Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
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ARP/MARPに関するライトラボの研究は、オンタリオ州研究基金とカナダ保健研究所助成金(FRN-148463)によって支援されました。我々は、ARPライブラリの拡張と組織を支援したソマー・チョウを認めたい。

1.大腸菌ライブラリーグリセロールストックの調製(寒天スラントから)
<ol><li>ARP/MARP大腸菌株を、LB寒天と適切な選択マーカーを含むペトリ皿にリソジェニーブロス(LB)寒天のスラングからストリークします(表1)。</li>
	<li>1つのコロニーで適切な選択可能なマーカーを含むLBの3 mLを接種することにより、大腸菌株の各培養物を調記する。通気(250 rpm)で37°Cで一晩?...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

上記のプロトコルは、その活性を救出するために既存の抗生物質と組み合わせて使用することができる新しい抗菌化合物およびアジュバントの両方の発見に適用することができる。プラットフォームは、耐薬品抽出物内の化合物を脱複製するために、抵抗機構とその認知抗生物質の高い基質特異性を利用します。脱複製プレートの調製に要する時間は長い(~2週間)が、一晩のインキュベーショ...

1928年にペニシリンが発見されて以来、環境微生物由来の天然物は、抗菌化合物1の豊富な供給源であることが証明されている。天然物系抗生物質の約80%はストレプトマイセス属および他の多発性菌の細菌に由来し、残りの20%は真菌種1によって産生される。β-ラクタム、テトラサイクリン、リファマイシン、アミノグリコシドなどの診療所で使用される最も一般的な抗生物質足場のいくつかは、もともと微生物2から単離された。しかし、多剤耐性(MDR)細菌の増加により、現在の抗生物質のパネルは治療3、4であまり効果がなくなってきています。これらには、「ESKAPE」病原体(すなわち、バンコマイシン耐性腸球菌およびβ-ラクタム耐性黄色ブドウ球菌、クレブシエラ肺炎、シュードモナス・エルギノーサ、アシネトバクター・バウマンニ、およびエンテロバクターsp.)は、世界保健機関(WHO)3、4、5などの多くの主要な公衆衛生当局によって最も高いリスクに関連していると考えられる細菌のサブセットである。これらのMDR病原体の出現とグローバルな広がりは、新しい抗生物質3、4、5の絶え間ない必要性をもたらす。残念ながら、過去20年間で、微生物源からの新しい抗生物質の発見はますます困難であることを実証している6.創薬に対する現在のアプローチには、天然物抽出ライブラリーを含む生理活性化合物のハイスループットスクリーニングが含まれており、所定の時間2で何千もの抽出物を試験することができる。しかし、抗菌活性が検出されると、次のステップは、原油抽出物の内容物を分析して活性成分を同定し、既知または冗長化合物7、8を含むものを排除する。このプロセスは、脱複製と呼ばれ、既知の抗生物質7、9の再発見に費やされる時間を防止および/または大幅に短縮するために不可欠である。天然物創薬の必要なステップですが、脱複製は、非常に手間がかかり、リソース集約的な10.
Beutlerらは、最初に「脱複製」という用語を造語して以来、既知の抗生物質11、12の迅速な同定のための革新的な戦略を開発するための広範な努力がなされてきた。今日、脱複製に使用される最も一般的なツールには、高性能液体クロマトグラフィー、質量分析、および核磁気共鳴ベースの検出方法11、13などの分析クロマトグラフィーシステムが含まれる。残念ながら、これらの方法のそれぞれは、高価な分析機器と高度なデータ解釈の使用を必要とします。
特殊な装置なしで迅速に行うことができる脱複製法を開発する試みとして、抗生物質耐性プラットフォーム(ARP)10を確立した。ARPは、抗生物質アジュバントの発見、既知の耐性機構に対する新しい抗生物質化合物のプロファイリング、およびアクチノバクテリアおよび他の微生物由来の抽出物における既知の抗生物質の脱複製に使用することができる。ここでは、抗生物質の脱複製におけるその応用に焦点を当てる。ARPは、最も一般的に再発見された抗生物質14,15に対して有効である個々の抵抗遺伝子を発現する等方性エシェリヒア大腸菌株のライブラリーを利用する。大腸菌ライブラリーが二次代謝産物産生生物の存在下で成長すると、化合物の同一性は、関連する耐性遺伝子10を発現する大腸菌株の増殖によって推測されうる。ARPが最初に報告されたとき、ライブラリーは16の抗生物質クラスに対する耐性を与える>40遺伝子で構成されていました。元の脱複製テンプレートは、脱複製プロセス中に抗生物質サブクラスに関する情報を提供するために、抗生物質クラスごとの耐性遺伝子のサブセットを包含するように設計されました。今日、ARPは18の抗生物質クラスに対する抵抗性を与える>90遺伝子で構成されている。耐性遺伝子の広範なコレクションを使用して、二次脱複製テンプレートが開発され、最小抗生物質耐性プラットフォーム(MARP)として知られています。このテンプレートは、遺伝子の冗長性を排除し、単に脱複製された代謝産物が関連する一般的な抗生物質クラスに関する情報を提供するために作成されました。さらに、MARPテンプレートは、野生型と大腸菌BW25113(大腸菌BW25113ΔbamBΔtolC)の両方の肥一性/流出欠損株の両方を有し、ARPの元の化身と比較して、唯一の過透過性株を利用する。このユニークな側面は、脱複製中に追加の型を作成し、グラム陰性細菌の外膜を横断する化合物能力を示す。ここでは、ARP または MARP を使用して複製を解除する際に従うべき堅牢なプロトコルについて説明し、従うべき最も重要な手順を強調し、さまざまな可能な結果について説明します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

