Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
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La ricerca nel laboratorio Wright che si ritrova nell'ARP/MARP è stata sostenuta dall'Ontario Research Fund e dal Canadian Institutes of Health Research grant (FRN-148463). Vorremmo riconoscere Sommer Chou per aver contribuito all'espansione e all'organizzazione della libreria ARP.

1. Preparazione di E. coli Library Glycerol Stocks (da Agar Slants)
<ol><li>Streak i ceppi ARP/MARP E. coli dal brodo di lisogenia (LB) agar obise piatti Petri contenenti agar LB e il marcatore selezionabile appropriato (Tabella 1).</li>
	<li>Preparare le colture per ciascuno dei ceppi di E. coli inoculando 3 mL di LB contenenti il marcatore selezionabile appropriato con una singola colonia. Coltivare durante la notte a 37 gradi centigradi con aerazione (250 giri/min).</li>
	...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

Il protocollo sopra descritto può essere applicato sia alla scoperta di nuovi composti antimicrobici e di adiuvanti che possono essere utilizzati in combinazione con antibiotici esistenti per salvare la loro attività. La piattaforma sfrutta l'elevata specificità del substrato dei meccanismi di resistenza e dei loro antibiotici in cognato, per dereplicare i composti all'interno di estratti di prodotti naturali grezzi. Anche se il tempo necessario per la preparazione delle piastre di dereplicazione è lungo (2 settimane...

Dalla scoperta della penicillina nel 1928, i prodotti naturali derivati da microrganismi ambientali hanno dimostrato di essere una ricca fonte di composti antimicrobici1. Circa l'80% degli antibiotici del prodotto naturale sono derivati da batteri del genere Streptomyces e altri actinomycetes, mentre il restante 20% è prodotto da specie fungine1. Alcuni degli scaffold antibiotici più comuni utilizzati nella clinica, come i lactam, le tetracicline, i rifamycin e gli amminocolici, erano originariamente isolati dai microbi2. Tuttavia, a causa dell'aumento dei batteri multifarmacoresistenti (MDR), il nostro attuale gruppo di antibiotici è diventato meno efficace nel trattamento3,4. Questi includono gli agenti patogeni "ESKAPE" (cioè enterococci resistenti alla vancomicina e Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinebacter baumannii, e Enterobacter sp.), che sono un sottoinsieme di batteri ritenuti associati al più alto rischio da un certo numero di importanti autorità sanitarie pubbliche come l'Organizzazione Mondiale della Sanità3,4,5. L'emergere e la diffusione globale di questi patogeni MDR si traduce in un costante bisogno di nuovi antibiotici3,4,5. Purtroppo, gli ultimi due decenni hanno dimostrato che la scoperta di nuovi antibiotici da fonti microbiche è sempre più difficile6. Gli attuali approcci alla scoperta di farmaci includono lo screening ad alto consumo di composti bioattivi, comprese le librerie di estratti di prodotto naturali, consentendo il test di migliaia di estratti in un dato momento2. Tuttavia, una volta rilevata l'attività antimicrobica, il passo successivo è quello di analizzare il contenuto dell'estratto grezzo per identificare il componente attivo ed eliminare quelli che contengono composti noti o ridondanti7,8. Questo processo, denominato dereplicare, è fondamentale per prevenire e/o ridurre significativamente il tempo dedicato alla riscoperta di antibiotici noti7,9. Anche se un passo necessario nella scoperta di farmaci di prodotto naturale, dereplication è notoriamente laborioso e ad alta intensità dirisorse 10.
Da quando Beutler et al. per la prima volta ha coniato il termine "dereplication", sono stati fatti sforzi ampi per sviluppare strategie innovative per la rapida identificazione degli antibiotici noti11,12. Oggi gli strumenti più comuni utilizzati per la dereplicazione includono sistemi cromatografici analitici come la cromatografia liquida ad alte prestazioni, la spettrometria di massa e i metodi di rilevamento basato sulla risonanza magnetica nucleare11,13. Purtroppo, ognuno di questi metodi richiede l'uso di costose apparecchiature analitiche e un'interpretazione sofisticata dei dati.
Nel tentativo di sviluppare un metodo di dereplicazione che può essere eseguito rapidamente senza attrezzature specializzate, abbiamo stabilito la piattaforma di resistenza agli antibiotici (ARP)10. L'ARP può essere utilizzato per la scoperta di adiuvanti antibiotici, la profilazione di nuovi composti antibiotici contro meccanismi di resistenza noti e la dereplicazione di antibiotici noti in estratti derivati da actinobatteri e altri microbi. Qui, ci concentriamo sulla sua applicazione nella dereplicazione antibiotica. L'ARP utilizza una libreria di ceppi isogenici di Escherichia coli che esprimono singoli geni di resistenza che sono efficaci contro gli antibiotici più comunemente riscoperti14,15. Quando la biblioteca E. coli viene coltivata in presenza di un organismo secondario che produce metaboliti, l'identità del composto può essere dedotta dalla crescita di ceppi di E. coli che esprimono il suo gene di resistenza associato10. Quando l'ARP è stato segnalato per la prima volta, la biblioteca consisteva di >40 geni che conferevano resistenza a 16 classi di antibiotici. Il modello originale di dereplicazione è stato progettato per comprendere un sottoinsieme di geni della resistenza per classe di antibiotici per fornire informazioni riguardanti la sottoclasse di antibiotici durante il processo di dereplicazione. Oggi, l'ARP è composto da >90 geni che conferiscono resistenza a 18 classi di antibiotici. Utilizzando la nostra vasta collezione di geni di resistenza, è stato sviluppato un modello di dereplicazione secondario ed è noto come la piattaforma di resistenza agli antibiotici minima (MARP). Questo modello è stato creato per eliminare la ridondanza genica e per fornire semplicemente informazioni riguardanti la classe antibiotica generale a cui è correlato un metabolita. Inoltre, il modello MARP possiede sia wildtype che un ceppo iperpermeabile/efflusso carente di E. coli BW25113(E. coli BW25113 -bam B-tolC), rispetto all'incarnazione originale dell'ARP, che solo utilizza il ceppo iperpermeabile. Questo aspetto unico crea fenotipi aggiuntivi durante la dereplicazione, indicando una capacità di composti di attraversare la membrana esterna dei batteri Gram-negativi. Qui, descriviamo un protocollo robusto da seguire quando descriviamo con l'ARP e/o la MARP, evidenziamo i passaggi più critici da seguire e discutiamo i vari possibili risultati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

