Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
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Die Forschung im Wright-Labor im Bereich aRP/MARP wurde vom Ontario Research Fund und dem Canadian Institutes of Health Research Grant (FRN-148463) unterstützt. Wir möchten Sommer Chou für seine Unterstützung bei der Erweiterung und Organisation der ARP-Bibliothek danken.

1. Herstellung von E. coli Bibliothek Glycerin Bestände (von Agar Slants)
<ol><li>Streichen Sie die ARP/MARP E. coli-Stämme aus Lysogeny-Brühe (LB) Agar schräg auf Petrischalen, die LB-Agar und den entsprechenden wählbaren Marker enthalten (Tabelle 1).</li>
	<li>Bereiten Sie Kulturen für jede der E. coli-Stämme vor, indem Sie 3 ml LB impfen, die den entsprechenden wählbaren Marker mit einer einzigen Kolonie enthalten. Über Nacht bei 37 °C mit Belüftung (250 Rpm) wa...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

Das oben beschriebene Protokoll kann sowohl auf die Entdeckung neuartiger antimikrobieller Verbindungen als auch auf Hilfsstoffe angewendet werden, die in Verbindung mit bestehenden Antibiotika zur Rettung ihrer Aktivität verwendet werden können. Die Plattform nutzt die hohe Substratspezifität von Resistenzmechanismen und deren Kognatenantibiotika, um Verbindungen in rohen Naturproduktextrakten zu dereplizieren. Obwohl die Fürdieherzustellenszeit benötigte Zeit lang ist (ca. 2 Wochen), ist der Dereplikationsprozess ...

Seit der Entdeckung von Penicillin im Jahr 1928 haben sich natürliche Produkte aus Umweltmikroorganismen als reiche Quelle antimikrobieller Verbindungen erwiesen1. Ungefähr 80% der Natürlichen Produkte Antibiotika werden von Bakterien der Gattung Streptomyces und anderen Actinomycetes abgeleitet, während die restlichen 20% von Pilzarten produziert werden1. Einige der häufigsten Antibiotika-Gerüste, die in der Klinik verwendet werden, wie die Lactams, Tetracycline, Rifamycine und Aminoglykoside, wurden ursprünglich aus Mikroben isoliert2. Aufgrund des Anstiegs von multiresistenten (MDR) Bakterien ist unser aktuelles Antibiotika-Panel in der Behandlung3,4weniger wirksam geworden. Dazu gehören die "ESKAPE"-Erreger (d.h. vancomycinresistente Enterokokken und Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, und Enterobacter sp.), die eine Teilmenge von Bakterien sind, die von einer Reihe wichtiger Gesundheitsbehörden wie der Weltgesundheitsorganisation3,4,5als mit dem höchsten Risiko assoziiert angesehen werden. Das Aufkommen und die weltweite Ausbreitung dieser MDR-Erreger führen zu einem konstanten Bedarf an neuartigen Antibiotika3,4,5. Bedauerlicherweise haben die letzten zwei Jahrzehnte gezeigt, dass die Entdeckung neuartiger Antibiotika aus mikrobiellen Quellen immer schwieriger wird6. Aktuelle Ansätze zur Arzneimittelentdeckung umfassen das Hochdurchsatz-Screening von bioaktiven Verbindungen, einschließlich Natürlicherextraktbibliotheken, so dass Tausende von Extrakten zu einem bestimmten Zeitpunkt getestet werden können2. Sobald jedoch antimikrobielle Aktivität erkannt wird, besteht der nächste Schritt darin, den Inhalt des Rohextrakts zu analysieren, um die aktive Komponente zu identifizieren und diejenigen zu beseitigen, die bekannte oder redundante Verbindungen enthalten7,8. Dieser Prozess, der als Dereplikation bezeichnet wird, ist von entscheidender Bedeutung, um die Zeit, die für die Wiederentdeckung bekannter Antibiotika aufgewendet wird, zu verhindern und/oder erheblich zu reduzieren7,9. Obwohl ein notwendiger Schritt in der Entdeckung von Naturprodukten, Ist die Dereplikation notorisch mühsam und ressourcenintensiv10.
Seit Beutler et al. den Begriff "Dereplikation" erstmals geprägt haben, wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um innovative Strategien zur schnellen Identifizierung bekannter Antibiotika zu entwickeln11,12. Heute sind die häufigsten Werkzeuge für die Dereplikation analytische chromatographische Systeme wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Kernspinresonanz-basierte Detektionsmethoden11,13. Leider erfordert jede dieser Methoden den Einsatz teurer Analysegeräte und ausgeklügelter Dateninterpretation.
In dem Versuch, eine Dereplikationsmethode zu entwickeln, die schnell ohne spezielle Ausrüstung durchgeführt werden kann, haben wir die Antibiotikaresistenzplattform (ARP)10eingerichtet. Die ARP kann für die Entdeckung von Antibiotika-Adjuvantien, die Profilierung neuer Antibiotika-Verbindungen gegen bekannte Resistenzmechanismen und die Dereplikation bekannter Antibiotika in Extrakten aus Aktinobakterien und anderen Mikroben verwendet werden. Hier konzentrieren wir uns auf seine Anwendung bei der Dereplikation von Antibiotika. Die ARP nutzt eine Bibliothek von isogenen Escherichia coli-Stämmen, die individuelle Resistenzgene exdrücken, die gegen die am häufigsten wiederentdeckten Antibiotika14,15wirksam sind. Wenn die E. coli-Bibliothek in Gegenwart eines sekundären Metaboliten produzierenden Organismus angebaut wird, kann die Identität der Verbindung durch das Wachstum von E. coli-Stämmen abgeleitet werden, die das zugehörige Resistenzgen10ausdrücken. Als die ARP zum ersten Mal gemeldet wurde, bestand die Bibliothek aus >40 Genen, die eine Resistenz für 16 Antibiotikaklassen verliehen. Die ursprüngliche Dereplikationsvorlage wurde entwickelt, um eine Teilmenge von Resistenzgenen pro Antibiotikaklasse zu umfassen, um Informationen über die Unterklasse von Antibiotika während des Dereplikationsprozesses bereitzustellen. Heute besteht die ARP aus >90 Genen, die 18 Antibiotikaklassen Resistenzen verleihen. Mit unserer umfangreichen Sammlung von Resistenzgenen wurde eine sekundäre Dereplikationsvorlage entwickelt, die als minimale Antibiotikaresistenzplattform (MARP) bekannt ist. Diese Vorlage wurde erstellt, um Genredundanz zu beseitigen und einfach Informationen über die allgemeine Antibiotikaklasse bereitzustellen, mit der ein dereplizierter Metabolit verwandt ist. Darüber hinaus besitzt die MARP-Vorlage sowohl Wildtyp als auch einen hyperpermeablen/efflux-defizienten Stamm von E. coli BW25113 (E. coli BW25113 nutzt die hyperpermeable Sorte. Dieser einzigartige Aspekt erzeugt zusätzliche Phänotypen während der Dereplikation, was auf eine Verbindungen Fähigkeit, die äußere Membran von Gram-negativen Bakterien zu überqueren. Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll, das bei der Dereplikation mit dem ARP und/oder MARP zu befolgen ist, heben die wichtigsten Schritte hervor, die befolgt werden müssen, und besprechen die verschiedenen möglichen Ergebnisse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

