Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Het onderzoek in het Wright Lab met betrekking tot de ARP/MARP werd ondersteund door het Ontario Research Fund en Canadian Institutes of Health Research Grant (FRN-148463). We willen Sommer Chou graag erkennen voor het ondersteunen van de uitbreiding en organisatie van de ARP-bibliotheek.

1. bereiding van E. coli bibliotheek glycerol voorraden (van agar slants)
<ol><li>Streak de ARP/MARP E. coli stammen van lysogeny Bouillon (lb) agar op de Petri schaaltjes met lb agar en de geschikte markeerstift (tabel 1).</li>
	<li>Bereid culturen voor elk van de E. coli stammen door het inoculeren van 3 ml lb met de juiste selecteerbare marker met een enkele kolonie. Groei 's nachts bij 37 °C met beluchting (250 rpm).</li>
	<li>Combineer 800 μL cultuur en 200 μL steriel...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

Het hierboven beschreven protocol kan worden toegepast op zowel de ontdekking van nieuwe antimicrobiële stoffen als adjuvantia die kunnen worden gebruikt in combinatie met bestaande antibiotica om hun activiteit te redden. Het platform maakt gebruik van de hoge substraat specificiteit van resistentiemechanismen en hun verwant antibiotica, tot dereplicate verbindingen binnen ruwe natuurlijke product extracten. Hoewel de tijd die nodig is voor de voorbereiding van de dereplicatie platen lang is (~ 2 weken), is het derepli...

Sinds de ontdekking van penicillaire in 1928, natuurlijke producten afgeleid van milieu-micro-organismen hebben bewezen een rijke bron van antimicrobiële verbindingen1. Ongeveer 80% van de antibiotica van het natuurlijke product zijn afgeleid van bacteriën van het geslacht Streptomyces en andere Actinomyceten, terwijl de resterende 20% wordt geproduceerd door schimmelsoorten1. Enkele van de meest voorkomende antibiotica-steigers die in de kliniek worden gebruikt, zoals de β-lactams, tetracyclines, rifamycinen en aminoglycosiden, werden oorspronkelijk geïsoleerd van microben2. Vanwege de opkomst van multiresistente (MDR) bacteriën is ons huidige panel van antibiotica echter minder effectief geworden in de behandeling van3,4. Deze omvatten de "eskape" pathogenen (d.w.z. vancomycine-resistente enterokokken en β-lactam-resistente Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, en Enterobacter SP.), een subset van bacteriën die geacht worden geassocieerd te worden met het hoogste risico door een aantal grote volksgezondheidsinstanties zoals de Wereldgezondheidsorganisatie3,4,5. De opkomst en wereldwijde verspreiding van deze MDR-pathogenen resulteert in een constante behoefte aan nieuwe antibiotica3,4,5. Helaas hebben de voorbije twintig jaar aangetoond dat de ontdekking van nieuwe antibiotica uit microbiële bronnen steeds moeilijker wordt6. Huidige benaderingen van Drug Discovery omvatten de hoge doorvoer screening van bioactieve verbindingen, met inbegrip van natuurlijke product extract Bibliotheken, waardoor duizenden extracten worden getest op een gegeven moment2. Echter, zodra antimicrobiële activiteit wordt gedetecteerd, de volgende stap is het analyseren van de inhoud van het ruwe extract om de actieve component te identificeren en elimineren die met bekende of redundante verbindingen7,8. Dit proces, "dereplication" genoemd, is van vitaal belang om de tijd die aan de herontdekking van bekende antibiotica7,9wordt besteed, te voorkomen en/of aanzienlijk te verkorten. Hoewel een noodzakelijke stap in het opsporen van natuurlijke geneesmiddelen, dereplication is berukker bewerkelijk en resource-intensieve10.
Sinds Beutler et al. eerst bedacht de term "dereplication", uitgebreide inspanningen zijn gedaan om innovatieve strategieën voor de snelle identificatie van bekende antibiotica te ontwikkelen11,12. Vandaag de dag zijn de meest gebruikte instrumenten voor dereplicatie analytische chromatografische systemen zoals krachtige vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en op nucleaire magnetische resonantie gebaseerde detectiemethoden11,13. Helaas vereist elk van deze methoden het gebruik van dure analytische apparatuur en geavanceerde gegevens interpretatie.
In een poging om een dereplication methode te ontwikkelen die snel kan worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde apparatuur, hebben we het antibioticum Resistance platform (ARP)10opgericht. De ARP kan worden gebruikt voor de ontdekking van antibiotica-adjuvantia, de profilering van nieuwe antibiotica verbindingen tegen bekende resistentiemechanismen en de dereplicatie van bekende antibiotica in extracten afkomstig van actinobacteriën en andere microben. Hier, we richten ons op de toepassing ervan in antibioticum dereplication. De ARP gebruikt een bibliotheek van isogene Escherichia coli stammen die individuele resistentiegenen uitdrukken die effectief zijn tegen de meest in het algemeen opnieuw ontdekte antibiotica14,15. Wanneer de E. coli bibliotheek wordt geteeld in aanwezigheid van een secundaire metaboliet-producerende organisme, de identiteit van de compound kan worden afgeleid door de groei van e. coli stammen die de bijbehorende weerstand gen10uitdrukken. Toen de ARP voor het eerst werd gerapporteerd, bestond de bibliotheek uit > 40 genen die resistentie tegen 16 antibiotica klassen verlenen. De oorspronkelijke dereplication template is ontworpen om een subset van resistentiegenen per antibiotica klasse te omvatten om informatie te verstrekken over antibiotica subklasse tijdens het dereplication proces. Tegenwoordig bestaat de ARP uit > 90 genen die resistentie verlenen aan 18 antibiotica klassen. Met behulp van onze uitgebreide collectie van resistentiegenen is een secundair dereplication template ontwikkeld en staat bekend als het minimale antibiotica Resistance platform (MARP). Deze sjabloon is gemaakt om te elimineren van Gene redundantie en eenvoudig informatie te verstrekken over de algemene antibiotica klasse die een dereplicated metaboliet is gerelateerd aan. Daarnaast bezit het MARP-template zowel wild type als een hyperpermeabele/effluxdeficiënte stam van e. coli BW25113 (E. coli BW25113 δBAMBδtolc), vergeleken met de oorspronkelijke incarnatie van de ARP, die alleen maakt gebruik van de hyperpermeabele stam. Dit unieke aspect creëert extra fenotypes tijdens dereplicatie, wat duidt op een verbindingen vermogen om het buitenste membraan van gram-negatieve bacteriën over te steken. Hier beschrijven we een robuust protocol dat moet worden gevolgd bij het derepliceren met ofwel de ARP en/of MARP, Markeer de meest kritieke stappen die moeten worden gevolgd, en bespreek de verschillende mogelijke uitkomsten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

