Name: identification of novel regulators of plant transpiration by large-scale thermal imaging screening in helianthus annuus
Uploaded: 2020-01-30T15:00:00
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El trabajo fue apoyado por Pomona College Start-up Funds y Hirsch Research Initiation Grants Fund (to FJ) así como el Programa de Biología Molecular de Pomona College a través del Programa Estelar de Asistente de Investigación de Verano (a KG).

1. Cultivo de las plantas
<ol><li>Agregue una capa de vermiculita fina de 4 cm de espesor a las bandejas de planta estándar de 10 pulg. x 20 pulgadas (254 mm x 501 mm) sin orificios.</li>
	<li>Coloque los soportes de semillas (ver Tabla de Materiales)2 cm de distancia en las bandejas de la planta.</li>
	<li>Llene los soportes de semillas con vermiculita.</li>
	<li>Coloque una semilla de girasol con su extremo puntiagudo hacia abajo en cada soporte de semilla, empujando hacia abajo para que la mitad de...

<ol>
	<li>Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+adaptation+to+drought+stress.">Plant adaptation to drought stress.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gate+control:+guard+cell+regulation+by+microbial+stress.">Gate control: guard cell regulation by microbial stress.</a> The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).</li><li>Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+Plant's+Dilemma.">Revisiting the Plant's Dilemma.</a> Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).</li><li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+delivery+of+next+generation+therapeutics+from+high+throughput+screening+libraries.">Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+interrogation+of+natural+variation+uncovers+a+molecule+that+is+glycoactivated.">Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+inhibits+type+2C+protein+phosphatases+via+the+PYR/PYL+family+of+START+proteins.">Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins.</a> Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+PP2C+phosphatase+activity+function+as+abscisic+acid+sensors.">Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors.</a> Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).</li><li>Cao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ABA-mimicking+ligand+that+reduces+water+loss+and+promotes+drought+resistance+in+plants.">An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants.</a> Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).</li><li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dimeric+ABA+receptors+elicits+guard+cell+closure,+ABA-regulated+gene+expression,+and+drought+tolerance.">Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).</li><li>Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+agrochemical+ligands+for+engineered+abscisic+acid+receptors.">Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors.</a> Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).</li><li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+reveals+negative+regulation+of+abscisic+acid+signaling+by+a+plant+immune+response+pathway.">Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway.</a> Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Abscisic+Acid+Antagonists+Identified+with+Chemical+Array+Screening.">Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).</li><li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Chemical+Inhibitor+of+ABA+Signaling+Targets+All+ABA+Receptors.">A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).</li><li>Takeuchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+abscisic+acid+analogs+as+antagonists+of+PYL-PP2C+receptor+interactions.">Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions.</a> Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).</li><li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+modification+of+sunflower+oil+to+expand+its+industrial+value.">Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).</li><li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies:+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions.">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).</li><li>Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermography+to+explore+plant-environment+interactions.">Thermography to explore plant-environment interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).</li><li>Merlot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+infrared+thermal+imaging+to+isolate+Arabidopsis+mutants+defective+in+stomatal+regulation.">Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation.</a> The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).</li></ol>

El número de compuestos que se pueden probar en un día determinado depende principalmente de (i) el espacio ambientalmente controlado disponible para el cultivo de las plantas y para realizar la pantalla, así como (ii) el número de individuos que pueden participar en el paso 6 del protocolo. Recomendamos el uso de tres réplicas experimentales para consolidar la interpretación de los resultados después del tratamiento estadístico. En un día típico, uno a dos individuos pueden examinar 60 compuestos en triplicado...

