Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
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La recherche dans le laboratoire Wright relative à l'ARP/MARP a été appuyée par le Fonds de recherche de l'Ontario et la subvention des Instituts de recherche en santé du Canada (FRN-148463). Nous tenons à remercier Sommer Chou d'avoir aidé à l'expansion et à l'organisation de la bibliothèque de l'ARP.

1. Préparation des stocks de glycérol de la bibliothèque E. coli (de Agar Slants)
<ol><li>Ststreak the ARP/MARP E. coli strains from lysogeny broth (LB) agar slants onto Petri dishes containing LB agar and the appropriate selectable marker (Tableau 1).</li>
	<li>Préparer les cultures pour chacune des souches d'E. coli en inoculant 3 mL de LB contenant le marqueur sélectionnable approprié avec une seule colonie. Cultivez pendant la nuit à 37 oC avec l'aération (250 tr/...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

Le protocole décrit ci-dessus peut être appliqué à la découverte de nouveaux composés antimicrobiens et d'adjuvants qui peuvent être utilisés en conjonction avec les antibiotiques existants pour sauver leur activité. La plate-forme tire parti de la grande spécificité du substrat des mécanismes de résistance et de leurs antibiotiques cognés, pour dématérialiser les composés dans les extraits bruts de produits naturels. Bien que le temps nécessaire à la préparation des plaques de déplication soit long ...

Depuis la découverte de la pénicilline en 1928, les produits naturels dérivés de micro-organismes environnementaux se sont avérés être une riche source de composés antimicrobiens1. Environ 80% des antibiotiques de produits naturels sont dérivés de bactéries du genre Streptomyces et d'autres actinomycéres, tandis que les 20% restants sont produits par des espèces fongiques1. Certains des échafaudages antibiotiques les plus courants utilisés dans la clinique, tels que les lactams, les tétracyclines, les rifamycines et les aminoglycosides, ont été isolés à l'origine à partir de microbes2. Cependant, en raison de l'augmentation des bactéries multirésistantes (MDR), notre panel actuel d'antibiotiques est devenu moins efficace dans le traitement3,4. Il s'agit notamment des agents pathogènes "ESKAPE" (c.-à-d., entérocoques résistants à la vancomycine et Staphylococcus aureusrésistant au lactam , Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, et Enterobacter sp.), qui sont un sous-ensemble de bactéries considérées comme associées au risque le plus élevé par un certain nombre de grandes autorités de santé publique telles que l'Organisation mondiale de la Santé3,4,5. L'émergence et la propagation mondiale de ces agents pathogènes MDR entraîne un besoin constant d'antibiotiques nouveaux3,4,5. Malheureusement, les deux dernières décennies ont démontré que la découverte de nouveaux antibiotiques provenant de sources microbiennes est de plus en plus difficile6. Les approches actuelles de la découverte de médicaments comprennent le dépistage à haut débit des composés bioactifs, y compris les bibliothèques d'extraits de produits naturels, permettant de tester des milliers d'extraits à un moment donné2. Cependant, une fois que l'activité antimicrobienne est détectée, l'étape suivante consiste à analyser le contenu de l'extrait brut afin d'identifier la composante active et d'éliminer ceux qui contiennent des composés connus ou redondants7,8. Ce processus, appelé déplication, est essentiel pour prévenir et/ou réduire considérablement le temps consacré à la redécouverte d'antibiotiques connus7,9. Bien qu'une étape nécessaire dans la découverte de médicaments de produits naturels, la déplication est notoirement laborieuse et gourmande en ressources10.
Depuis que Beutler et coll. ont inventé le terme « déplication », des efforts considérables ont été déployés pour élaborer des stratégies novatrices pour l'identification rapide des antibiotiques connus11,12. Aujourd'hui, les outils les plus communs utilisés pour la déplication incluent les systèmes chromatographiques analytiques tels que la chromatographie liquide de haute performance, la spectrométrie de masse, et les méthodes de détection par résonance magnétique nucléaire11,13. Malheureusement, chacune de ces méthodes nécessite l'utilisation d'équipements d'analyse coûteux et d'une interprétation sophistiquée des données.