Een van de belangrijkste uitdagingen bij het zoeken naar nieuwe antibiotica uit natuurlijke product extracten is de herontdekking van gemeenschappelijke verbindingen. Om deze uitdaging aan te pakken, wordt dereplication, dat is het proces van het identificeren van bekende verbindingen, uitgevoerd op monsters van belang. Methoden voor dereplicatie zoals analytische scheiding gevolgd door massaspectrometrie zijn tijdrovend en resource-intensieve. Om het dereplicatie proces te verbeteren hebben we het antibioticum Resistance platform (ARP) ontwikkeld. De ARP is een bibliotheek met ongeveer 100 antibioticaresistentiegenen die individueel zijn gekloond tot Escherichia coli. Deze stam collectie heeft vele toepassingen, met inbegrip van een kosteneffectieve en facile methode voor antibioticum dereplication. Het proces omvat de fermentatie van antibiotica-producerende microben op het oppervlak van rechthoekige Petri schalen die een vast medium bevatten, waardoor de afscheiding en verspreiding van secundaire metabolieten via het medium mogelijk wordt. Na een fermentatie periode van 6 dagen wordt de microbiële biomassa verwijderd en wordt een dunne agar-overlay aan de Petri schaal toegevoegd om een glad oppervlak te creëren en de groei van de E. coli -indicator stammen mogelijk te maken. Onze verzameling van ARP-stammen wordt vervolgens vastgemaakt aan het oppervlak van de antibioticum bevattende Petri schaal. De plaat wordt vervolgens 's nachts geïnineerd om E. coli groei op het oppervlak van de overlay mogelijk te maken. Alleen stammen die resistentie tegen een specifiek antibioticum (of klasse) bevatten, groeien op dit oppervlak waardoor de geproduceerde stof snel geïdentificeerd wordt. Deze methode is met succes gebruikt voor de identificatie van producenten van bekende antibiotica en als middel om te identificeren die nieuwe verbindingen produceren.

