Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

מחקר במעבדת רייט בנוגע ל-ARP/MARP נתמך על ידי קרן מחקר אונטריו ומכונים קנדיים של מלגת מחקר בריאות (FRN-148463). אנו רוצים להכיר בסומר צ'ו על הסיוע בהרחבת ובארגון של ספריית ה-ARP.

1. הכנת הספריה E. coli מניות גליצרול (מאת אגר סלטס)
<ol><li>פס החיידק ARP/MARP E. coli מציר lysogeny קימוט (LB) אגר הסלטים על מנות פטרי המכילות LB אגר ואת סמן לבחירה המתאים (שולחן 1).</li>
	<li>הכינו תרבויות עבור כל אחד מזני E. coli על ידי הנעם 3 מ ל של LB המכיל את סמן לבחירה המתאים עם מושבה אחת. לגדול ...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר לעיל יכול להיות מיושם הן גילוי של תרכובות מיקרוביאלית הרומן ושדון שניתן להשתמש בשילוב עם אנטיביוטיקה קיימים כדי להציל את פעילותם. פלטפורמת מנצל את הפלטפורמות הגבוהות של המצע של מנגנוני התנגדות ואנטיביוטיקה קנצוני שלהם, לתרכובות dereplicate בתוך תמציות טבעי גולמי מוצר. למרות ...

מאז גילוי של פניצילין ב 1928, מוצרים טבעיים נגזר מיקרואורגניזמים סביבתיים הוכיחו להיות מקור עשיר של תרכובות מיקרוביאלית1. כ 80% של אנטיביוטיקה המוצר הטבעי נגזרות חיידקים של סוג Streptomyces ואקטיטיטים אחרים, בעוד 20% הנותרים מופק על ידי מינים פטרייתי1. כמה מהפיגומים הנפוצים ביותר לאנטיביוטיקה המשמשים במרפאה כגון β-lactams, טטרציקווים, rifamycins, ו הקוגליניים, היו מבודדים במקור מחיידקים2. עם זאת, בשל עלייתה של עמיד בפני סמים (mdr) חיידקים, פאנל הנוכחי שלנו של אנטיביוטיקה הפך פחות יעיל בטיפול3,4. אלה כוללים את "ESKAPE" פתוגנים (כלומר, vancomycin עמידים בפני בידור ו β-lactam עמידים בפני לקטקוקוס, klebsiella דלקת ריאות, הפסאודומונס aeruginosa, acineטבק הביטוחהעצמי, ו Enterobacter sp.), המהווה תת-ערכה של חיידקים, הנחשבים לבעלי הסיכון הגבוה ביותר על-ידי מספר רשויות בריאות הציבור הגדולות כגון ארגון הבריאות העולמי3,4,5. הופעתה הגלובלית התפשטות של אלה mdr פתוגנים תוצאות הצורך קבוע עבור אנטיביוטיקה הרומן3,4,5. למרבה הצער, שני העשורים האחרונים הוכיחו כי גילוי של אנטיביוטיקה הרומן ממקורות מיקרוביאלית הוא קשה יותר ויותר6. הגישות הנוכחיות לגילוי הסמים כוללות הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות אקטיביים, כולל ספריות מוצר טבעי לחלץ, המאפשר אלפי תמציות להיבדק בזמן נתון2. עם זאת, לאחר מזוהה פעילות מיקרוביאלית, השלב הבא הוא לנתח את התוכן של התמצית גולמי כדי לזהות את הרכיב הפעיל ולסלק את אלה המכילים תרכובות ידועות או יתירים7,8. תהליך זה, המכונה dereplication, חיוני כדי למנוע ו/או להקטין באופן משמעותי את הזמן המושקע בגילוי מחדש של אנטיביוטיקה ידועה7,9. למרות שצעד הכרחי בגילוי הסמים הטבעי של המוצר, dereplication הוא מפרך לשמצה ואינטנסיבי משאבים10.
מאז beutler et al. לראשונה נטבע את המונח "dereplication", מאמצים נרחבים נעשו כדי לפתח אסטרטגיות חדשניות לזיהוי מהיר של אנטיביוטיקה ידועה11,12. כיום הכלים השכיחים ביותר המשמשים לdereplication כוללים מערכות כרומטוגרפיות אנליטיות כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, ספקטרומטר מסה, ושיטות זיהוי מבוססות תהודה מגנטית גרעינית11,13. למרבה הצער, כל אחת מהשיטות הללו מחייבת שימוש בציוד אנליטי יקר ובפרשנות נתונים מתוחכמת.
בניסיון לפתח שיטה dereplication שניתן לבצע במהירות ללא ציוד מיוחד, הקמנו פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה (ARP)10. ARP יכול לשמש לגילוי של שדון אנטיביוטי, הפרופיל של תרכובות אנטיביוטיות חדשות נגד מנגנוני ההתנגדות ידוע, ואת dereplication של אנטיביוטיקה ידועים בתמציות הנגזרות של אקאובקטריה וחיידקים אחרים. כאן, אנו מתמקדים ביישום שלה dereplication אנטיביוטי. ARP מנצל את הספריה של איזוגניים es, המאשכיה זנים המבטא גנים בודדים התנגדות כי הם יעילים נגד אנטיביוטיקה הנפוץ ביותר מחדש גילו14,15. כאשר הספרייה E. coli גדל בנוכחות של אורגניזם משני מייצר מטבוליזם, את הזהות של המתחם ניתן להסיק על ידי הצמיחה של החיידק של E. coli המבטאים הגן הקשור שלה התנגדות10. כאשר ה-ARP דווח לראשונה, הספריה כללה > 40 גנים הענקת עמידות ל -16 שיעורי אנטיביוטי. תבנית הdereplication המקורית תוכננה להקיף תת-ערכה של גנים ההתנגדות לכל מחלקה לאנטיביוטיקה כדי לספק מידע לגבי מחלקת משנה אנטיביוטי בתהליך dereplication. כיום, ה-ARP מורכב מ> 90 גנים המקנים עמידות ל -18 שיעורים אנטיביוטיים. באמצעות האוסף הנרחב שלנו של גנים ההתנגדות, תבנית dereplication משנית פותחה והוא ידוע כפלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה מינימלית (MARP). תבנית זו נוצרה כדי למנוע יתירות גנטית כדי פשוט לספק מידע לגבי המעמד האנטיביוטי הכללי כי מטבוליט dereplicated lite קשורה. בנוסף, התבנית MARP מחזיקה הן מסוג wildtype ואת המתח היתר/לקוי של E. coli BW25113 (e. Coli BW25113 ΔbambΔtolc), לעומת הגלגול המקורי של ה-ARP, אשר רק מנצל את המתח היפרחדיר. היבט ייחודי זה יוצר פנוטיפים נוספים במהלך dereplication, המציין את היכולת תרכובות לחצות את הקרום החיצוני של חיידקים גראם שליליים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול חזק להיות שלאחר מכן כאשר מקבל הפחתה עם ה-ARP ו/או MARP, להדגיש את הצעדים הקריטיים ביותר לעקוב, ולדון בתוצאות אפשריות שונות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

