Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Forskning i Wright Lab vedrørende ARP/MARP blev støttet af Ontario Research fund og canadiske institutter for sundhedsforskning Grant (FRN-148463). Vi vil gerne anerkende sommer Chou for at hjælpe med udvidelse og organisering af ARP-biblioteket.

1. klargøring af E. coli -bibliotekets glycerol bestande (fra agar-slants)
<ol><li>Stribe ARP/marp E. coli stammer fra lysogeny bouillon (lb) agar skrå på Petri skåle, der indeholder lb agar og den passende valgbar markør (tabel 1).</li>
	<li>Forbered kulturer for hver af E. coli -stammerne ved at inokulere 3 ml lb indeholdende den passende valgbare markør med en enkelt koloni. Vokse natten over ved 37 °C med beluftning (250 rpm).</li>
	<li>Kombiner 800 μL kultur og 2...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

Den ovenfor beskrevne protokol kan anvendes på både opdagelsen af nye antimikrobielle forbindelser og adjuvanter, der kan anvendes sammen med eksisterende antibiotika for at redde deres aktivitet. Platformen udnytter de høje substratspecificitet af resistensmekanismer og deres cognate antibiotika, at dereplicate forbindelser inden for rå naturlige produkt ekstrakter. Selv om den tid, der kræves for afkalknings plader, der skal forberedes, er langvarig (~ 2 uger), er selve dereplications processen afsluttet efter en ...

Siden opdagelsen af penicillin i 1928, naturlige produkter afledt af miljømæssige mikroorganismer har vist sig at være en rig kilde til antimikrobielle forbindelser1. Ca. 80% af natur produktets antibiotika stammer fra bakterier af slægten Streptomyces og andre actinomycetes, mens de resterende 20% produceres af svampearter1. Nogle af de mest almindelige antibiotika stilladser, der anvendes i klinikken, såsom β-lactams, tetracyclines, rifamyciner, og aminoglykosider, blev oprindeligt isoleret fra mikrober2. Men på grund af stigningen af multiresistente (mdr) bakterier, vores nuværende panel af antibiotika er blevet mindre effektiv i behandling3,4. Disse omfatter "ESKAPE"-patogener (dvs. vancomycin-resistente enterokokker og β-lactam-resistent Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanniiog Enterobacter Sp.), som er en delmængde af bakterier, der anses for at være forbundet med den højeste risiko af en række store offentlige sundhedsmyndigheder som Verdenssundhedsorganisationen3,4,5. Fremkomsten og den globale udbredelse af disse mdr-patogener resulterer i et konstant behov for nye antibiotika3,4,5. Desværre har de sidste to årtier vist, at opdagelsen af nye antibiotika fra mikrobielle kilder bliver stadig vanskeligere6. De nuværende tilgange til Drug Discovery omfatter høj gennemløb screening af bioaktive forbindelser, herunder naturlige produkt ekstrakt biblioteker, giver mulighed for tusindvis af ekstrakter, der skal testes på et givet tidspunkt2. Men, når antimikrobiel aktivitet opdages, det næste skridt er at analysere indholdet af den rå ekstrakt til at identificere den aktive komponent og eliminere dem, der indeholder kendte eller overflødige forbindelser7,8. Denne proces, benævnt dereplication, er afgørende for at forebygge og/eller væsentligt reducere den tid, der bruges på re-opdagelse af kendte antibiotika7,9. Selv om et nødvendigt skridt i naturlige produkt Drug opdagelse, dereplication er notorisk omstændelig og ressourcekrævende10.
Lige siden Beutler et al. først opfundet udtrykket "dereplication", er der gjort en stor indsats for at udvikle innovative strategier for hurtig identifikation af kendte antibiotika11,12. I dag omfatter de mest almindeligt anvendte værktøjer til dereplication analytiske kromatografiske systemer såsom højtydende væskekromatografi, massespektrometri og nukleare magnet resonans baserede detekteringsmetoder11,13. Desværre, hver af disse metoder kræver brug af dyrt analytisk udstyr og sofistikeret data fortolkning.
I et forsøg på at udvikle en dereplication metode, der kan hurtigt udføres uden specialiseret udstyr, vi etablerede antibiotikaresistens platform (ARP)10. ARP kan bruges til opdagelsen af antibiotika adjuvanter, profilering af nye antibiotika forbindelser mod kendte resistensmekanismer, og dereplication af kendte antibiotika i ekstrakter afledt af aktinobakterier og andre mikrober. Her fokuserer vi på dets anvendelse i antibiotika-dereplication. ARP udnytter et bibliotek af isogene Escherichia coli stammer udtrykker individuelle resistensgener, der er effektive mod de mest almindeligt genfundne antibiotika14,15. Når e. coli -biblioteket dyrkes i nærværelse af en sekundær metabolit-producerende organisme, kan identiteten af forbindelsen udledes af væksten af e. coli -stammer, der udtrykker dens associerede resistens gen10. Da ARP først blev indberettet, bestod biblioteket af > 40 gener, som giver resistens over for 16 antibiotika klasser. Den oprindelige dereplication skabelon var designet til at omfatte en delmængde af resistensgener per antibiotika klasse til at give oplysninger om antibiotika under klasse under dereplication proces. I dag består ARP af > 90 gener, der giver resistens over for 18 antibiotika klasser. Ved hjælp af vores omfattende samling af resistensgener er der udviklet en sekundær dereplication-skabelon, som er kendt som den minimale antibiotikaresistens platform (MARP). Denne skabelon blev oprettet for at eliminere genredundans og blot give oplysninger om den generelle antibiotika klasse, som en dereplicated metabolit er relateret til. Derudover besidder marp-skabelonen både dværg og en hyperpermeabel/efflux mangelfuld stamme af e. coli BW25113 (e. coli BW25113 δbambδTolc), sammenlignet med den oprindelige inkarnation af ARP, som kun udnytter den hyperpermeable stamme. Dette unikke aspekt skaber yderligere fænotyper under dereplication, hvilket indikerer en forbindelser evne til at krydse den ydre membran af gram-negative bakterier. Her beskriver vi en robust protokol, der skal følges, når dereplicating med enten ARP og/eller MARP, fremhæve de mest kritiske skridt, der skal følges, og diskutere de forskellige mulige resultater.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