De volgende resultaten werden verkregen wanneer een verzameling van belang zijnde antibiotica-producerende stammen werd gederepliceerd met behulp van de ARP en/of MARP.
Een diagram van de ARP/MARP-dereplication-workflow wordt afgebeeld in afbeelding 1en de kaarten van de bibliotheekplaat worden weergegeven in aanvullend figuur 1 en aanvullend figuur 2. Figuur 2 toont een positief dereplication resulta...

Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

We beschrijven een platform dat gebruik maakt van een bibliotheek van isogene antibiotica resistente Escherichia coli voor de dereplicatie van antibiotica. De identiteit van een antibioticum dat door bacteriën of schimmels wordt geproduceerd, kan worden afgeleid uit de groei van E. coli , waarin het respectieve resistentie-gen wordt uitgesproken. Dit platform is economisch effectief en tijd efficiënt.

Antibiotica-Dereplicatie met behulp van het antibioticumresistentie platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Ons protocol is belangrijk omdat het zorgt voor zowel de kosteneffectieve en tijdige dereplicatie van bekende antibiotica zonder het gebruik van gespecialiseerde apparatuur. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is template customization. Dit betekent dat een individu kan aanpassen welke resistentie genen die ze willen opnemen in hun bibliotheek sjabloon op basis van hun gewenste niveau van brede of smalle substraat specificiteit.Bijvoorbeeld, een bèta-lactam is het uitdrukken van E.coli sjabloon kan worden voorbereid om de zeer specifieke dereplicatie van beta-lactams en hun verschillende subklassen mogelijk te maken. Met behulp van een septische techniek, pipet 500 microliters van kation aangepast MHB van een steriel reservoir in elke put van een steriele, 96 diepe put plaat. Gebruik met de voorbereide ARP- of MARP-stamplaten een applicatorstick om de 96 diepe putplaat in te enten volgens de ARP- of MARP-kaart.Plaats een ademend afdichtingsmembraan op het oppervlak van de diepe putplaat en broed het 's nachts uit bij 37 graden Celsius, 250 RPM. Zorg ervoor dat er geen verontreinigde putten zijn. Met behulp van een multi-channel pipet, breng 100 microliters van elke put van de diepe put plaat naar een steriele 96-goed ronde bodemplaat.Voeg 100 microliter steriele 50%glycerol in elke put en meng door zachtjes pipetten op en neer. Bereid minstens vijf bibliotheekborden voor. Bedek de platen met steriele aluminium afdichtingen en zorg ervoor dat elke put individueel wordt verzegeld.Plaats het deksel op de aluminium afdichting en bewaar op min 80 graden Celsius. Met behulp van een houten applicator stick, voorzichtig schrapen sporen van het oppervlak van een streptomyces kolonie en breng het in een reageerbuis met een steriele glazen kraal en drie milliliter streptomyces antibioticum medium. Sluit de reageerbuis losjes met een dop om beademing mogelijk te maken.Met behulp van dezelfde houten applicator stick, streep een steriliteit controle op een petrischaal met Bennett's agar. Broed de buis met zaadcultuur bij 30 graden Celsius met besluiering gedurende zes dagen bij 250 RPM en de steriliteitscontroleplaat bij 30 graden Celsius gedurende zes dagen. Bereid vervolgens op een vlakke ondergrond de dereplicatieplaten voor.Aspirate 23 milliliter warme Bennett's agar in een serologische pipet en 20 milliliter gelijkmatig over het oppervlak van een rechthoekige petrischaal, waardoor de rest van het medium in de pipet om luchtbel vorming te voorkomen. Bedek de plaat met een deksel. Draai de plaat voorzichtig totdat het medium alle delen van de plaat bedekt en verstoor deze niet totdat de agar volledig is ingesteld.Bereid vervolgens de membraanplaten van nitrocellulose met behulp van een rechthoekig petrischaaldeksel als traceringssjabloon, zodat de vellen op het oppervlak van de dereplicatieplaat passen. Snijd de vellen en autoclave ze in