אחד האתגרים העיקריים בחיפוש אחר אנטיביוטיקה חדשה מתמציות המוצר הטבעי הוא גילוי מחדש של תרכובות נפוצות. כדי להתמודד עם האתגר הזה, dereplication, שהוא תהליך של זיהוי תרכובות ידועות, מבוצע על דגימות של עניין. שיטות לdereplication כגון הפרדה אנליטית ולאחריה ספקטרומטר מסה הינן צורכות זמן רב ועתירות משאבים. כדי לשפר את תהליך dereplication, פיתחנו את פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה (ARP). ARP היא ספריה של כ 100 גנים עמידות לאנטיביוטיקה ששוכפל בנפרד לתוך es, coli. אוסף זה הנבג יש יישומים רבים, כולל שיטה חסכונית ונתיישב עבור אנטיביוטיקה dereplication. התהליך כולל תסיסה של חיידקים המייצרים אנטיביוטיקה על פני השטח של מנות פטרי מלבני המכילות בינונית יציבה, ובכך מאפשר הפרשה ודיפוזיה של מטבוליטים משני דרך המדיום. לאחר תקופת תסיסה של 6 ימים, מסירים את ביומסה החיידקים, ומוסיפים לצלחת הפטרי דק שכבת-על כדי ליצור משטח חלק ולאפשר את התפתחותם של זנים מחוון ה-coli . האוסף שלנו של זני ARP מוצמד לאחר מכן על פני השטח של צלחת פטרי המכילה את האנטיביוטיקה. הצלחת היא הדגירה הבאה לילה כדי לאפשר צמיחה E. coli על פני השטח של כיסוי. רק זנים המכילים התנגדות אנטיביוטי ספציפי (או הכיתה) לגדול על פני השטח הזה מאפשר זיהוי מהיר של התרכובת המיוצר. שיטה זו בוצעה בהצלחה לזיהוי יצרנים של אנטיביוטיקה ידועה וכאמצעי לזיהוי אלה המייצרים תרכובות הרומן.