En af de største udfordringer i søgningen efter nye antibiotika fra naturlige produkt ekstrakter er genopdagelsen af fælles forbindelser. For at imødegå denne udfordring udføres dereplication, som er processen med at identificere kendte forbindelser, på prøver af interesse. Metoder til dereplication såsom analytisk adskillelse efterfulgt af massespektrometri er tidskrævende og ressourcekrævende. For at forbedre dereplication proces, har vi udviklet antibiotikaresistens platform (ARP). ARP er et bibliotek med ca. 100 antibiotikaresistensgener, der er blevet individuelt klonet til Escherichia coli. Denne stamme samling har mange applikationer, herunder en omkostningseffektiv og facile metode til antibiotika dereplication. Processen involverer gæring af antibiotika-producerende mikrober på overfladen af rektangulære Petri skåle, der indeholder fast medium, hvilket giver mulighed for sekretion og diffusion af sekundære metabolitter gennem mediet. Efter en 6 dages fermenterings periode fjernes den mikrobielle biomasse, og der tilsættes en tynd agar-overlay til Petri skålen for at skabe en glat overflade og muliggøre væksten af E. coli -indikator stammerne. Vores samling af ARP stammer derefter fastgjort på overfladen af antibiotika-holdige Petri skål. Pladen er næste inkuberet natten for at tillade E. coli vækst på overfladen af overlay. Kun stammer, der indeholder resistens over for et bestemt antibiotikum (eller klasse), vokser på denne overflade, hvilket muliggør hurtig identifikation af det producerede stof. Denne metode er med held blevet anvendt til identifikation af producenter af kendte antibiotika og som et middel til at identificere dem, der producerer nye forbindelser.