Dans une tentative de développer une méthode de déplication qui peut être rapidement effectuée sans équipement spécialisé, nous avons établi la plate-forme de résistance aux antibiotiques (ARP)10. L'ARP peut être utilisé pour la découverte d'adjuvants antibiotiques, le profilage de nouveaux composés antibiotiques contre les mécanismes de résistance connus, et la déplication d'antibiotiques connus dans des extraits dérivés d'actinobactéries et d'autres microbes. Ici, nous nous concentrons sur son application dans la déplication d'antibiotiques. L'ARP utilise une bibliothèque de souches isogènes Escherichia coli exprimant des gènes de résistance individuels qui sont efficaces contre les antibiotiques les plus couramment redécouverts14,15. Lorsque la bibliothèque E. coli est cultivée en présence d'un organisme secondaire producteur de métabolites, l'identité du composé peut être déduite par la croissance des souches d'E. coli qui expriment son gène de résistance associé10. Lorsque l'ARP a été signalé pour la première fois, la bibliothèque se composait de gènes de 40 livres conférant une résistance à 16 classes d'antibiotiques. Le modèle original de déplication a été conçu pour englober un sous-ensemble de gènes de résistance par classe d'antibiotiques pour fournir des informations concernant la sous-classe d'antibiotiques pendant le processus de déplication. Aujourd'hui, l'ARP est composé de gènes qui confèrent une résistance à 18 classes d'antibiotiques. À l'aide de notre vaste collection de gènes de résistance, un modèle de déplication secondaire a été développé et est connu sous le nom de plate-forme minimale de résistance aux antibiotiques (MARP). Ce modèle a été créé pour éliminer la redondance génétique et pour simplement fournir des informations concernant la classe générale d'antibiotiques qu'un métabolite déreproduit est lié à. En outre, le modèle MARP possède à la fois wildtype et une souche hyperperméable / efflux déficiente de E. coli BW25113 (E. coli BW25113 -bamB-tolC), par rapport à l'incarnation originale de l'ARP, qui ne utilise la souche hyperperméable. Cet aspect unique crée des phénotypes supplémentaires pendant la déplication, indiquant une capacité de composés à traverser la membrane externe des bactéries Gram-négatives. Ici, nous décrivons un protocole robuste à suivre lors de la déplication avec l'ARP et/ou le MARP, mettons en évidence les étapes les plus critiques à suivre, et discutons des divers résultats possibles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

L'un des principaux défis dans la recherche de nouveaux antibiotiques à partir d'extraits de produits naturels est la redécouverte de composés communs. Pour relever ce défi, la déplication, qui consiste à identifier les composés connus, est effectuée sur des échantillons d'intérêt. Les méthodes de déplication telles que la séparation analytique suivie de la spectrométrie de masse prennent beaucoup de temps et consomment beaucoup de ressources. Pour améliorer le processus de déplication, nous avons développé la plate-forme de résistance aux antibiotiques (ARP). L'ARP est une bibliothèque d'environ 100 gènes de résistance aux antibiotiques qui ont été individuellement clonés en Escherichia coli. Cette collection de souches a de nombreuses applications, y compris une méthode rentable et facile pour la déplication des antibiotiques. Le processus implique la fermentation de microbes produisant des antibiotiques à la surface des plats rectangulaires Petri contenant milieu solide, permettant ainsi la sécrétion et la diffusion de métabolites secondaires à travers le milieu. Après une période de fermentation de 6 jours, la biomasse microbienne est enlevée, et une mince agar-overlay est ajoutée au plat Petri pour créer une surface lisse et permettre la croissance des souches de l'indicateur E. coli. Notre collection de souches ARP est ensuite épinglée sur la surface du plat Petri contenant des antibiotiques. La plaque est ensuite incubée pendant la nuit pour permettre la croissance d'E. coli à la surface de la perceuse. Seules les souches contenant une résistance à un antibiotique spécifique (ou classe) se développent sur cette surface permettant l'identification rapide du composé produit. Cette méthode a été utilisée avec succès pour l'identification des producteurs d'antibiotiques connus et comme un moyen d'identifier ceux qui produisent de nouveaux composés.