La tolerancia al estrés en las plantas es un rasgo poligénico influenciado por una variedad de características y mecanismos moleculares, celulares, de desarrollo y fisiológicos1. Las plantas en un entorno fluctuante necesitan modular continuamente sus movimientos estomatales para equilibrar la demanda fotosintética de carbono manteniendo el agua suficiente y previniendo la invasión de patógenos2; sin embargo, los mecanismos por los cuales se toman estas "decisiones" de compensación se entienden mal3. La introducción de moléculas bioactivas en las plantas puede modular su fisiología y ayudar a sondear nuevos mecanismos de regulación.
El cribado a gran escala de moléculas pequeñas es una estrategia eficaz utilizada en el descubrimiento de fármacos contra el cáncer y ensayos farmacológicos para probar los efectos fisiológicos de cientos a miles de moléculas en un corto período de tiempo4,5. En biología vegetal, el cribado de alto rendimiento ha demostrado su eficacia, por ejemplo, en la identificación de la molécula sintética pyrabactin6, así como el descubrimiento del receptor de ácido abscístico (ABA)7,8. Desde entonces, agonistas y antagonistas de los receptores ABA, y pequeñas moléculas capaces de modular la expresión de genes reporteros inducibles ABA han sido identificados9,10,11,12,13,14,15. Los enfoques de cribado de alto rendimiento disponibles actualmente para identificar pequeños compuestos que pueden modular la apertura estomatal tienen algunos inconvenientes: (i) los protocolos que giran alrededor de la vía de señalización ABA pueden impedir la identificación de nuevos mecanismos independientes de aba, y (ii) las estrategias in vivo utilizadas para la identificación de moléculas pequeñas bioactivas dependen principalmente de sus efectos fisiológicos sobre la germinación de semillas o el crecimiento de la plántula, y no en la regulación de la transpiración vegetal por se.
Además, aunque hay muchas maneras de tratar las plantas con moléculas bioactivas, la mayoría de ellas no son adecuadas para un estudio a gran escala del movimiento estomatal. En resumen, las tres técnicas más comunes son la aplicación foliar mediante pulverización o inmersión, tratamiento del sistema radicular y riego radicular. La aplicación foliar no es compatible con las metodologías más comunes y rápidas para medir la apertura estomatal ya que la presencia de gotas en la superficie de la hoja interfiere con la recopilación de datos a gran escala. Las principales limitaciones del riego radicular son los grandes requisitos de volumen de muestra, la retención potencial de los compuestos por elementos en la rizosfera, y la dependencia de la toma activa de raíces.
Aquí, presentamos un método a gran escala para identificar nuevos compuestos que regulan la transpiración de plantas que no necesariamente implican mecanismos DE respuesta a la sequía ABA o conocidos y permite un tratamiento eficiente y confiable de las plantas. En este sistema, las plantas de Helianthus annuus son tratadas utilizando un enfoque de alimentación de raíces que consiste en cortar la raíz primaria de las plántulas cultivadas hidropónicamente y sumergir el sitio de corte en la solución de la muestra. Una vez tratado, el efecto de cada compuesto en la transpiración de las plantas se mide utilizando una cámara termográfica infrarroja. Dado que un determinante importante de la temperatura de la superficie de la hoja es la tasa de evaporación de la hoja, los datos de imágenes térmicas pueden correlacionarse directamente con la conductancia estomatal. El cambio relativo en la temperatura foliar después del tratamiento químico proporciona así un medio directo para cuantificar la transpiración de la planta.
H. annuus es uno de los cinco mayores cultivos de semillas olea-oilenales en el mundo16 y los descubrimientos realizados directamente en esta planta pueden facilitar futuras transferencias de tecnología. Además, las plántulas H. annuus tienen cotiledón grande y plano, así como una gruesa raíz primaria, que era ideal para el desarrollo de este protocolo. Sin embargo, este método se puede adaptar fácilmente a otras plantas y una variedad de compuestos.
Este protocolo se puede utilizar para identificar eficazmente moléculas capaces de desencadenar el cierre estomatal o promover la apertura estomatal, lo que tiene implicaciones importantes para entender las señales que regulan la conductividad estomatal y la adaptación de las plantas al medio ambiente Tensiones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 plastic growing trays without drain holes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Standard 10 x 20 inch trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microtubes, capless</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-283NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abscisic acid (ABA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>Active Aqua</td>
			<td>AAPA7.8L</td>
			<td>2 Outlets, 3W, 7.8 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airstones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical compound library</td>
			<td>MicroSource Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Natural Product Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creative Versa-Tool (wood burning tool)</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>9724549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dwarf Sunspot Sunflower seeds</td>
			<td>Outsidepride.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>200964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro)</td>
			<td>General Hydroponics</td>
			<td>GL51GH1421.31.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ResearchIR Software</td>
			<td>FLIR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board</td>
			<td>Insulfoam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedholders</td>
			<td>Araponics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Tub (plastic utility tub)</td>
			<td>Maccourt</td>
			<td>ST3608</td>
			<td>36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>FLIR-T62101</td>
			<td>Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water filter</td>
			<td>SunSun</td>
			<td>HW-304B Pro Canister Filter</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel regulators of plant transpiration by large-scale thermal imaging screening in helianthus annuus

