Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
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赖特实验室关于ARP/MARP的研究得到了安大略省研究基金和加拿大卫生研究所赠款（FRN-148463）的支持。我们感谢周苏默协助扩大和组织ARP图书馆。

1. 准备大肠杆菌库甘油库存（来自Agar Slants）
<ol><li>将ARP/MARP E.大肠杆菌菌株从乳化汤（LB）琼脂带到含有LB琼脂和适当可选择的标记的培养皿上（表1）。</li>
	<li>通过接种含有与单个菌落的适当可选择标记的3 mL的LB，为每个大肠杆菌菌株制备培养物。在 37°C 下通过曝气（250 rpm）在 37°C 下生长过夜。</li>
	<li>将800μL的培养液和200μL的无菌80%甘油结合在1.8 mL冷冻液?...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

上述方案可应用于新型抗菌化合物和佐剂的发现，这些化合物和佐剂可与现有抗生素结合使用，以挽救其活性。该平台利用抗药性机制的高基质特异性及其共性抗生素，在粗天然产物提取物中分解化合物。尽管准备脱粒板所需的时间很长（±2周），但脱粒复制过程本身是在一个过夜的潜伏期后完成的，与分离和表征所需的时间相比，这非常迅速。来自原油提取物的化合物。此外，无需昂贵或高度?...

自1928年发现青霉素以来，来自环境微生物的天然产物已被证明是抗菌化合物1的丰富来源。大约80%的天然产品抗生素来自链霉菌属和其他活动性霉菌的细菌，而其余20%是由真菌物种1产生的。临床中使用的一些最常见的抗生素支架，如β-乳糖、四环素、里法霉素和氨基糖苷，最初是从微生物2中分离出来的。然而，由于耐多药细菌（MDR）的上升，我们目前的抗生素小组在治疗3、4方面效果已经降低。这些病原体包括"ESKAPE"病原体（即，耐万古霉素肠球菌和β-乳酸葡萄球菌、肺炎克列比氏菌、假单抗、阿辛托杆菌和肠杆菌），这是一些主要公共卫生当局认为与最高风险相关的细菌的子集，如世界卫生组织3、4、5。这些MDR病原体的出现和全球传播导致对新型抗生素的不断需求3，4，5。令人遗憾的是，过去二十年已表明，从微生物来源发现新型抗生素越来越困难。目前的药物发现方法包括生物活性化合物的高通量筛选，包括天然产物提取物库，允许在给定时间测试数千种提取物2。然而，一旦检测到抗菌活性，下一步是分析粗提取物的含量，以确定活性成分，并消除那些含有已知或冗余化合物7，8。这个过程，称为去复制，对于预防和/或显著减少重新发现已知抗生素7，9的时间至关重要。虽然天然产品药物发现的必要步骤，脱复制是出了名的费力和资源密集型10。
自从Beutler等人首次发明"去复制"一词以来，已经做出了广泛的努力，为快速识别已知的抗生素11、12制定创新战略。今天，用于脱模最常见的工具包括分析色谱系统，如高性能液相色谱、质谱法和基于核磁共振的检测方法11、13。不幸的是，这些方法中的每一个都需要使用昂贵的分析设备和复杂的数据解释。
为了开发一种无需专用设备即可快速执行的去复制方法，我们建立了抗生素耐药性平台（ARP）10。ARP 可用于发现抗生素佐剂、分析新的抗生素化合物对抗已知的耐药性机制，以及从动效细菌和其他微生物中提取的已知抗生素的去复制。在这里，我们专注于它在抗生素脱位中的应用。ARP利用一个各源性大肠杆菌菌株库，表达个体抗药性基因，这些基因对最常见的重新发现的抗生素14、15有效。当大肠杆菌库在二次代谢物产生生物的存在下生长时，该化合物的特性可以通过表达其相关抗性基因10的大肠杆菌菌株的生长来推导。当ARP首次被报告时，该库由>40个基因组成，对16种抗生素类具有抗药性。原始的去复制模板被设计为包含每个抗生素类的抗药性基因子集，以在脱模过程中提供有关抗生素亚类的信息。今天，ARP由>90个基因组成，这些基因对18种抗生素具有抗药性。利用我们广泛的抗药性基因集合，开发了一个二次脱体模板，被称为最小抗生素耐药性平台（MARP）。创建此模板是为了消除基因冗余，并简单地提供有关一般抗生素类别的信息，该类别与复制代谢物相关。此外，MARP模板具有野生型和大肠杆菌BW25113（大肠杆菌BW25113+巴B+tolC）的超渗透/排泄缺陷菌株，与ARP的原始化身相比，后者仅利用超渗透应变。这种独特的方面在脱体过程中产生额外的表型，表明化合物能够穿过革兰氏阴性细菌的外膜。在这里，我们描述了在取消ARP和/或MARP的复制时应遵循的稳健协议，重点介绍了要遵循的最关键步骤，并讨论了各种可能的结果。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