Eine der größten Herausforderungen bei der Suche nach neuen Antibiotika aus Naturproduktextrakten ist die Wiederentdeckung gängiger Verbindungen. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wird die Dereplikation, d. h. der Prozess der Identifizierung bekannter Verbindungen, an Voninteresse steilenProben durchgeführt. Methoden zur Dereplikation wie die analytische Trennung gefolgt von der Massenspektrometrie sind zeitaufwändig und ressourcenintensiv. Um den Dereplikationsprozess zu verbessern, haben wir die Antibiotikaresistenzplattform (ARP) entwickelt. Die ARP ist eine Bibliothek von etwa 100 Antibiotikaresistenzgenen, die einzeln in Escherichia coli geklont wurden. Diese Stammsammlung hat viele Anwendungen, einschließlich einer kostengünstigen und einfachen Methode für die Dereplikation von Antibiotika. Der Prozess beinhaltet die Fermentation von antibiotikaproduzierenden Mikroben auf der Oberfläche von rechteckigen Petrischalen, die festes Medium enthalten, wodurch die Sekretion und Diffusion von sekundären Metaboliten durch das Medium ermöglicht wird. Nach einer 6-tägigen Fermentationsphase wird die mikrobielle Biomasse entfernt und der Petrischale wird ein dünnes Agar-Overlay hinzugefügt, um eine glatte Oberfläche zu schaffen und das Wachstum der E. coli-Indikatorstämme zu ermöglichen. Unsere Sammlung von ARP-Stämmen wird dann auf die Oberfläche der antibiotikahaltigen Petrischale gepinnt. Die Platte wird als nächstes über Nacht inkubiert, um E. coli-Wachstum auf der Oberfläche der Überlagerung zu ermöglichen. Nur Stämme, die Resistenzen gegen ein bestimmtes Antibiotikum (oder eine bestimmte Klasse) enthalten, wachsen auf dieser Oberfläche, was eine schnelle Identifizierung der produzierten Verbindung ermöglicht. Diese Methode wurde erfolgreich zur Identifizierung von Herstellern bekannter Antibiotika und als Mittel zur Identifizierung der Hersteller neuartiger Verbindungen eingesetzt.

Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt, als eine Sammlung von antibiotikaproduzierenden Stämmen von Interesse mit dem ARP und/oder MARP derepliziert wurde.
Ein Diagramm des ARP/MARP-Dereplikationsworkflows ist in Abbildung 1dargestellt, und Bibliotheksplattenkarten sind in Ergänzenden Abbildung1 und Ergänzenden Abbildung 2dargestellt. Abbildung 2 zeigt ein positives Dereplikationsergebnis, bei dem...

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Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Wir beschreiben eine Plattform, die eine Bibliothek von isogenen antibiotikaresistenten Escherichia coli für die Dereplikation von Antibiotika nutzt. Die Identität eines von Bakterien oder Pilzen produzierten Antibiotikums kann durch das Wachstum von E. coli abgeleitet werden, das sein jeweiliges Resistenzgen ausdrückt. Diese Plattform ist wirtschaftlich effektiv und zeiteffizient.

Antibiotika-Dereplikation mit der Antibiotikaresistenzplattform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Unser Protokoll ist von Bedeutung, da es sowohl die kostengünstige als auch die rechtzeitige Dereplikation bekannter Antibiotika ohne den Einsatz spezieller Geräte ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Vorlagenanpassung. Dies bedeutet, dass eine Person auf der Grundlage ihrer gewünschten breiten oder schmalen Substratspezifität die Resistenzgene, die sie in ihre Bibliotheksvorlage aufnehmen möchten, individuell anpassen kann.Zum Beispiel kann eine Beta-Lactam-Exemittierung E.coli-Vorlage vorbereitet werden, um die hochspezifische Dereplikation von Beta-Lactamen und ihren verschiedenen Unterklassen zu ermöglichen. Mit einer septischen Technik, Pipette 500 Mikroliter Kation angepasst MHB aus einem sterilen Reservoir in jeden Brunnen einer sterilen, 96 tiefen Brunnenplatte. Verwenden Sie mit den vorbereiteten ARP- oder MARP-Dehnungsplatten einen Applikatorstab, um die 96-Tiefe-Bohrplatte gemäß der ARP- oder MARP-Karte zu impfen.Legen Sie eine atmungsaktive Dichtmembran auf die Oberfläche der Tiefenbrunnenplatte und bebrüten Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius, 250 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass keine kontaminierten Brunnen vorhanden sind. Mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter aus jedem Brunnen der Tiefbrunnenplatte auf eine sterile 96-Well-Rundbodenplatte übertragen.Fügen Sie 100 Mikroliter steriles 50%Glycerin in jeden Brunnen und mischen Sie, indem Sie sanft nach oben und unten. Bereiten Sie mindestens fünf Bibliotheksplatten vor. Bedecken Sie die Platten mit sterilen Aluminiumdichtungen und sorgen Sie dafür, dass jeder Brunnen einzeln versiegelt ist.Legen Sie den Plattendeckel auf die Aluminiumdichtung und lagern Sie bei minus 80 Grad Celsius. Mit einem hölzernen Applikatorstab sporen Sie vorsichtig von der Oberfläche einer Streptomyces-Kolonie ab und überträgt sie in ein Reagenzglas mit einer sterilen Glasperle und drei MilliliterStreptomyces Antibiotikum- Schließen Sie das Reagenzglas locker mit einer Kappe, um die Belüftung zu ermöglichen.Mit dem gleichen hölzernen Applikator-Stick, streifen Sie eine Sterilitätskontrolle auf einer Petrischale mit Bennetts Agar. Inkubieren Sie die Röhre mit Samenkultur bei 30 Grad Celsius mit Belüftung für sechs Tage bei 250 U/min und die Sterilitätskontrollplatte bei 30 Grad Celsius für sechs Tage. Bereiten Sie dann auf einer ebenen Oberfläche Dereplikationsplatten vor.23 Milliliter warmen Bennett-Agar in eine serologische Pipette aspirieren und 20 Milliliter gleichmäßig über die Oberfläche einer rechteckigen Petrischale verteilen, so dass der Rest des Mediums in der Pipette bleibt, um luftblasenbildung zu verhindern. Bedecken Sie die Platte mit einem Deckel. Drehen Sie die Platte vorsichtig, bis das Medium alle Bereiche der Platte abdeckt und sie nicht stört, bis der Agar vollständig eingestellt ist.Als nächstes bereiten Sie Nitrozellulose-Membranplatten mit einem rechteckigen Petrischalendeckel als Tracing-Vorlage vor, damit die Platten auf die Oberfläche der Dereplikationsplatte passen. Schneiden Sie die Blätter und autoklavieren Sie sie in einem sterilen Beutel. Überprüfen Sie nun die Sterilitätskontrollplatte, um sicherzustellen, dass nach sechs Tagen Inkubation keine Verunreinigungen vorhanden sind.Wenn kontaminationsfrei, entfernen Sie den Deckel der rechteckigen Petrischale und Pipette 200 Mikroliter der Samenkultur auf die Oberfläche des Bennett-Agars in der rechteckigen Schale. Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um die Kultur gleichmäßig über die Oberfläche der gesamten Platte zu verteilen. Um die vorbereitete Nitrocellulosemembran über der Kultur auf der Oberfläche der Petrischale zu positionieren, richten Sie den unteren Rand der Membran am unteren Rand der Petrischale aus und wenden Sie die Membran langsam vom unteren Rand bis zum oberen Rand der Platte an.Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um Luftblasen zu glätten, die sich zwischen der Membran-Agar-Schnittstelle gebildet haben könnten, um sicherzustellen, dass die Membran bündig zum Agar ist. Die Membran ermöglicht es Organismen, auf ihrer Oberfläche zu sporulaten, während sekundäre Metaboliten in das Medium unten ausgeschieden werden können. Legen Sie den Deckel wieder auf die rechteckige Petrischale und legen Sie ihn auf den Kopf in eine versiegelte Plastiktüte.Sechs Tage lang bei 30 Grad Celsius brüten. Entfernen Sie nach sechs Tagen die Dereplikationsplatte aus dem Inkubator. Entfernen Sie mit steriler Pinzette vorsichtig die Nitrocellulosemembran von der Oberfläche des Bennett-Agars.Stellen Sie sicher, dass es nur ein geringes Sporenwachstum an den Rändern der Platte gibt, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination der zu verwendenden Überlagerung zu verringern. Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsfläche eben ist, und verwenden Sie eine serologische Pipette, um 23 Milliliter warmkationsangepassten MHB-Agar saugen zu können. Erstellen Sie eine Überlagerung, indem Sie 20 Milliliter gleichmäßig über die Oberfläche der Dereplikationsplatte verteilen, sodass der Rest des Agars in der Pipette bleibt, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern.Legen Sie den Deckel auf die Platte. Drehen Sie die Platte vorsichtig, bis das Medium alle Bereiche abdeckt und stört sie nicht, bis der Agar vollständig eingestellt ist. Nach dem Abkühlen und Erstarren die Dereplikationsplatte in die versiegelte Plastiktüte zurückgeben und über Nacht bei vier Grad Celsius auf den Kopf stellen, so dass sekundäre Metaboliten in die MHB-Agar-Overlay stritten.Am selben Tag impfen Sie eine frische ARP- oder MARP-Schablone, indem Sie zuerst 100 Mikroliter Kation in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte einteilen. Nehmen Sie die gefrorene NaRP- oder MARP-Bibliotheksplatte aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Entfernen Sie die Aluminiumdichtung, bevor sich auf der Unterseite Kondensation zu bilden beginnt.Mit sterilen 96-Well-Pinning-Werkzeugen vorsichtig aus dem gefrorenen Lager ARP oder MARP Bibliotheksplatte anheften und die frische MHB mit 96-Well-Platten impfen. Um die Kontamination während der Dereplikation zu minimieren, bereiten Sie so viele ARP- oder MARP-Bibliotheksplatten vor, die nur für die Dereplikation von zwei bis drei Dereplikationsplatten pro Bibliotheksplatte erforderlich sind. Nach Der Fertigstellung eine neue sterile Aluminiumdichtung auf die gefrorene Schablone legen und in den Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius zurückbringen.Die geimpften 96-Well-Platten in eine lose versiegelte Plastiktüte geben und bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 U/min 18 Stunden bebrüten. Entfernen Sie die ARP- oder MARP-Vorlage aus dem Inkubator, und stellen Sie sicher, dass keine Verunreinigungen vorhanden sind, indem Sie die Platte mit der ARP- oder MARP-Vorlagenkarte vergleichen. Entfernen Sie die Dereplikationsplatten von vier Grad Celsius und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausdemieren.Wenn es Kondensation gibt, öffnen Sie die Deckel und lassen Sie in einer sterilen Umgebung trocknen. Mit sterilen