La adaptación de las plantas a las tensiones bióticas y abióticas se rige por una variedad de factores, entre los que la regulación de la apertura estomatal en respuesta al déficit de agua o patógenos juega un papel crucial. La identificación de moléculas pequeñas que regulan el movimiento estomatal puede contribuir, por lo tanto, a comprender la base fisiológica por la que las plantas se adaptan a su entorno. Los enfoques de cribado a gran escala que se han utilizado para identificar los reguladores del movimiento estomatal tienen limitaciones potenciales: algunos dependen en gran medida de la vía de señalización hormonal del ácido abscés (ABA), excluyendo así los mecanismos independientes de la ABA, mientras que otros dependen de la observación de efectos fisiológicos indirectos a largo plazo como el crecimiento y desarrollo de las plantas. El método de cribado presentado aquí permite el tratamiento a gran escala de plantas con una biblioteca de productos químicos junto con una cuantificación directa de su transpiración por imágenes térmicas. Dado que la evaporación del agua a través de la transpiración da como resultado un enfriamiento de la superficie de la hoja, las imágenes térmicas proporcionan un enfoque no invasivo para investigar los cambios en la conductancia estomatal a lo largo del tiempo. En este protocolo, las plántulas Helianthus annuus se cultivan hidropónicamente y luego se tratan mediante la alimentación de las raíces, en la que la raíz primaria se corta y se sumerge en el producto químico que se está probando. Las imágenes térmicas seguidas de un análisis estadístico de los cambios de temperatura cotiledóres a lo largo del tiempo permiten la identificación de moléculas bioactivas que modulan la apertura estomatal. Nuestros experimentos de prueba de concepto demuestran que un producto químico se puede llevar desde la raíz cortada hasta el cotilería de la plántula de girasol en 10 minutos. Además, cuando las plantas son tratadas con ABA como un control positivo, se puede detectar un aumento en la temperatura de la superficie de la hoja en cuestión de minutos. Nuestro método permite así la identificación eficiente y rápida de nuevas moléculas que regulan la apertura estomatal.

Un experimento con el tinte rojo Eritrosina B (0,8 kDa) demuestra la capacidad de los productos químicos para ser absorbidos visiblemente a través de una raíz cortada en los cotiledones de una plántula de girasol en 10 minutos(Figura 1).
Cuando las plantas son tratadas con ABA, se detecta un aumento en la temperatura de las hojas en los cotilediones de girasol en cuestión de minutos. Este aumen...

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Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Proporcionamos un método para identificar moduladores de transpiración foliar mediante cribado a gran escala de una biblioteca compuesta.