Una delle principali sfide nella ricerca di nuovi antibiotici da estratti di prodotti naturali è la riscoperta di composti comuni. Per affrontare questa sfida, la dereplicazione, che è il processo di identificazione dei composti noti, viene eseguita su campioni di interesse. I metodi per la dereplicazione, ad esempio la separazione analitica seguita dalla spettrometria di massa, richiedono molto tempo e richiedono molto tempo. Per migliorare il processo di dereplicazione, abbiamo sviluppato la piattaforma di resistenza agli antibiotici (ARP). L'ARP è una libreria di circa 100 geni di resistenza agli antibiotici che sono stati clonati individualmente in Escherichia coli. Questa raccolta di ceppi ha molte applicazioni, tra cui un metodo facile e conveniente per la dereplicazione antibiotica. Il processo prevede la fermentazione di microbi che producono antibiotici sulla superficie di piatti Petri rettangolari contenenti mezzo solido, consentendo così la secrezione e la diffusione di metaboliti secondari attraverso il mezzo. Dopo un periodo di fermentazione di 6 giorni, la biomassa microbica viene rimossa e una sottile sovrapposizione di agar viene aggiunta alla parabola Petri per creare una superficie liscia e consentire la crescita dei ceppi dell'indicatore E. coli. La nostra collezione di ceppi ARP viene poi appuntata sulla superficie del piatto Petri che contiene antibiotici. La piastra viene successivamente incubata durante la notte per consentire la crescita di E. coli sulla superficie della sovrapposizione. Solo i ceppi contenenti resistenza a un antibiotico (o classe) specifico crescono su questa superficie consentendo una rapida identificazione del composto prodotto. Questo metodo è stato utilizzato con successo per l'identificazione dei produttori di antibiotici noti e come mezzo per identificare quelli che producono nuovi composti.