Les résultats suivants ont été obtenus lorsqu'une collection de souches d'intérêt productrices d'antibiotiques a été déproduite à l'aide de l'ARP et/ou du MARP.
Un diagramme du flux de travail de déplication ARP/MARP est représenté dans la figure 1, et les cartes des plaques de bibliothèque sont affichées dans la figure 1 et la figure supplémentaire 2. La figure 2 démontre un résultat...

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Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Nous décrivons une plate-forme qui utilise une bibliothèque d'Escherichia coli résistant aux antibiotiques isogéniques pour la déplication des antibiotiques. L'identité d'un antibiotique produit par des bactéries ou des champignons peut être déduite par la croissance de E. coli exprimant son gène de résistance respectif. Cette plate-forme est économiquement efficace et efficace en temps.

Déplication d'antibiotiques à l'aide de la plate-forme de résistance aux antibiotiques

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Notre protocole est important parce qu’il permet à la fois la dréplication rentable et opportune des antibiotiques connus sans l’utilisation d’équipement spécialisé. Le principal avantage de cette technique est la personnalisation du modèle. Cela signifie qu’un individu peut adapter les gènes de résistance qu’il souhaite inclure dans son modèle de bibliothèque en fonction du niveau souhaité de spécificité du substrat large ou étroit.Par exemple, un modèle bêta-lactam exprime E.coli peut être préparé afin de permettre la dréplication très spécifique des bêta-lactams et de leurs diverses sous-classes. À l’aide d’une technique septique, pipette 500 microlitres de cation ajusté MHB à partir d’un réservoir stérile dans chaque puits d’une stérile, 96 plaques de puits profonds. Avec les plaques de contrainte ARP ou MARP préparées, utilisez un bâton applicateur pour inoculer la plaque de puits de 96 profondeurs conformément à la carte ARP ou MARP.Placez une membrane d’étanchéité respirante à la surface de la plaque profonde du puits et incubez-la pendant la nuit à 37 degrés Celsius, 250 rPM. Assurez-vous qu’il n’y a pas de puits contaminés. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 100 microlitres de chaque puits de la plaque de puits profonde vers une plaque inférieure ronde stérile de 96 puits.Ajouter 100 microlitres de 50% glycérol stérile dans chaque puits et mélanger en pipetting doucement de haut en bas. Préparer au moins cinq assiettes de bibliothèque. Couvrir les plaques de joints d’aluminium stériles et s’assurer que chaque puits est scellé individuellement.Placez le couvercle de la plaque sur le joint d’aluminium et rangez-le à moins 80 degrés Celsius. À l’aide d’un bâton applicateur en bois, racler délicatement les spores de la surface d’une colonie de streptocoques et les transférer dans un tube à essai contenant une perle de verre stérile et trois millilitres de streptocoque moyen antibiotique. Fermez le tube à essai lâchement avec un bouchon pour permettre l’aération.À l’aide du même bâton d’applicateur en bois, strier un contrôle de stérilité sur une boîte de Pétri contenant l’agar de Bennett. Incuber le tube contenant la culture des graines à 30 degrés Celsius avec aération pendant six jours à 250 RPM et la plaque de contrôle de la stérilité à 30 degrés Celsius pendant six jours. Ensuite, sur une surface plane, préparer des plaques de dréplication.Aspirez 23 millilitres d’agar bennett chaud dans une pipette sérologique et distribuez 20 millilitres uniformément à travers la surface d’une boîte rectangulaire de Petri, laissant le reste du milieu dans la pipette pour empêcher la formation de bulle d’air. Couvrir la plaque d’un couvercle. Faites pivoter doucement la plaque jusqu’à ce que le milieu