Identificación de nuevos reguladores de la transpiración de plantas mediante el cribado térmico de imágenes a gran escala en Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Este protocolo utiliza imágenes térmicas para identificar nuevos compuestos capaces de regular la transpiración de la planta. Esta técnica es versátil con respecto a las especies vegetales que se pueden probar, la naturaleza del compuesto y el tipo de imagen. Para configurar las plantas para el cultivo, primero agregue una capa de cuatro centímetros de espesor de vermiculita fina a bandejas de plantas estándar de 10 por 20 pulgadas sin agujeros y coloque los soportes de semillas a dos centímetros de distancia en las bandejas.Llene los soportes de semillas con vermiculita y coloque un extremo puntiagudo de semilla de girasol hacia abajo en cada soporte para que la mitad de la semilla permanezca expuesta. Cuando todas las semillas hayan sido chapadas, cúbralas con dos centímetros adicionales de vermiculita fina y niebla con agua desde arriba. Después de una hora, cubra las bandejas con tapas y coloque las plantas en una cámara de crecimiento en un invernadero.Para instalar el sistema hidropónico, llene un recipiente de tamaño adecuado para el cultivo de plantas hidropónicamente con agua destilada y agregue fertilizante hidropónico general según lo indicado por el fabricante. A continuación, utilice bombas de aire y agua para airear la solución hidropónica resultante con movimiento constante. Para preparar los flotadores hidropónicos, corte una lámina de espuma de poliestireno expandido de dos centímetros de espesor a las dimensiones del contenedor y utilice la herramienta de quema de madera para hacer agujeros de uno a dos centímetros de diámetro en la espuma.A continuación, coloque los flotadores en el sistema hidropónico. Cinco días después de la siembra, tire suavemente de las plántulas de la vermiculita. Coloque inmediatamente las plántulas en un recipiente de agua durante 30 minutos para eliminar el exceso de vermiculita y suavizar los pericarpos restantes.Cuando las raíces primarias emergentes sean visibles, retire los pericarpos a mano según sea necesario. Transfiera las plántulas dentro de los soportes de semillas en los flotadores de espuma de poliestireno preparados en el sistema hidropónico. Cultivar las plantas en hidroponía durante dos días.Deje que los productos químicos de la pequeña biblioteca de compuestos se descongelen a temperatura ambiente. Etiqueta seis microtubos sin tapa y dos mililitros para el tratamiento de control negativo, tres tubos para el tratamiento ABA y los 60 tubos finales para el análisis de los efectos de los 20 productos químicos de interés en el triplicado. Añadir 10 microlitros de cada producto químico en cada uno de los tubos de ensayo, 10 microlitros de 10 MILilitros ABA y dimetil sulfóxido en los tres tubos ABA, y 10 microlitros de dimetil sulfóxido en los seis tubos de control.A continuación, mezcle cuidadosamente 990 microlitros de 10 mililitros de hidróxido de potasio MES en cada tubo. Coloque los tubos en un portatubos con el control positivo y negativo y los tubos experimentales distribuidos uniformemente dentro del bastidor para tener en cuenta el sesgo relacionado con la posición. Para configurar la cámara termográfica, primero monte la cámara en un soporte de copia y conecte todos los cables a un portátil.Encienda la cámara antes de encender el portátil y abra el software de análisis de imágenes térmicas. Para ajustar los parámetros de grabación, pase el ratón sobre el botón Grabar para permitir la selección del icono de llave inglesa en Configuración de grabación y seleccione el modo de grabación y las opciones adecuados. Para el tratamiento de las plántulas, levante cuidadosamente el soporte de semillas y sumerja rápidamente la raíz en el plato poco profundo que contiene agua.Cortar la raíz primaria de cada plántula bajo el agua 0,8 a un centímetro por debajo del extremo más basal del soporte de semilla para evitar la capitación e insertar la planta recién cortada en un tubo de productos químicos. Cuando todas las plántulas hayan sido transferidas, coloque las plantas bajo la cámara termográfica y confirme que todas las plantas están dentro del campo de visión de la cámara. Para enfocar la cámara en la superficie de los cotiledones, pulse Control Alt A y haga clic en Grabar una película.Se abrirá una nueva ventana que confirme la grabación. Después de una o dos horas, detenga la grabación. Para el análisis de datos, abra los archivos seq correctos y detenga la película.Haga clic en el icono Añadir una región de cursor de medición de interés de tres por tres píxeles y mueva el ratón sobre el centro de un cotiledone de la primera planta. Haga clic izquierdo en la imagen para etiquetar el cotiledone. Etiquetar el segundo cotiledone de la primera planta de la misma manera.Cuando todos los plantas se hayan etiquetado con dos cursores, haga clic en el icono editar regiones de interés y haga clic con el botón izquierdo del 18 y desplácese para seleccionar todas las regiones de interés. A continuación, pase el ratón sobre el icono del visor de estadísticas y seleccione el trazado temporal. Se abrirá una nueva ventana.Ejecute la película, un gráfico se llenará con los datos. A continuación, en la ventana del gráfico, haga clic en la flecha doble para abrir un nuevo menú y haga clic en el icono de guardar para guardar los datos. El uso del tinte rojo eritrosina B demuestra la capacidad de los productos químicos para ser absorbido visiblemente a través de una raíz cortada en los cotiledones de una plántula de girasol dentro de 10 minutos.Cuando las plantas son tratadas con ABA, se detecta un aumento en la temperatura de las hojas en los cotiledones de girasol dentro de los 30 minutos que se asocia con la disminución de la abertura estomatal y la conductancia estomatal. Además, se observa un aumento de la temperatura foliar 15 minutos después del tratamiento con 10 ABA micromolar y 20 minutos después del tratamiento con cinco ABA micromolares que demuestran que la medición de la temperatura de la hoja por imágenes térmicas es un buen proxy para medir la apertura y la conductividad estomatal. En este experimento representativo, un tratamiento estadístico estándar basado en la puntuación permite la identificación de productos químicos que promueven el cierre o la apertura del estomatal.Para medir los efectos de los compuestos en la transpiración, es importante cultivar las plantas en condiciones óptimas de luz, humedad y temperatura. Este protocolo se puede aplicar a la mayoría de los dicots. También se puede utilizar para evaluar el efecto de nuevos compuestos en el rendimiento fotosintético, por ejemplo midiendo la fluorescencia de clorofila.

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