Følgende resultater blev opnået, når en samling af antibiotika-producerende stammer af interesse var dereplicated ved hjælp af ARP og/eller MARP.
Et diagram over arbejdsprocessen ARP/MARP-dereplication er afbildet i figur 1, og Biblioteks plade kort vises i supplerende figur 1 og supplerende figur 2. Figur 2 viser et positivt dereplication resultat, hvor den miljømæssige ekstrakt wac 8921 er ide...

Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Vi beskriver en platform, der udnytter et bibliotek af isogene antibiotikaresistente Escherichia coli til dereplication af antibiotika. Identiteten af et antibiotikum produceret af bakterier eller svampe kan udledes af væksten af E. coli udtrykker sin respektive resistens gen. Denne platform er økonomisk effektiv og tidsbesparende.

Antibiotika-Dereplication ved hjælp af antibiotikaresistens platformen

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Vores protokol er vigtig, fordi det giver mulighed for både omkostningseffektiv og rettidig dereplication af kendte antibiotika uden brug af specialiseret udstyr. Den største fordel ved denne teknik er skabelontilpasning. Det betyder, at en person kan skræddersy, hvilke resistensgener, som de ønsker at medtage i deres biblioteksskabelon baseret på deres ønskede niveau af bred eller smal substratspecifikitet.For eksempel er en beta-lactam udtrykker E.coli skabelon kan fremstilles for at give mulighed for den meget specifikke dereplication af beta-lactams og deres forskellige underklasser. Ved hjælp af en septisk teknik, pipette 500 mikroliter af kation justeret MHB fra en steril reservoir i hver brønd af en steril, 96 dyb brønd plade. Med de forberedte ARP- eller MARP-stammeplader skal du bruge en applikatorpind til at vaccinere den 96 dybe brøndplade i overensstemmelse med ARP- eller MARP-kortet.Placer en åndbar tætning membran på overfladen af den dybe godt plade og inkubere det natten over ved 37 grader Celsius, 250 RPM. Sørg for, at der ikke er forurenede brønde. Ved hjælp af en multi-kanal pipette, overføre 100 mikroliter fra hver brønd af den dybe godt plade til en steril 96-godt runde bundplade.Tilsæt 100 mikroliter steril 50% glycerol i hver brønd og bland ved forsigtigt pipettering op og ned. Forbered mindst fem bibliotekstaller. Dæk pladerne med sterile aluminiumstætninger og sørg for, at hver brønd er individuelt forseglet.Placer pladelåget oven på aluminiumstætningen og opbevar den på minus 80 grader Celsius. Ved hjælp af en træ applikator stick, forsigtigt skrabe sporer fra overfladen af en streptomyces koloni og overføre det til et reagensglas, der indeholder en steril glas perle og tre milliliter streptomyces antibiotika medium. Reagensglasset lukkes løst med en hætte, så der kan besørges.Brug den samme træ applikator stick, streak en sterilitet kontrol på en petriskål, der indeholder Bennett's agar. Inkuber røret indeholdende frøkultur ved 30 grader Celsius med belægning i seks dage ved 250 RPM og sterilitetskontrolpladen ved 30 grader Celsius i seks dage. Derefter, på en plan overflade, forberede dereplication plader.Aspirere 23 milliliter varm Bennett's agar i en serologisk pipette og dispensere 20 milliliter jævnt over overfladen af en rektangulær petriskål, forlader resten af mediet i pipetten for at forhindre luftbobledannelse. Dæk pladen med et låg. Drej forsigtigt pladen, indtil mediet dækker alle områder af pladen, og forstyr den ikke, før agaren er helt indstillet.Dernæst forberede nitrocellulose membran ark ved hjælp af en rektangulær Petriskål låg som en opsporing skabelon, således at arkene passer til overfladen af dereplication plade. Skær arkene og autoklave dem i en steril pose. Kontroller nu sterilitetskontrolpladen for at sikre, at der ikke er forurenende