从天然产物提取物中寻找新的抗生素的主要挑战之一是重新发现常见化合物。为了应对这一挑战，对感兴趣的样品进行脱体，即识别已知化合物的过程。脱体方法，如分析分离，然后是质谱法，既费时又耗费资源。为了改进脱复制过程，我们开发了抗生素耐药性平台（ARP）。ARP 是一个包含大约 100 个抗生素耐药性基因的库，这些基因已单独克隆到大肠杆菌中。这种菌株收集有许多应用，包括一种经济高效且方便的抗生素脱压方法。这个过程涉及在含有固体介质的矩形培养皿表面发酵产生抗生素的微生物，从而允许二次代谢物通过培养基分泌和扩散。经过6天的发酵期，微生物生物量被去除，并在培养皿中加入薄琼脂覆盖层，以形成光滑的表面，使大肠杆菌指标菌株生长。然后，我们收集的 ARP 菌株固定在含抗生素的培养皿表面。该板是下一个孵育过夜，以允许大肠杆菌生长在覆盖的表面。只有含有对特定抗生素（或类）的耐药性的菌株才能在此表面上生长，从而能够快速识别所生产的化合物。该方法已成功用于识别已知抗生素的生产商，并作为识别产生新化合物的人的手段。

当使用ARP和/或MARP对一组感兴趣的抗生素产生菌株进行去复制时，得出了以下结果。
图 1中描述了 ARP/MARP 去复制工作流的关系图，库板映射如图 1 和补充图 2所示。图2显示了一个积极的脱布结果，其中环境提取物WAC 8921被确定为氯霉素生产商。图 3显示完全缺乏 ARP 增长，这表明存在?...

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Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

我们描述了一个平台，它利用异源性抗生素耐药大肠杆菌库来消除抗生素。细菌或真菌产生的抗生素的特性可以通过表达其各自抗药性基因的大肠杆菌的生长来推断出来。该平台经济高效且具有时间效率。