I seguenti risultati sono stati ottenuti quando una raccolta di ceppi di interesse che producono antibiotici è stata dereplicata utilizzando l'ARP e/o la MARP.
Un diagramma del flusso di lavoro di dereplica ARP/MARP è illustrato nella Figura 1e le mappe a piastre della libreria sono illustrate nella figura supplementare 1 e nella figura supplementare 2. Figura 2 dimostra un risultato positivo di der...

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Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Descriviamo una piattaforma che utilizza una libreria di Escherichia coli resistente agli antibiotici isogenici per la dereplicazione degli antibiotici. L'identità di un antibiotico prodotto da batteri o funghi può essere dedotta dalla crescita di E. coli che esprime il suo rispettivo gene di resistenza. Questa piattaforma è economicamente efficace ed efficiente in termini di tempo.

Dereplication antibiotico utilizzando la piattaforma di resistenza agli antibiotici

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Il nostro protocollo è significativo perché consente sia la dereplicazione economica che tempestiva di antibiotici noti senza l'uso di attrezzature specializzate. Il principale vantaggio di questa tecnica è la personalizzazione dei modelli. Ciò significa che un individuo può personalizzare quali geni di resistenza desiderano includere nel modello di libreria in base al livello desiderato di specificità del substrato ampia o stretta.Ad esempio, un beta-lattamo esprime che il modello E.coli può essere preparato per consentire la dereplicazione altamente specifica dei beta-lattami e delle loro varie sottoclassi. Utilizzando una tecnica settica, pipettare 500 microlitri di catione regolati MHB da un serbatoio sterile in ogni pozzo di una piastra sterile a 96 profondi pozzi. Con le piastre di deformazione ARP o MARP preparate, utilizzare un bastoncino applicatore per inoculare la piastra del pozzo profondo 96 in conformità con la mappa ARP o MARP.Posizionare una membrana sigillante traspirante sulla superficie della piastra del pozzo profondo e incubarla durante la notte a 37 gradi Celsius, 250 giri/min. Assicurarsi che non vi siano pozzi contaminati. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri da ogni pozzo della piastra del pozzo profondo a una piastra inferiore sterile a 96 po 'tondo.Aggiungere 100 microlitri di glicerolo sterile al 50% in ogni pozza e mescolare tubazione delicatamente su e giù. Preparare almeno cinque piatti della biblioteca. Coprire le piastre con guarnizioni sterili in alluminio e assicurarsi che ogni pozzo sia sigillato individualmente.Posizionare il coperchio della piastra sopra la guarnizione in alluminio e conservare a meno 80 gradi Celsius. Utilizzando un bastoncino applicatore di legno, raschiare delicatamente le spore dalla superficie di una colonia di streptomizi e trasferirla in una provetta contenente una perla di vetro sterile e tre millilitri di mezzo antibiotico streptomices. Chiudere la provetta liberamente con un tappo per consentire l'aerazione.Usando lo stesso bastoncino applicatore di legno, striature un controllo di sterilità su una piastra di Petri contenente l'agar di Bennett. Incubare il tubo contenente coltura di semi a 30 gradi Celsius con aerazione per sei giorni a 250 RPM e la piastra di controllo della sterilità a 30 gradi Celsius per sei giorni. Quindi, su una superficie piana, preparare le piastre di deeplicazione.Aspira 23 millilitri di agar caldo di Bennett in una pipetta sierologica e dispensa 20 millilitri uniformemente sulla superficie di una piastra di Petri rettangolare, lasciando il resto del mezzo nella pipetta per prevenire la formazione di bolle d'aria. Coprire il piatto con un coperchio. Ruotare delicatamente la piastra fino a quando il mezzo copre tutte le aree della piastra e non disturbarla fino a quando l'agar non si è impostato completamente.Successivamente, preparare i fogli di membrana di nitrocellulosa utilizzando un coperchio rettangolare della piastra di Petri come modello di tracciamento in modo che i fogli si adattino alla superficie della piastra di deeplicazione. Tagliare i fogli e autoclavarli in una busta sterile. Ora, controllare la piastra di controllo della sterilità per assicurarsi che non siano presenti contaminanti dopo sei giorni di incubazione.Se privo di contaminazione, rimuovere il coperchio della piastra rettangolare di Petri e pipettare 200 microlitri della coltura del seme sulla superficie dell'agar del Bennett nella piastra rettangolare. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per diffondere uniformemente la coltura sulla superficie dell'intero piatto. Per posizionare la membrana di nitrocellulosa preparata sopra la coltura sulla superficie della piastra di Petri, allineare il bordo inferiore della membrana al bordo inferiore della piastra di Petri e applicare lentamente la membrana dal bordo inferiore al bordo superiore della piastra.Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per appianare eventuali bolle d'aria che potrebbero aver formato tra l'interfaccia dell'agar a membrana, assicurando che la membrana sia a filo dell'agar. La membrana consente agli organismi di sporulare sulla sua superficie mentre i metaboliti secondari possono essere escreti nel mezzo sottostante. Riposizionare il coperchio sulla piastra rettangolare di Petri e posizionarlo capovolto in un sacchetto di plastica sigillato.Incubare a 30 gradi Celsius per sei giorni. Dopo sei giorni, rimuovere la piastra di dereplicazione dall'incubatore. Utilizzando pinzette sterili, rimuovere con cura la membrana di nitrocellulosa dalla superficie dell'agar del Bennett.Assicurarsi che vi sia solo una crescita minore delle spore intorno ai bordi della piastra per ridurre le possibilità di contaminare la sovrapposizione da aggiungere. Assicurarsi che la superficie di lavoro sia livellata e utilizzare una pipetta sierologica per aspirare 23 millilitri di agar MHB regolato per il catione caldo. Creare una sovrapposizione erogando 20 millilitri uniformemente sulla superficie della piastra di deeplicazione, lasciando il resto dell'agar nella pipetta per evitare la formazione di bolle d'aria.Posizionare il coperchio sul piatto. Ruotare delicatamente la piastra fino a quando il mezzo copre tutte le aree e non disturbarla fino a quando l'agar non si è impostato completamente. Una volta raffreddato e solidificato, riportare la piastra di deeplicazione nel sacchetto di plastica sigillato e conservarla capovolta a quattro gradi Celsius durante la notte, consentendo la diffusione di metaboliti secondari nella sovrapposizione dell'agar MHB.Lo stesso giorno, inoculare un modello ARP o MARP fresco con la prima pipettazione di 100 microlitri di MHB regolati per il catione in ogni pozzo di una piastra da 96 porri. Estraete la piastra di libreria ARP o MARP congelata dal congelatore meno 80 gradi Celsius. Rimuovere la guarnizione in alluminio prima che la condensa inizi a formarsi sul lato inferiore.Utilizzando strumenti sterili di pinning da 96 po', appuntare con cura dalla piastra di libreria ARP o MARP congelata e inoculare l'MHB fresco contenente piastre da 96 pozza. Per ridurre al minimo la contaminazione durante la dereplicazione, preparare tutte le lastre di libreria ARP o MARP necessarie per deeplicare solo due o tre piastre di deepliazione per piastra di libreria. Una volta completato, mettere una nuova guarnizione sterile in alluminio sul modello congelato e restituirla al congelatore meno 80 gradi Celsius.Posizionare le piastre inoculate da 96 po 'all'interno di un sacchetto di plastica vagamente sigillato e incubare a 37 gradi Celsius con tremare a 250 giri/min per 18 ore. Rimuovere il modello ARP o MARP dall'incubatore e assicurarsi che non siano presenti contaminanti confrontando la piastra con la mappa del modello ARP o MARP. Rimuovere le piastre di deeliazione da quattro gradi Celsius e lasciare equilibrare a temperatura ambiente.Se c'è condensa, aprire i coperchi e lasciare asciugare in un ambiente sterile. Utilizzando strumenti di pinning sterili, pin dalla piastra della libreria ARP o MARP sulla superficie della sovrapposizione di agar MHB delle piastre di deeplication. Fai attenzione a non perforare l'agar.Lasciare asciugare l'inoculo del modello per tre o cinque minuti. Posizionare le piastre di deepliazione inoculate capovolte in un sacchetto di plastica sigillato