een steriel zakje. Controleer nu de steriliteitscontroleplaat om ervoor te zorgen dat er na zes dagen incubatie geen verontreinigingen aanwezig zijn.Als het besmettingsvrij is, verwijder dan het deksel van de rechthoekige petrischaal en pipet 200 microliter van de zaadkweek op het oppervlak van de agar van de Bennett in de rechthoekige schotel. Gebruik een steriel wattenstaafje om de cultuur gelijkmatig over het oppervlak van de hele plaat te verspreiden. Om het geprepareerde nitrocellulosemembraan boven op de cultuur op het oppervlak van de petrischaal te plaatsen, lijnt u de onderrand van het membraan uit op de onderrand van de petrischaal en brengt u het membraan langzaam van de onderrand op de bovenrand van de plaat aan.Gebruik een steriel wattenstaafje om eventuele luchtbellen glad te strijken die zich kunnen hebben gevormd tussen het membraan agar interface, ervoor te zorgen dat het membraan is spoelen naar de agar. Het membraan zorgt ervoor dat organismen op het oppervlak sporuleren, terwijl secundaire metabolieten kunnen worden uitgescheiden in het medium hieronder. Leg het deksel terug op de rechthoekige petrischaal en leg het ondersteboven in een verzegelde plastic zak.Zes dagen lang incubeer bij 30 graden Celsius. Na zes dagen moet u de dereplicatieplaat uit de couveuse verwijderen. Verwijder met behulp van steriele pincetten voorzichtig het nitrocellulosemembraan van het oppervlak van de agar van de Bennett.Zorg ervoor dat er slechts kleine sporengroei rond de randen van de plaat om de kans op besmetting van de te voegen overlay te verminderen. Zorg ervoor dat het werkoppervlak vlak is en gebruik een serologische pipet om 23 milliliter warme kationen aangepaste MHB agar aan te halen. Maak een overlay door het verstrekken van 20 milliliter gelijkmatig over het oppervlak van de dereplicatie plaat, waardoor de rest van de agar in de pipet om luchtbel vorming te voorkomen.Leg het deksel op de plaat. Draai de plaat voorzichtig totdat het medium alle gebieden bedekt en verstoor deze niet totdat de agar volledig is ingesteld. Eenmaal afgekoeld en gestold, breng je de dereplicatieplaat terug naar de verzegelde plastic zak en bewaar je hem 's nachts ondersteboven bij vier graden Celsius, waardoor de verspreiding van secundaire metabolieten in de MHB-agar-overlay kan worden geplaatst.Op dezelfde dag, inenten een verse ARP of MARP sjabloon door eerst pipetting 100 microliter van kation aangepaste MHB in elke put van een 96-put plaat. Haal de bevroren voorraad ARP of MARP bibliotheekplaat uit de min 80 graden Celsius vriezer. Verwijder de aluminium afdichting voordat condensatie begint te vormen aan de onderkant.Met behulp van steriele 96-well pinning tools, voorzichtig pin uit de bevroren voorraad ARP of MARP bibliotheek plaat en inenten de verse MHB met 96-well platen. Om verontreiniging tijdens dereplicatie te minimaliseren, moet u zoveel mogelijk ARP- of MARP-bibliotheekplaten voorbereiden om slechts twee tot drie dereplicatieplaten per bibliotheekplaat te verwijderen. Eenmaal voltooid, zet een nieuwe steriele aluminium afdichting op de bevroren sjabloon en terug te keren naar de min 80 graden Celsius vriezer.Plaats de ingeënte 96-put platen binnenkant van een los afgesloten plastic zak en uitbroeden op 37 graden Celsius met schudden op 250 RPM voor 18 uur. Verwijder de ARP- of MARP-sjabloon uit de incubator en zorg ervoor dat er geen verontreinigingen aanwezig zijn door de plaat te vergelijken met de ARP- of MARP-sjabloonkaart. Verwijder de dereplicatieplaten van vier graden Celsius en laat het gelijk op kamertemperatuur.Als er condensatie is, open de deksels en laat drogen in een steriele omgeving. Met behulp van steriele pinning tools, pin van de ARP of MARP bibliotheek plaat op het oppervlak van de MHB agar overlay van de dereplicatie platen. Pas op dat u de agar niet doorboort.Laat het sjabloonentmateriaal