התוצאות הבאות הושגו כאשר אוסף של זנים של מdereplicated לאנטיביוטיקה הפקת הריבית היו באמצעות ה-ARP ו/או MARP.
דיאגרמה של זרימת העבודה dereplication ARP/MARP מתוארת באיור 1, ומפות לוחית הספרייה מוצגות באיור המשלים 1 ובאיור 2. איור 2 מדגים תוצאה חיו...

Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

אנו מתארים פלטפורמה כי מנצל את הספרייה של עמידות לאנטיביוטיקה איזוגניים לdereplication של אנטיביוטיקה . הזהות של אנטיביוטיקה המיוצר על ידי חיידקים או פטריות ניתן להסיק על ידי הצמיחה של E. coli ביטוי ההתנגדות המתאים שלה הגן. פלטפורמה זו יעילה כלכלית וחסכונית בזמן.

אנטיביוטי Dereplication באמצעות פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

הפרוטוקול שלנו הוא משמעותי כי זה מאפשר הן דרמטיזציה חסכונית בזמן של אנטיביוטיקה ידועה ללא שימוש בציוד מיוחד. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא התאמה אישית של תבנית. משמעות הדבר היא כי אדם יכול להתאים אילו גנים התנגדות שהם רוצים לכלול בתבנית הספרייה שלהם מבוסס על הרמה הרצויה של ספציפיות מצע רחב או צר שלהם.לדוגמה, בטא לקטם מבטא תבנית E.coli ניתן להכין על מנת לאפשר dereplication ספציפי מאוד של בטא לקטמים וכיתות המשנה השונות שלהם. באמצעות טכניקת ספיגה, פיפטה 500 microliters של cation מותאם MHB ממאגר סטרילי לתוך כל באר של סטרילי, 96 צלחת באר עמוקה. עם לוחות זן ARP או MARP מוכנים, השתמש במקל המוליך כדי לחסן את צלחת באר עמוקה 96 בהתאם למפת ARP או MARP.מניחים קרום איטום נושם על פני השטח של צלחת באר עמוקה להדק אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 250 סל"ד. ודא כי אין בארות מזוהמות. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, מעבירים 100 מיקרוליטרים מכל באר של צלחת הבאר העמוקה לצלחת תחתונה סטרילית של 96 בארות.מוסיפים 100 מיקרוליטרים של 50% גליצרול סטריליים לתוך כל באר ומערבבים על ידי צינורות בעדינות למעלה ולמטה. הכינו לפחות חמש צלחות ספרייה. מכסים את הצלחות עם אטמי אלומיניום סטריליים ומבטיחים שכל באר אטומה בנפרד.מניחים את מכסה הצלחת על גבי אטם האלומיניום ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס. באמצעות מקל מוליטור עץ, בעדינות לגרד נבגים מפני השטח של מושבת סטרפטומיצ'ים ולהעביר אותו לתוך מבחנה המכילה חרוז זכוכית סטרילי אחד ושלושה מיליליטר של מדיום אנטיביוטי סטרפטומיציס. סגור את המבחנה באופן רופף עם כובע כדי לאפשר aeration.באמצעות אותו מקל המוליך מעץ, פס שליטה סטריליות על צלחת פטרי המכיל אגר של בנט. דגירה הצינור המכיל תרבות זרעים ב 30 מעלות צלזיוס עם aeration במשך שישה ימים ב 250 סל"ד ואת צלחת בקרת סטריליות ב 30 מעלות צלזיוס במשך שישה ימים. לאחר מכן, על משטח מפלס, להכין צלחות dereplication.שאפו 23 מיליליטר של אגר חם של בנט לתוך פיפטה סרולוגית ולחלק 20 מיליליטר באופן שווה על פני השטח של צלחת פטרי מלבנית, משאיר את שאר המדיום בפיפטה כדי למנוע היווצרות בועת אוויר. כסו את הצלחת במכסה. מסובבים בעדינות את הצלחת עד שהמדיום מכסה את כל אזורי הצלחת ולא מפריעים לה עד שהגר מוגדר לחלוטין.