天然物抽出物からの新しい抗生物質の探索における主な課題の1つは、一般的な化合物の再発見です。この課題に対処するために、既知の化合物を同定するプロセスである脱複製が目的のサンプルに対して行われます。分析分離、質量分析などの脱複製の方法は、時間とリソースを大量に消費します。脱複製プロセスを改善するために、抗生物質耐性プラットフォーム(ARP)を開発しました。ARPは、エシェリヒア大腸菌に個別にクローニングされた約100の抗生物質耐性遺伝子のライブラリーです。この株のコレクションは、抗生物質の脱複製のための費用対効果の高い、顔の良い方法を含む多くのアプリケーションを持っています。このプロセスは、固体媒体を含む長方形ペトリ皿の表面に抗生物質産生微生物を発酵させ、それによって培地を介した二次代謝産物の分泌および拡散を可能にする。6日間の発酵期間の後、微生物バイオマスを除去し、薄い寒天オーバーレイをペトリ皿に加えて滑らかな表面を作成し、大腸菌指標株の成長を可能にします。ARP株の私たちのコレクションは、抗生物質含有ペトリ皿の表面に固定されます。プレートは、オーバーレイの表面に大腸菌の成長を可能にするために、次に一晩インキュベートされます。特定の抗生物質(またはクラス)に対する耐性を含む株のみがこの表面上で成長し、生成された化合物の迅速な同定を可能にする。この方法は、既知の抗生物質の生産者の同定と、新しい化合物を産生するものを同定する手段として正常に使用されている。

以下の結果は、ARPおよび/またはMARPを使用して抗生物質産生株のコレクションが非複製された場合に得られた。
ARP/MARP 脱複製ワークフローの図を図 1に示し、ライブラリ プレート マップを補足図 1および補足図 2 に示します。図2は、環境抽出物WAC 8921がクロラムフェニコール生産者として同定される?...

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Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

抗生物質の脱複製に対する同種抗生物質耐性エシェリヒア大腸菌のライブラリーを利用するプラットフォームについて述べる。細菌または真菌によって産生される抗生物質の同一性は、それぞれの耐性遺伝子を発現する大腸菌の増殖によって推定することができる。このプラットホームは経済的に有効で、時間効率が良い。

抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

当社のプロトコルは、特殊な機器を使用せずに、既知の抗生物質の費用対効果とタイムリーな非レプリケーションの両方を可能にするため、重要です。この手法の主な利点は、テンプレートのカスタマイズです。これは、個人が広いまたは狭い基質特異性の所望のレベルに基づいて、彼らのライブラリテンプレートに含めたい抵抗遺伝子を調整できることを意味します。例えば、β-ラクタムは、β-ラクタムとその様々なサブクラスの高度に特異的な逆複製を可能にするために、大腸菌テンプレートを発現する。敗血症技術を使用して、ピペット500マイクロリットルのカチオンは、無菌貯蔵所から滅菌の各ウェルにMHBを調整し、96深いウェルプレートを調整した。準備されたARPまたはMARP歪みプレートで、ARPまたはMARPマップに従って96深いウェルプレートを接種するためにアプリケータスティックを使用してください。深いウェルプレートの表面に通気性の密閉膜を置き、摂氏37度、250 RPMで一晩インキュベートします。汚染された井戸がないことを確認します。マルチチャンネルピペットを使用して、深いウェルプレートの各ウェルから滅菌96ウェルラウンドボトムプレートに100マイクロリットルを移します。各ウェルに無菌50%グリセロールの100マイクロリットルを加え、上下に軽くピペットで混ぜます。少なくとも5つの図書館の版を準備する。滅菌アルミニウムシールでプレートを覆い、各ウェルが個別に密封されていることを確認します。プレートの蓋をアルミニウムシールの上に置き、マイナス80度で保管します。木製のアプリケータースティックを使用して、ストレプトマイセスコロニーの表面から胞子をそっと削り取り、1つの無菌ガラスビーズと3ミリリットルのストレプトマイス抗生物質培地を含む試験管に移します。試験管をキャップでゆるく閉じて、エアーレーションを可能にします。同じ木製アプリケータースティックを使用して、ベネットの寒天を含むペトリ皿に不妊手術をストリーク。250 RPMで6日間、滅菌対照プレートを摂氏30度で6日間、摂氏30度で種子培養を含むチューブをインキュベートします。次に、レベルサーフェスで、レプリケーション解除プレートを準備します。暖かいベネットの寒天の23ミリリットルを血清ピペットに吸い込み、長方形のペトリ皿の表面を均等に20ミリリットル分配し、残りの培地をピペットに残して気泡の形成を防ぎます。蓋をしてプレートを覆います。プレートの全領域にメディアが覆われ、寒天が完全に設定されるまで邪魔しないようにプレートをそっと回転させます。次に、シートがデレプリケーションプレートの表面に合うように、長方形のペトリ皿蓋をトレーシングテンプレートとして使用してニトロセルロース膜シートを調製します。シートを切り、無菌ポーチにオートクレーブします。さて、6日間のインキュベーションの後に汚染物質が存在しないように、滅菌制御プレートを確認してください。汚染のない場合は、長方形のペトリ皿とピペット200マイクロリットルの種子培養液の蓋を、長方形の皿のベネットの寒天の表面に取り除きます。滅菌綿棒を使用して、プレート全体の表面に均等に培養を広げます。ペトリ皿の表面上の培養物の上に準備されたニトロセルロース膜を配置するには、膜の下端をペトリ皿の下端に合わせ、膜を下端からプレートの上端にゆっくりと塗布します。無菌綿棒を使用して、膜寒天界面の間に形成された可能性のある気泡を滑らかにし、膜が寒天にフラッシュされるようにします。膜は、二次代謝産物が下の媒体に排泄され得る間、生物がその表面上で胞子を散発することを可能にする。蓋を長方形のペトリ皿に戻し、密閉されたビニール袋に逆さまに置きます。摂氏30度で6日間インキュベートします。6 日後、インキュベーターからデレプリケーションプレートを取り外します。滅菌ピンセットを使用して、慎重にベネットの寒天の表面からニトロセルロース膜を除去します。追加するオーバーレイを汚染する可能性を減らすには、プレートの端の周りにわずかな胞毛の成長が存在することを確認してください。作業面がレベルであることを確認し、血清学的ピペットを使用して23ミリリットルの暖かいカチエイト調整されたMHB寒天を吸引します。空気泡の形成を防ぐために、配管に寒天の残りの部分を残して、20ミリリットルを均等にデズリングして、重ね合わせを作成します。蓋をプレートに置きます。プレートを、中程度の部分が覆い、寒天が完全に設定されるまで邪魔しないようにします。冷却して固まったら、デレプリケーションプレートを密閉されたビニール袋に戻し、一晩摂氏4度で逆さまに保管し、MHB寒天オーバーレイへの二次代謝物の拡散を可能にします。