stoffer til stede efter seks dages inkubation.Hvis forureningsfri fjernes låget på den rektangulære petriskål og pipette 200 mikroliter af frøkulturen på overfladen af Bennetts agar i den rektangulære skål. Brug en steril vatpind til jævnt at sprede kulturen over hele pladens overflade. For at placere den forberedte nitrocellulosemembran over toppen af kulturen på overfladen af petriskålen, justeres membranens nederste kant til den nederste kant af petriskålen, og membranen påføres langsomt fra den nederste kant til pladens øverste kant.Brug en steril vatpind til at udjævne eventuelle luftbobler, der kan have dannet mellem membranen agar interface, sikre, at membranen er skyllet til agaren. Membranen giver mulighed for organismer til at sporulere på dens overflade, mens sekundære metabolitter kan udskilles i mediet nedenfor. Læg låget tilbage på den rektangulære petriskål, og læg det på hovedet i en forseglet plastikpose.Inkubere ved 30 grader Celsius i seks dage. Efter seks dage fjernes dereplicationspladen fra inkubatoren. Ved hjælp af sterile pincet fjernes nitrocellulosemembranen forsigtigt fra overfladen af Bennetts agar.Sørg for, at der kun er mindre spore vækst omkring kanterne af pladen for at mindske chancerne for at forurene overlejring, der skal tilføjes. Sørg for, at arbejdsfladen er plan, og brug en serologisk pipette til at aspirere 23 milliliter varm kationjusteret MHB agar. Opret en overlay ved at dispensere 20 milliliter jævnt over overfladen af dereplicationspladen, så resten af agaren i pipetten for at forhindre luftbobledannelse.Læg låget på pladen. Drej forsigtigt pladen, indtil mediet dækker alle områder, og forstyr den ikke, før agaren er helt indstillet. Når afkølet og størknet, returnere dereplication plade til forseglet plastpose og gemme det på hovedet ved fire grader Celsius natten over, giver mulighed for diffusion af sekundære metabolitter i MHB agar overlay.Samme dag skal du vaccinere en frisk ARP- eller MARP-skabelon ved først at pipettere 100 mikroliter kationjusteret MHB i hver brønd af en 96-brøndplade. Tag den frosne bestand ARP eller MARP bibliotek plade ud af minus 80 grader Celsius fryser. Fjern aluminiumsforseglingen, før kondens begynder at dannes på undersiden.Brug sterile 96-brønd pinning værktøjer, omhyggeligt pin fra den frosne bestand ARP eller MARP bibliotek plade og inokulere den friske MHB indeholder 96-brønd plader. For at minimere forurening under dereplication, forberede så mange ARP eller MARP bibliotek plader er nødvendige for kun at dereplicate to til tre dereplication plader pr bibliotek plade. Når du er færdig, sætte en ny steril aluminium forsegling på den frosne skabelon og returnere den til minus 80 grader Celsius fryser.Placer de podede 96-brøndplader inde i en løst forseglet plastikpose og inkuberes ved 37 grader Celsius med rystelser ved 250 RPM i 18 timer. Fjern ARP- eller MARP-skabelonen fra kuvøsen, og sørg for, at der ikke er forurenende stoffer til stede ved at sammenligne pladen med ARP- eller MARP-skabelonkortet. Fjern dereplicationspladerne fra fire grader Celsius og lad det bringe sig i ækvivalens med stuetemperatur.Hvis der er kondens, åbnes lågene, og der tørres ud i et sterilt miljø. Brug sterile pinning værktøjer, pin fra ARP eller MARP bibliotek plade på overfladen af MHB agar overlay af dereplication plader. Pas på ikke at gennembore agaren.Lad skabeloninoculum tørre i tre til fem minutter. Placer de podede dereplicationsplader på hovedet i en forseglet plastikpose og inkuberes natten over ved 37 grader Celsius. Den følgende dag, analysere dereplication resultater ved at sammenligne vækst på dereplication plade til brønde, der svarer til ARP eller MARP kort.I denne ARP- eller MARP-dereplicationsarbejdsgang