e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, analizzare i risultati della dereplicazione confrontando la crescita sulla piastra di deeplicazione con i pozzi che corrispondono alla mappa ARP o MARP.In questo flusso di lavoro di dereplicazione ARP o MARP è stato raggiunto un risultato positivo di dereplicazione. In cui l'estratto preparato per il ceppo WAC 8921 è stato identificato come produttore di cloramfenicolo. La mancanza di crescita ARP indica la presenza di un antibiotico sconosciuto o di un antibiotico meno comunemente trovato che non è stato contabiliato nella piastra della libreria ARP o MARP.Un modello di crescita unico per il MARP è stato formato a causa del suo utilizzo sia di tipo selvaggio E.coli BW25113 che di un mutante iper-permeabile ed e-flux carente di E.coli BW25113 bamB tolC. Questo risultato suggerisce la presenza di un composto con attività antimicrobica che non era in grado di superare una membrana esterna intatta. Questo modelli di crescita E.coli suggerisce la sterilizzazione impropria degli strumenti di pinning, con conseguente trasferimento di ceppi E.coli sconosciuti attraverso la sovrapposizione.E un esempio di contaminazione delle lastre di libreria di scorte congelate ARP o MARP è mostrato qui con tre distinte colonie di E.coli coltivate sulla superficie rettangolare della piastra di Petri. Questo risultato indica che la sovrapposizione dell'agar è stata perforata durante la dereplicazione. La contaminazione correlata alla sovrapposizione MHB può verificarsi anche durante il processo di deeplicazione, mostrando un modello di crescita irregolare sulla superficie della sovrapposizione.La cosa più importante da ricordare quando si segue questo protocollo è utilizzare tecniche di sterilizzazione e asettiche adeguate per assicurarsi di non essere trattenuti in alcun passaggio a causa della contaminazione. Ciò include la preparazione della membrana di nitrocellulosa in modo che si adatti alla superficie della piastra di agar del Bennett il più vicino possibile al fine di ridurre al minimo la diffusione delle spore quando si versa la sovrapposizione MHB. Inoltre, è anche estremamente importante utilizzare apparecchiature di pinning correttamente sterilizzate quando si inoculano le piastre della libreria e si dereplicano al fine di produrre il risultato più pulito.Oltre a dereplicare gli antibiotici noti, questo metodo può essere applicato all'identificazione di coadiuvanti che possono essere utilizzati in combinazione con antibiotici esistenti per salvare la loro attività. Sebbene la dereplicazione antibiotica non sia una nuova tecnica, è nota per essere ad alta intensità di risorse e dispendiosa in termini di tempo. La piattaforma ARP e MARP aiuta a far luce su come la dereplicazione antibiotica non deve essere una produzione di grandi dimensioni, ma piuttosto può essere completata per un periodo di due settimane utilizzando attrezzature minime.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

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Immunologia e infezioni

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Preparazione di un Sangue cultura pellet per il Rapid batterica identificazione e test di sensibilità agli antibiotici

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

L&#39;esame dei fenotipi host in<em&gt; affinis Gambusia</em&gt; In seguito a trattamento antibiotico

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

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Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In risposta al trattamento antibiotico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Analisi di basati su reazione a catena della polimerasi quantitativa del Microbiota intestinale murina dopo il trattamento antibiotico orale

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

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Analisi del comportamento di grande c. elegans popolazioni utilizzando un ampio campo di vista Monitoraggio piattaforma automatizzata

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

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L'esame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...