drie tot vijf minuten drogen. Plaats de ingeënte dereplicatieplaten ondersteboven in een verzegelde plastic zak en incubbate 's nachts op 37 graden Celsius. De volgende dag analyseer je dereplicatieresultaten door de groei op de dereplicatieplaat te vergelijken met putten die overeenkomen met de ARP- of MARP-kaart.In deze ARP- of MARP-dereplicatieworkflow is een positief dereplicatieresultaat bereikt. Waarin het voor de stam bereide extract WAC 8921 werd geïdentificeerd als een chlooramfenicolproducent. Het gebrek aan ARP-groei duidt op de aanwezigheid van een onbekend antibioticum of een minder vaak gevonden antibioticum dat niet werd verantwoord in de ARP- of MARP-bibliotheekplaat.Een groeipatroon dat uniek is voor de MARP werd gevormd vanwege het gebruik van zowel wilde type E.coli BW25113 als een hyper-permeabel en e-flux deficiënte mutant E.coli BW25113 bamB tolC. Dit resultaat suggereert de aanwezigheid van een verbinding met antimicrobiële activiteit die niet in staat was om een intact buitenste membraan te overtreffen. Deze E.coli groeipatronen suggereert de onjuiste sterilisatie van pinning tools, wat resulteert in de overdracht van onbekende E.coli stammen over de overlay.En een voorbeeld van ARP of MARP bevroren voorraad bibliotheek plaat besmetting wordt hier getoond met drie verschillende E.coli kolonies geteeld op de rechthoekige petrischaal oppervlak. Dit resultaat geeft aan dat de agar overlay werd doorboord tijdens dereplicatie. De MHB-overlay gerelateerde verontreiniging kan ook optreden tijdens het dereplicatieproces, met een onregelmatig groeipatroon op het oppervlak van de overlay.Het belangrijkste om te onthouden bij het volgen van dit protocol is het gebruik van de juiste sterilisatie en aseptische technieken om ervoor te zorgen dat je niet wordt tegengehouden in een stap als gevolg van besmetting. Dit omvat het zo bereiden van het nitrocellulosemembraan zodat het zo dicht mogelijk op het oppervlak van de agarplaat van de Bennett past om de verspreiding van sporen bij het gieten van de MHB-overlay te minimaliseren. Daarnaast is het ook uiterst belangrijk om goed gesteriliseerde pinning apparatuur te gebruiken bij het inenten van de bibliotheekplaten en derepliceren om het schoonste resultaat te produceren.Naast het derepliceren van bekende antibiotica, kan deze methode worden toegepast op het identificeren van hulpstoffen die kunnen worden gebruikt in combinatie met bestaande antibiotica om hun activiteit te redden. Hoewel antibiotica dereplicatie is niet een nieuwe techniek, het is berucht voor zijn resource intensief en tijdrovend. Het ARP- en MARP-platform helpen om een licht te werpen op hoe antibioticadereplicatie geen grote productie hoeft te zijn, maar kan gedurende een periode van twee weken worden voltooid met minimale apparatuur.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Voorbereiding van een Bloed Cultuur Pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Onderzoek van Host Phenotypes in<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Na een behandeling met antibiotica

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Een protocol om de morfologische veranderingen van<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In reactie op Antibiotische Behandeling

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Kwantitatieve Polymerase Chain Reaction gebaseerde Analyses van lymfkliertest intestinale Microbiota na behandeling met mondelinge antibiotica

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Geautomatiseerde Behavioral analyse van grote C. elegans populaties met behulp van een breed veld-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Kwantitatieve onderzoek van antibiotische gevoeligheid van Neisseria gonorrhoeae met behulp van aggregaten ATP-gebruik commerciële testen en Live/Dead vlekken

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...