לאחר מכן, להכין יריעות קרום nitrocellulose באמצעות מכסה צלחת פטרי מלבני כתבנית מעקב, כך הסדינים להתאים את פני השטח של צלחת dereplication. חותכים את הסדינים ומקלים אותם אוטומטית בשקית סטרילית. עכשיו, לבדוק את לוחית בקרת הסטריליות כדי להבטיח כי אין מזהמים נוכחים לאחר שישה ימים של דגירה.אם ללא זיהום, הסר את המכסה של צלחת פטרי מלבנית פיפט 200 microliters של תרבות הזרעים על פני השטח של אגר של בנט בצלחת מלבנית. השתמש ספוגית כותנה סטרילית כדי להפיץ באופן שווה את התרבות על פני השטח של הצלחת כולה. כדי למקם את קרום nitrocellulose מוכן על גבי התרבות על פני השטח של צלחת פטרי, ליישר את הקצה התחתון של הממברנה לקצה התחתון של צלחת פטרי לאט להחיל את הממברנה מהקצה התחתון לקצה העליון של הצלחת.השתמש ספוגית כותנה סטרילית כדי להחליק את כל בועות האוויר שאולי נוצרו בין ממשק אגר קרום, להבטיח כי הממברנה הוא סומק אל אגר. הממברנה מאפשרת לאורגניזמים להתפזר על פני השטח שלה בעוד מטבוליטים משניים עשויים להיות מופרשים לתוך המדיום שמתחת. שים את המכסה בחזרה על צלחת פטרי מלבנית והניח אותו במהופך בשקית ניילון אטומה.דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך שישה ימים. לאחר שישה ימים, להסיר את צלחת dereplication מן החממה. באמצעות פינצטה סטרילית, הסר בזהירות את קרום הניטרוסלולוס מפני השטח של אגר בנט.ודא שיש רק צמיחה נבגים קלה סביב הקצוות של הצלחת כדי להקטין את הסיכויים של זיהום שכבת היתר להתווסף. ודא שמשטח העבודה הוא ברמה ולהשתמש פיפטה סרולוגית כדי לשאיף 23 מיליליטר של אגר MHB מותאם חיתוך חם. צור כיסוי על ידי חלוקת 20 מיליליטר באופן שווה על פני השטח של צלחת dereplication, משאיר את שאר אגר בפיפט כדי למנוע היווצרות בועת אוויר.מניחים את המכסה על הצלחת. מסובבים בעדינות את הצלחת עד שהמדיום מכסה את כל האזורים ולא מפריעים לו עד שהגר מוגדר לחלוטין. לאחר מקורר ומצק, להחזיר את צלחת dereplication לשקית ניילון אטום ולאחסן אותו במהופך בארבע מעלות צלזיוס לילה, המאפשר דיפוזיה של מטבוליטים משניים לתוך כיסוי MHB אגר.באותו יום, לחסן תבנית ARP או MARP טרי על ידי צינור הראשון צינור 100 microliters של MHB מותאם הקטיון לתוך כל באר של צלחת 96 באר. מוציאים את צלחת ספריית ARP או MARP במלאי הקפוא מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. הסר את חותם האלומיניום לפני עיבוי מתחיל להיווצר על החלק התחתון שלה.בעזרת כלי הצמדה סטריליים של 96 בארות, יש להצמיד בזהירות מהמלאי הקפוא ARP או מצלחת ספריית MARP ולחסן את ה-MHB הטרי המכיל צלחות של 96 בארות. כדי למזער את הזיהום במהלך dereplication, להכין כמו לוחות ספריית ARP או MARP רבים הדרושים רק dereplicate שניים עד שלושה לוחות dereplication לכל צלחת הספרייה. לאחר השלמת, לשים חותם אלומיניום סטרילי חדש על התבנית הקפואה ולהחזיר אותו למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס.מניחים את הצלחות מחוסנות 96 באר בתוך שקית ניילון אטום באופן רופף דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 250 סל"ד במשך 18 שעות. הסר את התבנית ARP או MARP מהאינקובטור וודא שלא קיימים מזהמים על-ידי השוואת הלוח למפת התבנית ARP או MARP. מוציאים את צלחות הדרפילציה מארבע מעלות ומאפשרים לצייד לטמפרטורת החדר.אם יש עיבוי, לפתוח את המכסים ולאפשר להתייבש בסביבה סטרילית. בעזרת כלי הצמדה סטריליים, הצמד מצלחת ספריית ARP או MARP אל פני השטח של שכבת-על של MHB agar של לוחות הדרפילציה. תיזהר לא לנקב את אגר.