使用抗生素耐药性平台进行抗生素脱除

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

我们的协议意义重大，因为它允许在不使用专用设备的情况下，对已知抗生素进行具有成本效益和及时的重复。此技术的主要优点是模板自定义。这意味着，个人可以根据所需的广泛或窄基质特异性水平，定制他们希望在库模板中包括哪些电阻基因。例如，可以编写一个表示大肠杆菌模板的 beta-lactam，以便允许对β-乳酸及其各种子类进行高度特异性的重复。使用化粪池技术，移液器 500 微升的阳离子将 MHB 从无菌储液罐调整到无菌 96 深井板的每个井中。使用准备好的 ARP 或 MARP 应变板，使用施用器棒根据 ARP 或 MARP 图为 96 深井板接种。将透气密封膜放在深井板表面，并在 37 摄氏度、250 RPM 下孵育过夜。确保没有受污染的油井。使用多通道移液器，将 100 微升从深井板的每个井转移到无菌的 96 井圆形底板。在每个井中加入100微升无菌50%甘油，然后轻轻上下移液混合。至少准备五个库板。用无菌铝密封盖住板，并确保每口井都单独密封。将板盖放在铝密封上，并在零下 80 摄氏度处存放。使用木制施用棒，轻轻地刮孢子从链球菌菌群的表面，并转移到一个试管，其中包含一个无菌玻璃珠和三毫升链球菌抗生素介质。用盖子松散地关闭试管，以便进行呼吸。使用相同的木制施用棒，在含有贝内特的阿加的培养皿上条纹无菌控制。在30摄氏度下孵育含有种子培养的管子，在250 RPM时用气化6天，在30摄氏度下孵育无菌控制板，在30摄氏度下孵育6天。然后，在水平表面上，准备重复数据消除板。将23毫升温暖的Bennett的气量吸入血清移液器中，并在长方形培养皿表面均匀地分配20毫升，将余下介质留在移液器中，以防止气泡的形成。用盖子盖住盘子。轻轻旋转板，直到介质覆盖板的所有区域，不要打扰它，直到搅拌完全设置。接下来，使用矩形培养皿盖作为跟踪模板，准备硝基纤维素膜片，使片适合重复板的表面。切开床单，用无菌袋中密封。现在，检查无菌控制板，以确保在孵育六天后没有污染物存在。如果无污染，请将矩形培养皿的盖子和移液器 200 微升的种子培养物取下到矩形培养皿中的 Bennett 的 agar 表面上。使用无菌棉签将培养能力均匀地分布到整个板的表面。要将准备好的硝基纤维素膜放在培养皿表面的培养物顶部，请将膜的下边缘与 Petri 盘的下边缘对齐，然后缓慢地将膜从下边缘涂抹到板的顶部边缘。使用无菌棉签来平滑膜垫界面之间可能形成的任何气泡，确保膜与红质齐平。膜允许生物体在其表面孢子，而二次代谢物可能排泄到下面的介质中。将盖子放回长方形培养皿上，倒置在密封的塑料袋中。在30摄氏度下孵育6天。六天后，从培养箱中取出重复物板。使用无菌钳子，小心地从贝内特的芳水表面去除硝基纤维素膜。确保板边缘只有轻微的孢子生长，以减少污染要添加的覆盖物的机会。确保工作表面保持水平，并使用血清移液器吸气 23 毫升热阳离子调节的 MHB agar。通过均匀地在重复赖以板表面分配 20 毫升来创建覆盖层，将除法器中剩余的糖留在移液器中，以防止气泡的形成。将盖子放在盘子上。轻轻旋转板，直到介质覆盖所有区域，不要打扰它，直到阿加完全设置。冷却和凝固后，将重复剂板返回密封的塑料袋，并在四摄氏度下倒置存放过夜，从而将二次代谢物扩散到 MHB agar 覆盖物中。在同一天，通过首先将100微升的阳离子移液调整为96井板的每个井，为新的 ARP 或 MARP 模板接种。将冷冻库存 ARP 或 MARP 库板从零下 80 摄氏度的冰柜中取出。在冷凝开始在其底面形成之前，拆下铝密封。使用无菌 96 孔固定工具，小心地从冷冻库存 ARP 或 MARP 库板固定，并接种含有 96 孔板的新鲜 MHB。为了最大限度地减少重复过程中受到的污染，请准备尽可能多的 ARP 或 MARP 库板，每个库板只需重复两到三个重复板。完成后，在冷冻模板上安装新的无菌铝密封，并返回到零下80摄氏度的冰柜。将接种的 96 孔板放在松散密封的塑料袋内，在 37 摄氏度下孵育，在 250 RPM 下摇晃 18 小时。从培养箱中取出 ARP 或 MARP 模板，通过将板与 ARP 或 MARP 模板图进行比较，确保不存在任何污染物。从四摄氏度中去除重复数据消除板，并允许与室温平衡。如果有冷凝，打开盖子，允许在无菌环境中干燥。使用无菌固定工具，从 ARP 或 MARP 库板固定到重复板的 MHB 加糖覆盖表面。小心不要刺穿阿加。让模板孵化干燥三到五分钟。将接种的重复数据板倒置在密封的塑料袋中，在37摄氏度下孵育过夜。第二天，通过将重复数据消除板上的生长与对应于 ARP 或 MARP 图的井进行比较来分析重复结果。在此 ARP 或 MARP 重复数据消除工作流中，实现了正重复结果。其中为WAC 8921菌株准备的提取物被确定为氯霉素生产商。ARP 生长的缺乏表明存在未知抗生素或不太常见的抗生素，该抗生素未计入 ARP 或 MARP 库板中。MARP特有的生长模式形成，因为它同时使用野生型大肠杆菌BW25113和超渗透和电子通量缺乏大肠杆菌BW25113bBB tolC。这一结果表明，存在一种具有抗菌活性的化合物，这种化合物无法超越完整的外膜。这种大肠杆菌生长模式表明固定工具的灭菌不当，导致未知大肠杆菌菌株在覆盖物上转移。此处显示了 ARP 或 MARP 冷冻库存库板污染的示例，其中三个不同的大肠杆菌菌落生长在矩形培养皿表面。结果表明，在重复过程中，加糖覆盖被刺穿。MHB 覆盖物相关的污染也可能在重复过程中发生，在覆盖物表面显示不规则的生长模式。遵循此协议时，最重要的是使用适当的灭菌和无菌技术，以确保您不会因污染而在任何步骤中退缩。这包括制备硝基纤维素膜，使其尽可能与贝内特的芳脂板表面保持一致，以便在浇注 MHB 覆盖物时最大限度地减少孢子的扩散。此外，在接种库板和脱印时正确使用经过消毒的固定设备以产生最清洁的结果也非常重要。除了脱印已知抗生素外，此方法还可用于识别可与现有抗生素结合使用的佐剂，以挽救其活性。虽然抗生素重复治疗不是一项新技术，但它因资源密集和耗时而臭名昭著。ARP 和 MARP 平台有助于揭示抗生素重复药物如何不需要是一个大型生产，而是可以使用最少的设备在两周内完成。

Research

JoVE Journal

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科研

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