Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

ودعمت البحوث في مختبر رايت المتعلقة ARP/MARP من قبل صندوق البحوث في اونتاريو والمعاهد الكندية للمنح البحوث الصحية (FRN-148463). نود ان نعترف سومير تشو للمساعدة في توسيع وتنظيم مكتبه ARP.

1. اعداد المكتبة القولونية الأسهم الجلسرين (من أجار slants)
<ol><li>خط السلالات ARP/MARP e. القولونية من مرق lysogeny (LB) أجار التعرجات علي اطباق بيتري التي تحتوي علي أجار LB وعلامة اختيار المناسبة (الجدول 1).</li>
	<li>اعداد الثقافات لكل من سلالات e. القولونية عن طريق تطعيم 3 مل من LB تحتوي ?...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

يمكن تطبيق البروتوكول الموصوف أعلاه علي كل من اكتشاف المركبات المضادة للميكروبات الجديدة والمواد المضادة التي يمكن استخدامها بالاقتران مع الحيوية الموجودة لإنقاذ نشاطها. منصة يستفيد من خصوصية عاليه الركيزة من أليات المقاومة والمضادات الحيوية الخاصة بهم ، إلى مركبات التخلص من النفط داخ...

منذ اكتشاف البنسلين في 1928 ، أثبتت المنتجات الطبيعية المستمدة من الكائنات المجهرية البيئية انها مصدر غني للمركبات المضادة للميكروبات1. وتستمد حوالي 80 ٪ من المضادات الحيوية المنتجات الطبيعية من البكتيريا من جنس العقديات وغيرها من الاكاكتيميتيز ، في حين يتم إنتاج 20 ٪ المتبقية من الأنواع الفطرية1. بعض السقالات المضادات الحيوية الأكثر شيوعا المستخدمة في العيادة مثل β-اكتام, التتراسيكلين, rifamycins, و الامينوغليكوسيدس, كانت في الأصل معزولة عن الميكروبات2. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع البكتيريا المقاومة للادويه المتعددة ، أصبحت اللوحة الحالية من المضادات الحيوية اقل فعاليه في العلاج3،4. وتشمل هذه العوامل المسببة للامراض "ESKAPE" (اي ، فانكوميسين مقاومه المكورات المعوية والمكورات العنقوديةالذهبية المقاومة للاكتام ، klebsiella الرئوية، الزائفة الزنجاريه، والانتيفه باومانيي، و المعوية sp.) ، وهي مجموعه فرعيه من البكتيريا التي تعتبر مرتبطة باعلي المخاطر من قبل عدد من السلطات الصحية العامة الرئيسية مثل منظمه الصحة العالمية3،4،5. ظهور وانتشار العالمي لهذه الممرضات المدرة للادويه يؤدي إلى حاجه مستمرة للمضادات الحيوية رواية3,4,5. ومما يؤسف له ان العقدين الماضيين اثبتا ان اكتشاف المضادات الحيوية الجديدة من المصادر الميكروبية يزداد صعوبة6. وتشمل النهج الحالية لاكتشاف المخدرات الفحص عاليه الانتاجيه للمركبات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك المنتجات الطبيعية المكتبات استخراج ، مما يسمح للاف من مقتطفات ليتم اختبارها في وقت معين2. ومع ذلك ، وبمجرد الكشف عن النشاط المضاد للميكروبات ، فان الخطوة التالية هي تحليل محتويات مستخرج الخام لتحديد المكون النشط والقضاء علي تلك التي تحتوي علي مركبات معروفه أو زائده عن الحاجة7،8. هذه العملية ، التي يشار اليها باسم dereplication ، أمر حيوي لمنع و/أو خفض كبير في الوقت المستغرق في أعاده اكتشاف المضادات الحيوية المعروفة7،9. علي الرغم من ان خطوه ضرورية في اكتشاف المخدرات المنتج الطبيعي ، dereplication المعروف شاقه وكثيفه الموارد10.
من اي وقت مضي منذ beutler et al. أولا صاغ مصطلح "dereplication" ، بذلت جهود واسعه لوضع استراتيجيات مبتكره للتعرف السريع علي المضادات الحيوية المعروفة11،12. اليوم الاداات الأكثر شيوعا المستخدمة في dereplication تشمل النظم التحليلية الكروماتوغرافي مثل اللوني السائل عاليه الأداء ، والطيف الكتلي ، والنووية الرنين المغناطيسي القائم علي طرق الكشف11،13. ومن المؤسف ان كلا من هذه الأساليب يتطلب استخدام معدات تحليليه باهظه التكاليف وتفسيرات متطورة للبيانات.
في محاولة لتطوير طريقه dereplication التي يمكن تنفيذها بسرعة دون المعدات المتخصصة ، انشانا منصة مقاومه المضادات الحيوية (ARP)10. يمكن استخدام ARP لاكتشاف المواد المضادة للمضادات الحيوية ، وتنميط مركبات المضادات الحيوية الجديدة ضد أليات المقاومة المعروفة ، و dereplication من المضادات الحيوية المعروفة في مقتطفات مشتقه من البكتيريا المخاطية والميكروبات الأخرى. هنا ، ونحن نركز علي تطبيقه في dereplication المضادات الحيوية. يستخدم ARP مكتبه من سلالات القولونية ايزوسيكيا التي تعبر عن جينات المقاومة الفردية التي تكون فعاله ضد المضادات الحيوية الأكثر شيوعا أعاده اكتشاف14,15. عندما تزرع مكتبه e. القولونية في وجود كائن ثانوي المنتجة المستقلب, يمكن استنتاج هويه المجمع عن طريق نمو السلالات e. القولونية التي تعبر عن الجينات المقاومة المرتبطة بها10. عندما تم الإبلاغ عن ARP لأول مره ، كانت المكتبة تتكون من > 40 جينات تمنح مقاومه لفئات المضادات الحيوية 16. تم تصميم قالب dereplication الأصلي لتشمل مجموعه فرعيه من جينات المقاومة لكل فئة المضادات الحيوية لتوفير المعلومات المتعلقة بالمضادات الحيوية فئة فرعيه خلال عمليه dereplication. اليوم ، يتكون ARP من > 90 الجينات التي تمنح مقاومه لفئات المضادات الحيوية 18. باستخدام لدينا مجموعه واسعه من الجينات المقاومة ، وقد تم تطوير قالب dereplication الثانوية ويعرف باسم منصة مقاومه المضادات الحيوية الحد الأدنى (MARP). تم إنشاء هذا القالب للقضاء علي التكرار الجيني وببساطه توفير المعلومات المتعلقة بفئة المضادات الحيوية العامة التي ترتبط المستقلب dereplicated. بالاضافه إلى ذلك ، فان قالب MARP تمتلك كل من النوع البري وسلاله القصور الفائقة/efflux من e. كولاي BW25113 (e. كولاي BW25113 ΔbambΔtolc)، مقارنه بالتجسيد الأصلي لل ARP ، والتي فقط يستخدم سلاله فرط نفاذيه. هذا الجانب فريدة من نوعها يخلق الأنماط الظاهرية اضافيه اثناء dereplication ، مما يدل علي قدره المركبات لعبور الغشاء الخارجي للبكتيريا سلبيه الجرام. هنا ، ونحن وصف بروتوكول قويه ليتم اتباعها عند المراوغة مع اما ARP و/أو MARP ، تسليط الضوء علي الخطوات الأكثر اهميه لاتباعها ، ومناقشه مختلف النتائج الممكنة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