אפשר לתבנית להתייבש למשך שלוש עד חמש דקות. מניחים את צלחות הדרפילציה מחוסנות במהופך בשקית ניילון אטומה ודגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, לנתח את תוצאות dereplication על ידי השוואת הצמיחה על צלחת dereplication ל בארות התואמות את מפת ARP או MARP.בזרימת עבודה זו של ARP או MARP dereplication, הושגה תוצאת dereplication חיובית. איפה התמצית מוכנה עבור המתח WAC 8921 זוהה כמפיק כלוראמפניקול. חוסר הצמיחה ARP מציין את נוכחותו של אנטיביוטיקה לא ידועה או אנטיביוטיקה פחות נפוץ כי לא היה בחשבון בצלחת ספריית ARP או MARP.דפוס צמיחה ייחודי MARP נוצרה בגלל ניצול של סוג פראי E.coli BW25113 ו מוטציה היפר חדירה ו- e-flux לקוי E.coli BW25113 bamB tolC. תוצאה זו מרמזת על נוכחות של תרכובת עם פעילות מיקרוביאלית שלא הצליחה לעלות על קרום החיצוני שלם. דפוסי צמיחה E.coli זה מרמז על עיקור לא תקין של כלי הצמדה, וכתוצאה מכך העברת זנים E.coli לא ידוע על פני שכבת-על.ודוגמה של זיהום צלחת ספריית מלאי קפוא ARP או MARP מוצג כאן עם שלוש מושבות E.coli ברורות גדל על משטח צלחת פטרי מלבני. תוצאה זו מצביעה על כך שכבת-על אגר נוקב במהלך dereplication. זיהום הקשורים שכבת MHB יכול להתרחש גם במהלך תהליך dereplication, מראה דפוס צמיחה לא סדיר על פני השטח של שכבת-על.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ביצוע פרוטוקול זה הוא להשתמש עיקור נאות וטכניקות aseptic על מנת להבטיח כי אתה לא מוחזק בכל שלב עקב זיהום. זה כולל הכנת קרום nitrocellulose כך שיתאים לפני השטח של צלחת אגר של בנט קרוב ככל האפשר על מנת למזער את התפשטות הנבגים בעת שפיכת כיסוי MHB. בנוסף, חשוב מאוד להשתמש בציוד הצמדה מעוקר כראוי בעת חיטוי לוחות הספרייה ו dereplicating על מנת לייצר את התוצאה הנקייה ביותר.בנוסף dereplicating אנטיביוטיקה ידועה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על זיהוי מתודולוגיות אשר ניתן להשתמש בהם בשילוב עם אנטיביוטיקה קיימת כדי להציל את פעילותם. למרות dereplication אנטיביוטי הוא לא טכניקה חדשה, זה ידוע לשמצה להיות משאבים אינטנסיבי זמן רב. פלטפורמת ARP ו MARP לעזור לשפוך אור על איך dereplication אנטיביוטי לא צריך להיות ייצור גדול, אלא ניתן להשלים על פני תקופה של שבועיים באמצעות ציוד מינימלי.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

הגברה וכימות HIV-1 RNA אצל אנשים שנדבקו ב-HIV עם המון ויראלי מתחת לגבול של זיהוי על ידי מבחני קלינית רגילה

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

בחינת פנוטיפים מארח ב<em&gt; Affinis Gambusia</em&gt; בעקבות טיפול אנטיביוטי

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; בתגובה לטיפול אנטיביוטי

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

פולימראז כמותי המבוסס על תגובת שרשרת ניתוחים של מאתר Microbiota מעיים לאחר טיפול אנטיביוטי דרך הפה

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

אוטומטיות התנהגותית ניתוח של גדול C. elegans אוכלוסיות שימוש רחב שדה-of-view מעקב פלטפורמה

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae ATP-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...