Pinning-Werkzeugen von der ARP- oder MARP-Bibliotheksplatte auf die Oberfläche der MHB-Agar-Overlay der Dereplikationsplatten. Achten Sie darauf, den Agar nicht zu durchstechen.Lassen Sie die Vorlage inoculum für drei bis fünf Minuten trocknen. Die geimpften Dereplikationsplatten kopfüber in eine versiegelte Plastiktüte legen und über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Analysieren Sie am nächsten Tag die Dereplikationsergebnisse, indem Sie das Wachstum auf der Dereplikationsplatte mit Bohrungen vergleichen, die der ARP- oder MARP-Karte entsprechen.In diesem ARP- oder MARP-Dereplikationsworkflow wurde ein positives Dereplikationsergebnis erzielt. Wobei der für den Stamm WAC 8921 hergestellte Extrakt als Chloramphenicol-Produzent identifiziert wurde. Der Mangel an ARP-Wachstum deutet auf das Vorhandensein eines unbekannten Antibiotikums oder eines weniger häufig gefundenen Antibiotikums hin, das nicht in der ARP- oder MARP-Bibliotheksplatte berücksichtigt wurde.Ein für das MARP einzigartiges Wachstumsmuster wurde aufgrund seiner Verwendung sowohl des Wildentyps E.coli BW25113 als auch eines hyperdurchlässigen und e-flux-defizienten Mutanten E.coli BW25113 bamB tolC gebildet. Dieses Ergebnis deutet auf das Vorhandensein einer Verbindung mit antimikrobieller Aktivität hin, die nicht in der Lage war, eine intakte äußere Membran zu übertreffen. Diese E.coli-Wachstumsmuster deuten auf eine unsachgemäße Sterilisation von Pinning-Werkzeugen hin, was zur Übertragung unbekannter E.coli-Stämme über das Overlay führt.Und ein Beispiel für ARP oder MARP gefrorene Stock Bibliothek Platte Kontamination wird hier mit drei verschiedenen E.coli Kolonien auf der rechteckigen Petrischale Oberfläche gewachsen gezeigt. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Agar-Overlay während der Dereplikation durchbohrt wurde. Die MHB-Überlagerungskontamination kann auch während des Dereplikationsprozesses auftreten, was ein unregelmäßiges Wachstumsmuster auf der Oberfläche der Überlagerung zeigt.Das Wichtigste, was Sie bei der Befolgung dieses Protokolls beachten sollten, ist die Verwendung der richtigen Sterilisation und aseptischer Techniken, um sicherzustellen, dass Sie nicht in irgendeinem Schritt aufgrund von Kontamination zurückgehalten werden. Dazu gehört auch die Vorbereitung der Nitrocellulosemembran, so dass sie so eng wie möglich an die Oberfläche der Bennett-Agarplatte passt, um die Ausbreitung von Sporen beim Gießen der MHB-Überlagerung zu minimieren. Darüber hinaus ist es auch äußerst wichtig, bei der Inokulation der Bibliotheksplatten und der Dereplikierung richtig sterilisierte Pinning-Geräte zu verwenden, um das sauberste Ergebnis zu erzielen.Neben der Dereplikation bekannter Antibiotika kann diese Methode auch zur Identifizierung von Hilfsstoffen eingesetzt werden, die in Verbindung mit bestehenden Antibiotika zur Rettung ihrer Aktivität verwendet werden können. Obwohl die Dereplikation von Antibiotika keine neue Technik ist, ist sie berüchtigt dafür, ressourcenintensiv und zeitaufwändig zu sein. Die ARP- und MARP-Plattform geben auf, wie die Dereplikation von Antibiotika nicht groß sein muss, sondern über einen Zeitraum von zwei Wochen mit minimaler Ausrüstung abgeschlossen werden kann.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Verstärkung und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-infizierten Personen mit Viruslast unter der Nachweisgrenze von Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Die Prüfung der Host-Phänotypen in<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Nach der Behandlung mit Antibiotika

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In Antwort auf Antibiotika-Behandlung

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatisierte verhaltensbasierte Analyse der großen C. Elegans Populationen verwenden ein breites Sichtfeld Tracking-Plattform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria Gonorrhoeae Aggregate verwenden ATP-Auslastung kommerziellen Assays und Live/Dead Färbung

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...