واحده من التحديات الرئيسية في البحث عن المضادات الحيوية الجديدة من مقتطفات المنتجات الطبيعية هو أعاده اكتشاف المركبات المشتركة. للتصدي لهذا التحدي ، يتم تنفيذ dereplication ، وهي عمليه تحديد المركبات المعروفة ، علي عينات من الفائدة. وأساليب الفصل بين الطرق ، مثل الانفصال التحليلي الذي يعقبه قياس الطيف الكتلي ، تستغرق وقتا طويلا وتستهلك الموارد بكثافة. لتحسين عمليه dereplication ، قمنا بتطوير منصة مقاومه المضادات الحيوية (ARP). و ARP هي مكتبه من حوالي 100 الجينات مقاومه المضادات الحيوية التي تم استنساخها بشكل فردي في القولونية. هذه المجموعة سلاله لديها العديد من التطبيقات ، بما في ذلك وسيله فعاله من حيث التكلفة وطريقه سهل لdereplication المضادات الحيوية. وتنطوي هذه العملية علي تخمير الميكروبات المنتجة للمضادات الحيوية علي سطح اطباق بتري المستطيلة التي تحتوي علي وسط صلب ، مما يسمح بإفراز ونشر نواتج الأيض الثانوية من خلال الوسط. بعد فتره التخمير 6 أيام, يتم أزاله الكتلة الحيوية الميكروبية, ويضاف أجار رقيقه تراكب إلى طبق بيتري لخلق سطح أملس وتمكين نمو سلالات المؤشر e. كولاي . ثم يتم تثبيت مجموعتنا من سلالات ARP علي سطح طبق بيتري الذي يحتوي علي المضادات الحيوية. يتم احتضان اللوحة التالية بين عشيه وضحيها للسماح للنمو e. كولاي علي سطح التراكب. فقط السلالات التي تحتوي علي مقاومه للمضادات حيوية معينه (أو فئة) تنمو علي هذا السطح مما يتيح التعرف السريع علي المجمع المنتج. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح للتعرف علي منتجي المضادات الحيوية المعروفة وكوسيلة للتعرف علي تلك التي تنتج المركبات الجديدة.