couvre toutes les zones de la plaque et ne la dérangez pas jusqu’à ce que l’agar ait complètement réglé.Ensuite, préparez des feuilles membranaires de nitrocellulose en utilisant un couvercle rectangulaire de boîte de Petri comme modèle de traçage de sorte que les feuilles s’adaptent à la surface de la plaque de dréplication. Couper les feuilles et les autoclaves dans une poche stérile. Maintenant, vérifiez la plaque de contrôle de la stérilité pour vous assurer qu’aucun contaminant n’est présent après six jours d’incubation.S’il n’y a pas de contamination, retirer le couvercle de la boîte rectangulaire de Petri et pipette 200 microlitres de la culture des graines à la surface de l’agar bennett dans le plat rectangulaire. Utilisez un coton-tige stérile pour répartir uniformément la culture à la surface de toute la plaque. Pour positionner la membrane de nitrocellulose préparée au-dessus de la culture à la surface de la boîte de Pétri, alignez le bord inférieur de la membrane jusqu’au bord inférieur de la boîte de Pétri et appliquez lentement la membrane du bord inférieur au bord supérieur de la plaque.Utilisez un coton-tige stérile pour lisser les bulles d’air qui pourraient s’être formées entre l’interface de l’agar membranaire, en veillant à ce que la membrane soit rincée jusqu’à l’agar. La membrane permet aux organismes de sporulate sur sa surface tandis que les métabolites secondaires peuvent être excrétés dans le milieu ci-dessous. Remettre le couvercle sur la boîte rectangulaire petri et le placer à l’envers dans un sac en plastique scellé.Incuber à 30 degrés Celsius pendant six jours. Après six jours, retirer la plaque de dréplication de l’incubateur. À l’aide d’une pince stérile, retirer soigneusement la membrane de la nitrocellulose de la surface de l’agar bennett.Assurez-vous qu’il n’y a qu’une croissance mineure des spores sur les bords de la plaque pour réduire les chances de contamination de la superposition à ajouter. Assurez-vous que la surface de travail est de niveau et utilisez une pipette sérologique pour aspirer 23 millilitres d’agar MHB ajusté à la cation chaude. Créer une superposition en distribuant 20 millilitres uniformément à travers la surface de la plaque de dréplication, laissant le reste de l’agar dans la pipette pour empêcher la formation de bulles d’air.Placez le couvercle sur la plaque. Faites pivoter doucement la plaque jusqu’à ce que le milieu couvre toutes les zones et ne la dérangez pas jusqu’à ce que l’agar ait complètement réglé. Une fois refroidi et solidifié, remettre la plaque de déréplication dans le sac en plastique scellé et le conserver à l’envers à quatre degrés Celsius pendant la nuit, ce qui permet la diffusion de métabolites secondaires dans la superposition d’agar MHB.Le même jour, inoculer un modèle ARP ou MARP frais en pipetant d’abord 100 microlitres de cation ajustés MHB dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Sortez la plaque de bibliothèque ARP ou MARP congelée du congélateur de moins 80 degrés Celsius. Retirer le joint d’aluminium avant que la condensation ne commence à se former sur sa face inférieure.À l’aide d’outils stériles d’épinglant 96 puits, épinglez soigneusement la plaque de bibliothèque ARP ou MARP congelée et inoculez le MHB frais contenant des assiettes de 96 puits. Pour minimiser la contamination lors de la dréplication, préparez autant de plaques de bibliothèque ARP ou MARP nécessaires pour ne redépliquer que deux à trois plaques de dréplication par plaque de bibliothèque. Une fois terminé, placez un nouveau joint stérile en aluminium sur le modèle congelé et retournez-le au congélateur de moins 80 degrés Celsius.Placez les plaques inoculées de 96 puits à l’intérieur d’un sac en plastique lâchement scellé et incubez à 37 degrés Celsius en