blev der opnået et positivt dereplicationsresultat. Hvor ekstraktet til stammen WAC 8921 blev identificeret som en chloramphenicolproducent. Manglen på ARP vækst indikerer tilstedeværelsen af enten en ukendt antibiotikum eller en mindre almindeligt forekommende antibiotikum, der ikke blev tegnede sig for i ARP eller MARP bibliotek plade.Et vækstmønster, der er unikt for MARP, blev dannet på grund af dets udnyttelse af både vildtype E.coli BW25113 og en hyperpermeabel og e-flux-mangelfuld mutant E.coli BW25113 bamB tolC. Dette resultat tyder på tilstedeværelsen af et stof med antimikrobiel aktivitet, der ikke var i stand til at overgå en intakt ydre membran. Denne E.coli vækstmønstre tyder på forkert sterilisering af pinning værktøjer, resulterer i overførsel af ukendte E.coli stammer på tværs af overlay.Og et eksempel på ARP eller MARP frosne lager bibliotek plade forurening er vist her med tre forskellige E.coli kolonier dyrket på den rektangulære Petriskål overflade. Dette resultat indikerer, at agaroverlejringen blev gennemboret under dereplication. MHB-overlejringsrelateret kontaminering kan også forekomme under dereplicationsprocessen, hvilket viser et uregelmæssigt vækstmønster på overfladen af overlejringen.Det vigtigste at huske, når du følger denne protokol er at bruge korrekt sterilisation og aseptiske teknikker for at sikre, at du ikke holdes tilbage i noget trin på grund af forurening. Dette omfatter forberedelse af nitrocellulosemembranen, så den passer til overfladen af Bennetts agarplade så tæt som muligt for at minimere spredningen af sporer, når MHB-overlejringen hældes. Derudover er det også yderst vigtigt at bruge korrekt steriliseret pinning udstyr, når inoculating biblioteket plader og dereplicating for at producere det reneste resultat.Ud over at dereplicere kendte antibiotika, denne metode kan anvendes til at identificere adjuvanser, som kan bruges sammen med eksisterende antibiotika til at redde deres aktivitet. Selv om antibiotika hånligbehandling ikke er en ny teknik, det er berygtet for at være ressourcekrævende og tidskrævende. ARP- og MARP-platformen er med til at kaste lys over, hvordan antibiotikaderup ikke behøver at være en stor produktion, men snarere kan gennemføres over en periode på to uger ved hjælp af minimalt udstyr.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Brug af kunstig Sputum Medium til Test antibiotikum Effekt mod<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I forhold mere relevante for cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Hurtig screening af HIV revers transkriptase og Integrase hæmmere

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Fremstilling af en blodkultur Pellet til hurtig bakteriel identifikation og antibiotikaresistens undersøgelserne

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Undersøgelse af Host fænotyper i<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Efter behandling med antibiotika

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

En protokol til at karakterisere de morfologiske ændringer af<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Som svar på antibiotisk behandling

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Kvantitative Polymerase Chain Reaction-baserede analyser af Murine tarmens mikrobiota efter peroral antibiotisk behandling

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatiseret adfærdsmæssige analyse af store C. elegans befolkninger ved hjælp af et bredt synsfelt sporer Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Kvantitativ undersøgelse af antibiotika følsomhed af Neisseria gonorrhoeae aggregater bruger ATP-udnyttelse kommercielle Assays og Live/døde farvning

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...