تم الحصول علي النتائج التالية عندما تم تجميع مجموعه من سلالات الفوائد المنتجة للمضادات الحيوية باستخدام ARP و/أو MARP.
ويرد في الشكل 1رسم تخطيطي لسير العمل الخاص بالdereplication ARP/marp ، وتظهر خرائط لوحه المكتبة في الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

نحن وصف منصة التي تستخدم مكتبه من المضادات الحيوية القولونية المقاومة للمضادات الحيوية للحصول علي dereplication من المضادات. يمكن استنتاج هويه المضادات الحيوية التي تنتجها البكتيريا أو الفطريات من خلال نمو e. كولاي التي تعبر عن جين المقاومة الخاصة بها. وهذه المنصة فعاله اقتصاديا وذات كفاءه زمنيه.

المضادات الحيوية Dereplication باستخدام منصة مقاومه المضادات الحيوية

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

بروتوكولنا مهم لأنه يسمح بكل من المضادات الحيوية المعروفة فعالة من حيث التكلفة وفي الوقت المناسب دون استخدام المعدات المتخصصة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تخصيص القالب. وهذا يعني أن الفرد يمكن أن خياط الجينات المقاومة التي يرغبون في إدراجها في قالب مكتبتهم على أساس المستوى المطلوب من خصوصية الركيزة واسعة أو ضيقة.على سبيل المثال، بيتا لاكتام هو التعبير عن E.coli القالب يمكن أن تكون مستعدة للسماح للتخريب محددة للغاية من بيتا لاكتام والفئات الفرعية المختلفة. باستخدام تقنية الصرف الصحي، الماصات 500 ميكرولترات من الموجبة ضبط MHB من خزان معقمة في كل بئر من صحن بئر معقمة، 96 عميق. مع إعداد ARP أو لوحات سلالة MARP، استخدم عصا قضيب لتطعيم 96 لوحة بئر عميق وفقا لخريطة ARP أو MARP.ضع غشاء قابل للتنفس على سطح لوحة البئر العميقة وحضنها بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، 250 دورة في الدقيقة. ضمان عدم وجود آبار ملوثة. باستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 100 ميكرولترات من كل بئر من لوحة البئر العميق إلى لوحة 96-جيدا 96 جولة أسفل.إضافة 100 ميكرولتررس من الجلسرين 50٪ معقمة في كل بئر ومزيج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. إعداد ما لا يقل عن خمسة لوحات المكتبة. تغطية لوحات مع الأختام الألومنيوم العقيمة وضمان أن كل بئر مختومة بشكل فردي.ضع غطاء اللوحة على أعلى ختم الألومنيوم واخزنه عند درجة حرارة 80 درجة مئوية. باستخدام عصا قضيب خشبية، كشط بلطف الجراثيم من سطح مستعمرة ستريبتومسي ونقلها إلى أنبوب اختبار يحتوي على حبة زجاجية معقمة واحدة وثلاث ملليلترات من المضادات الحيوية الستربتاويس المتوسطة. أغلق أنبوب الاختبار بشكل فضفاض بغطاء للسماح بالتهيّم.باستخدام نفس عصا قضيب خشبية، خط سيطرة العقم على طبق بيتري تحتوي على أجار بينيت. احتضان أنبوب يحتوي على البذور ثقافة في 30 درجة مئوية مع تهيّم لمدة ستة أيام في 250 دورة في الدقيقة ولوحة التحكم في العقم في 30 درجة مئوية لمدة ستة أيام. ثم، على سطح مستوى، وإعداد لوحات dereplication.سبيرات 23 ملليلتر من أجار بينيت الدافئة في ماصة المصلية والاستغناء 20 ملليلتر بالتساوي عبر سطح طبق بيتري مستطيلة، وترك ما تبقى من المتوسطة في الماصات لمنع تشكيل فقاعة الهواء. غطي الطبق بغطاء. تدوير لوحة بلطف حتى يغطي المتوسطة جميع المناطق من لوحة وعدم إزعاج ذلك حتى agar قد وضعت تماما.بعد ذلك، إعداد أوراق الأغشية nitrocellulose باستخدام غطاء طبق بيتري مستطيلة كقالب تتبع بحيث أن الأوراق تناسب سطح لوحة dereplication. قطع الأوراق وautoclave لهم في الحقيبة العقيمة. الآن، تحقق من لوحة التحكم في العقم للتأكد من عدم وجود أي ملوثات بعد ستة أيام من الحضانة.إذا خالية من التلوث، وإزالة غطاء طبق بيتري مستطيلة وماصة 200 ميكرولترات من ثقافة البذور على سطح أجار بينيت في الطبق المستطيل. استخدام مسحة القطن العقيمة لنشر الثقافة بالتساوي عبر سطح لوحة كاملة. لوضع الغشاء النيتروسليلوز المعدة على قمة الثقافة على سطح طبق بيتري، محاذاة الحافة السفلية للغشاء إلى الحافة السفلية من طبق بيتري وتطبيق الغشاء ببطء من الحافة السفلية إلى الحافة العليا من لوحة.استخدام مسحة القطن العقيمة لتنعيم أي فقاعات الهواء التي قد تكون تشكلت بين واجهة أجار غشاء، وضمان أن الغشاء هو تدفق إلى أجار. يسمح الغشاء للكائنات الحية بsporulate على سطحه في حين يمكن أن تفرز الأيض الثانوية في الوسط أدناه. ضع الغطاء مرة أخرى على طبق بيتري المستطيل وضعه رأسًا على عقب في كيس بلاستيكي مغلق.احتضان في 30 درجة مئوية لمدة ستة أيام. بعد ستة أيام، قم بإزالة لوحة إزالة الخلع من الحاضنة. باستخدام ملاقط معقمة، وإزالة بعناية الغشاء النيتروسليلوز من سطح أجار بينيت.