e 10 microlitri di solfossido di dimetile nei sei tubi di controllo.Quindi mescolare con cura 990 microlitri di idrossido di potassio MES da 10 millimolare in ogni tubo. Posizionare i tubi in un rack di tubi con il controllo positivo e negativo e tubi sperimentali distribuiti uniformemente all'interno del rack per tenere conto della distorsione correlata alla posizione. Per configurare la termocamera, montare prima la fotocamera su un supporto per copia e collegare tutti i cavi a un laptop.Accendere la fotocamera prima di accendere il laptop e aprire il software di analisi della termografia. Per regolare i parametri di registrazione, capondere il mouse sul pulsante Registra per consentire la selezione dell'icona chiave inglese in Impostazioni record e selezionare la modalità e le opzioni di record appropriate. Per il trattamento delle piantine, sollevare con cura il portasementi e immergere rapidamente la radice nel piatto poco profondo contenente acqua.Tagliare la radice primaria di ogni piantina sott'acqua da 0,8 a un centimetro sotto l'estremità più basale del portasementi per prevenire la capitazione e inserire la pianta appena tagliata in un unico tubo di sostanze chimiche. Una volta trasferite tutte le piantine, posizionare le piante sotto la termocamera e confermare che tutte le piante si trovano all'interno del campo visivo della telecamera. Per mettere a fuoco la fotocamera sulla superficie dei cotyledon, premete Ctrl Alt A e fate clic su Registra filmato .Si aprirà una nuova finestra che conferma la registrazione. Dopo una o due ore, interrompere la registrazione. Per l'analisi dei dati, aprite i file seq corretti e sospendete il filmato.Fare clic sull'icona aggiungi un cursore di misura di interesse tre per tre pixel e spostare il mouse al centro di un cotiledone della prima pianta. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull'immagine per etichettare il cotiledone. Etichettare il secondo cotiledone del primo impianto allo stesso modo.Quando tutte le piante sono state etichettate con due cursori, fare clic sull'icona modifica aree di interesse e fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Hold e scorrere per selezionare tutte le aree di interesse. Quindi, rotolare il mouse sull'icona del visualizzatore statistico e selezionare il plottaggio temporale. Si aprirà una nuova finestra.Esegui il filmato, un grafico si riempirà con i dati. Quindi nella finestra del grafico fare clic sulla doppia freccia per aprire un nuovo menu e fare clic sull'icona salva per salvare i dati. L'uso della tintura rossa erytrosina B dimostra la capacità delle sostanze chimiche di essere visibilmente assorbite attraverso una radice tagliata nei cotyledon di una piantina di girasole entro 10 minuti.Quando le piante vengono trattate con ABA, viene rilevato un aumento della temperatura delle foglie nei cotyledon di girasole entro 30 minuti che è associato alla diminuzione dell'apertura stomatale e alla conduttanza stomatale. Inoltre, si osserva un aumento della temperatura fogliare 15 minuti dopo il trattamento con ABA micromolare e 20 minuti dopo il trattamento con cinque ABA micromolare che dimostrano che la misurazione della temperatura fogliare mediante imaging termico è un buon proxy per misurare l'apertura stomatale e la conduttanza. In questo esperimento rappresentativo, un trattamento statistico standard basato sul punteggio consente l'identificazione di sostanze chimiche che promuovono la chiusura o l'apertura stomatale.Per misurare gli effetti dei composti sulla traspirazione, è importante coltivare piante in condizioni ottimali di luce, umidità e temperatura. Questo protocollo può essere applicato alla maggior parte dei dicot. Può anche essere utilizzato per valutare l'effetto di nuovi composti sulle prestazioni fotosintetiche, ad esempio misurando la fluorescenza della clorofilla.

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