secouant à 250 rPM pendant 18 heures. Retirez le modèle ARP ou MARP de l’incubateur et assurez-vous qu’aucun contaminant n’est présent en comparant la plaque à la carte modèle ARP ou MARP. Retirer les plaques de déréplication de quatre degrés Celsius et laisser équilibrer à température ambiante.S’il y a condensation, ouvrez les couvercles et laissez sécher dans un environnement stérile. À l’aide d’outils d’épingnage stériles, épingler de la plaque de bibliothèque ARP ou MARP sur la surface de la superposition d’agar MHB des plaques de dréplication. Veillez à ne pas percer l’agar.Laissez sécher l’inoculum du modèle pendant trois à cinq minutes. Placer les plaques de déréplication inoculées à l’envers dans un sac en plastique scellé et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, analyser les résultats de la dréplication en comparant la croissance de la plaque de dréplication aux puits qui correspondent à la carte ARP ou MARP.Dans ce flux de travail de déreplication ARP ou MARP, un résultat de dréplication positif a été obtenu. Dans lequel l’extrait préparé pour la souche WAC 8921 a été identifié comme un producteur de chloramphéniphélique. L’absence de croissance de l’ARP indique la présence d’un antibiotique inconnu ou d’un antibiotique moins communément trouvé qui n’a pas été pris en compte dans la plaque de bibliothèque ARP ou MARP.Un modèle de croissance unique au MARP a été formé en raison de son utilisation du type sauvage E.coli BW25113 et d’un mutant hyper-perméable et déficient e-flux E.coli BW25113 bamB tolC. Ce résultat suggère la présence d’un composé avec l’activité antimicrobienne qui n’a pas pu dépasser une membrane externe intacte. Ces modèles de croissance d’E.coli suggèrent la stérilisation inappropriée des outils d’épinglant, ayant pour résultat le transfert des souches inconnues d’E.coli à travers la superposition.Et un exemple de contamination des plaques de bibliothèque congelées ARP ou MARP est montré ici avec trois colonies distinctes d’E.coli cultivées sur la surface rectangulaire de la boîte de Pétri. Ce résultat indique que la superposition d’agar a été percée pendant la dréplication. La contamination liée à la superposition du MHB peut également se produire pendant le processus de redondant, montrant un modèle de croissance irrégulier à la surface de la superposition.La chose la plus importante à retenir lorsque vous suivez ce protocole est d’utiliser une stérilisation appropriée et des techniques aseptiques afin de s’assurer que vous n’êtes pas retenu dans n’importe quelle étape en raison de la contamination. Cela comprend la préparation de la membrane de nitrocellulose afin qu’elle s’adapte à la surface de la plaque d’agar de Bennett aussi étroitement que possible afin de minimiser la propagation des spores lors de la coulée de la superposition MHB. En outre, il est également extrêmement important d’utiliser l’équipement d’épinginglement correctement stérilisé lors de l’inocculation des plaques de bibliothèque et de la réplication afin de produire le résultat le plus propre.En plus de redépliquer les antibiotiques connus, cette méthode peut être appliquée à l’identification des adjuvants qui peuvent être utilisés conjointement avec les antibiotiques existants pour sauver leur activité. Bien que la dréplication des antibiotiques ne soit pas une nouvelle technique, elle est connue pour être gourmande en ressources et prendre beaucoup de temps. La plate-forme ARP et MARP aide à faire la lumière sur la façon dont la dréplication des antibiotiques n’a pas besoin d’être une grande production, mais peut plutôt être achevée sur une période de deux semaines en utilisant un minimum d’équipement.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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