تأكد من أن هناك فقط نمو spore طفيفة حول حواف لوحة لتقليل فرص تلويث تراكب أن تضاف. ضمان سطح العمل هو مستوى واستخدام ماصة المصلية لpirate 23 ملليلتر من الحارة الموجبة تكييفها MHB أجار. إنشاء تراكب عن طريق الاستغناء 20 ملليلتر بالتساوي عبر سطح لوحة dereplication، وترك ما تبقى من أجار في ماصة لمنع تشكيل فقاعة الهواء.ضع الغطاء على الصحن. تدوير لوحة بلطف حتى يغطي المتوسطة جميع المناطق وعدم إزعاجه حتى تم تعيين أجار تماما. مرة واحدة تبريد وتوطدت، والعودة لوحة dereplication إلى كيس من البلاستيك مختومة وتخزينها رأسا على عقب في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها، مما يسمح لنشر الأيض الثانوية في تراكب أجار MHB.في نفس اليوم ، تلقيح ARP جديد أو قالب MARP عن طريق الأنابيب الأولى 100 microliters من الموجبة تعديل MHB في كل بئر من لوحة 96-well. خذ المخزون المجمد ARP أو لوحة مكتبة MARP من الفريزر ناقص 80 درجة مئوية. إزالة ختم الألومنيوم قبل أن يبدأ التكثيف في تشكيل على الجانب السفلي.باستخدام أدوات معقمة 96 جيدا تعلق، دبوس بعناية من المخزون المجمدة ARP أو لوحة مكتبة MARP وتطعيم MHB الطازجة التي تحتوي على لوحات 96-جيدا. لتقليل التلوث أثناء إزالة ا للتسرب، قم بإعداد العديد من لوحات مكتبة ARP أو MARP اللازمة فقط لتخريب اثنين إلى ثلاثة لوحات إلغاء replication لكل لوحة مكتبة. بمجرد اكتمالها، ضع ختم ألمنيوم معقمة جديدة على القالب المجمد وإعادته إلى الفريزر ناقص 80 درجة مئوية.ضع لوحات 96-well الملقح داخل كيس بلاستيكي مختوم بشكل فضفاض وحضن في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة. قم بإزالة قالب ARP أو MARP من الحاضنة وتأكد من عدم وجود أي ملوثات من خلال مقارنة اللوحة بخريطة قالب ARP أو MARP. إزالة لوحات dereplication من أربع درجات مئوية والسماح لتكواز درجة حرارة الغرفة.إذا كان هناك تكثيف، فتح الأغطية والسماح لتجف في بيئة معقمة. باستخدام أدوات التثبيت العقيمة، دبوس من لوحة مكتبة ARP أو MARP على سطح تراكب أجار MHB من لوحات dereplication. يجب الحرص على عدم اختراق أجار.السماح للقوالب inoculum لتجف لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. ضع لوحات الهريبوليكية الملقسة مقلوبة في كيس بلاستيكي مختوم وحضن بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، تحليل نتائج dereplication بمقارنة النمو على لوحة dereplication إلى الآبار التي تتوافق مع ARP أو خريطة MARP.في هذا ARP أو MARP إزالة سير العمل، تم تحقيق نتيجة إزالة موجبة. حيث تم تحديد استخراج أعدت لسلالة WAC 8921 كمنتج الكلورافينيكول. عدم وجود نمو ARP يشير إلى وجود مضاد حيوي غير معروف أو مضاد حيوي أقل شيوعًا لم يتم حسابه في لوحة مكتبة ARP أو MARP.وقد تشكل نمط نمو فريد من نوعه لـ MARP بسبب استخدامه لكل من النوع البري E.coli BW25113 وفرط نفاذية وتدفق إلكتروني مُتحول ناقص E.coli BW25113 bamB tolC. تشير هذه النتيجة إلى وجود مركب مع نشاط مضاد للميكروبات لم يتمكن من تجاوز الغشاء الخارجي السليم. تشير أنماط نمو الإشريكية القولونية هذه إلى التعقيم غير السليم لأدوات التثبيت ، مما يؤدي إلى نقل سلالات الإشريكية القولونية غير المعروفة عبر التراكب.ومثال على ARP أو MARP تجميد مكتبة الأسهم يظهر التلوث هنا مع ثلاث مستعمرات القولونية متميزة نمت على سطح طبق بيتري مستطيلة. تشير هذه النتيجة إلى أن تراكب agar قد تم اختراقه أثناء إلغاء replication. ويمكن أن يحدث التلوث المتصل بتراكب MHB أثناء عملية إزالة التكاء، مما يظهر نمط نمو غير منتظم على سطح التراكب.أهم شيء أن نتذكر عند اتباع هذا البروتوكول هو استخدام التعقيم السليم والتقنيات العقيمة من أجل ضمان أن كنت لا تعقد مرة أخرى في أي خطوة بسبب التلوث. وهذا يشمل إعداد الغشاء النيتروسليلوز بحيث يناسب سطح لوحة أجار بينيت في أقرب وقت ممكن من أجل الحد من انتشار الجراثيم عند صب تراكب MHB. بالإضافة إلى ذلك، من المهم للغاية أيضا استخدام معدات تثبيت معقمة بشكل صحيح عند تلقيح لوحات المكتبة وتسريب من أجل إنتاج أنظف نتيجة.بالإضافة إلى إزالة المضادات الحيوية المعروفة، يمكن تطبيق هذه الطريقة لتحديد المواد المساعدة التي يمكن استخدامها بالاقتران مع المضادات الحيوية الموجودة لإنقاذ نشاطها. على الرغم من أن إزالة المضادات الحيوية ليست تقنية جديدة ، إلا أنها سيئة السمعة لكونها كثيفة الموارد وتستغرق وقتًا طويلاً. تساعد منصة ARP و MARP على تسليط الضوء على كيفية عدم الحاجة إلى أن يكون إزالة المضادات الحيوية إنتاجًا كبيرًا ، ولكن يمكن إكماله على مدى أسبوعين باستخدام الحد الأدنى من المعدات.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

تضخيم وقياس HIV - 1 الحمض النووي الريبي في الأفراد المصابين بالايدز مع الأحمال الفيروسية أقل من الحد كشفها بواسطة فحوصات السريرية القياسية

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

الفحص السريع للفيروس نقص المناعة البشرية والناسخ العكسي مثبطات Integrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

إعداد ثقافة بيليه الدم الجرثومي السريع لتحديد واختبار حساسية المضادات الحيوية

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

دراسة الظواهر المضيف في<em&gt; affinis الجمبوزيا</em&gt; وبعد المضادات الحيوية العلاج

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

بروتوكول لتوصيف التغيرات المورفولوجية<em&gt; كلوستريديوم ديفيسيل</em&gt; في الاستجابة للعلاج بالمضادات الحيوية

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

تحليلات تستند إلى سلسلة من ردود الفعل بوليميريز الكمية الحجمية المعوية مورين بعد العلاج بالمضادات الحيوية عن طريق الفم

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

الآلي التحليل السلوكي لكبير C. ايليجانس السكان استخدام واسعة مجال-من-عرض "تتبع النظام الأساسي"

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

فحص كمية "من قابلية المضادات الحيوية" النيسرية البنية التجارية استخدام ATP "باستخدام المجاميع فحوصات" و "تلطيخ" لايف/الميت

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...