同じ日に、最初に100マイクロリットルのカチオン調整MHBを96ウェルプレートの各ウェルにピペット化して、新鮮なARPまたはMARPテンプレートを接種します。氷のストックARPまたはMARPライブラリプレートをマイナス80°Cの冷凍庫から取り出します。縮合が下側に形成され始める前に、アルミニウムシールを取り外します。滅菌96ウェルピン留めツールを使用して、冷凍ストックARPまたはMARPライブラリプレートから慎重にピン留めし、96ウェルプレートを含む新鮮なMHBを接種します。レプリケーション解除時の汚染を最小限に抑えるには、ライブラリプレートごとに2~3個のレプリケーション解除プレートの複製を解除するために必要なARPまたはMARPライブラリプレートを多数用意します。完了したら、冷凍テンプレートに新しい滅菌アルミニウムシールを入れ、マイナス80°C冷凍庫に戻します。緩く密封されたビニール袋の中に接種された96ウェルプレートを入れ、250 RPMで18時間揺れで摂氏37度でインキュベートします。インキュベーターから ARP または MARP テンプレートを削除し、プレートを ARP または MARP テンプレート マップと比較して汚染物質が存在しないようにします。4°Cからデレプリケーションプレートを取り外し、室温に平衡化することができます。結露がある場合は、蓋を開け、滅菌環境で乾燥させます。無菌ピン留めツールを使用して、ARPまたはMARPライブラリプレートから、複製解除プレートのMHB寒天オーバーレイの表面にピン留めします。寒天を突き刺さないでテンプレートの接種を3〜5分間乾燥させます。接種された非複製プレートを密閉されたビニール袋に逆さまに入れ、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、デレプリケーション プレートの成長を ARP または MARP マップに対応するウェルと比較して、レプリケーションデレプリケーション結果を分析します。この ARP または MARP レプリケーション解除ワークフローでは、正のレプリケーション解除結果が得られました。ここで株WAC 8921のために調製された抽出物はクロラムフェニコール生産者として同定された。ARPの成長の欠如は、未知の抗生物質またはARPまたはMARPライブラリプレートで考慮されなかったあまり一般的に見つかった抗生物質の存在を示す。MARPに特有の成長パターンは、野生型大腸菌BW25113とハイパー透過性およびeフラックス欠損変異体E.coli BW25113 bamB tolCの両方の利用のために形成された。この結果は、無傷の外膜を超えることができなかった抗菌活性を有する化合物の存在を示唆している。この大腸菌の成長パターンは、ピン留めツールの不適切な滅菌を示唆し、その結果、未知の大腸菌株がオーバーレイ全体に伝達される。そして、ARPまたはMARP冷凍ストックライブラリプレート汚染の例は、長方形のペトリ皿表面に成長した3つの異なる大腸菌コロニーをここで示しています。この結果は、レプリケーション解除中に寒天オーバーレイがピアスされたことを示します。MHBオーバーレイ関連の汚染は、デレプリケーションプロセス中にも発生する可能性があります。このプロトコルに従うときに覚えておくべきことは、汚染のために任意のステップで抑えきれないようにするために、適切な殺菌と無菌技術を使用することです。これには、MHBオーバーレイを流す際の胞子の広がりを最小限に抑えるために、ベネットの寒天板の表面にできるだけ近づくようにニトロセルロース膜を準備することが含まれます。さらに、最もクリーンな結果を生み出すためには、ライブラリプレートを接種し、脱複製する際に適切に滅菌されたピン留め装置を使用することも非常に重要です。既知の抗生物質の脱複製に加えて、この方法は、既存の抗生物質と組み合わせて使用できる補助剤を同定して活動を救うことができる。抗生物質のデレプリケーションは新しい技術ではありませんが、リソースを大量に消費し、時間がかかることで悪名高いです。ARPおよびMARPプラットフォームは、抗生物質のデレプリケーションが大規模な生産である必要はないが、最小限の装置を使用して2週間にわたって完了できる方法に光を当てるのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

形態変化を特徴付けるプロトコル<em&gt;クロストリジウム・ディフィシル</em&gt;抗生物質治療に対する反応

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

経口抗生物質による治療後マウス腸内細菌叢の量的なポリメラーゼの連鎖反応に基づく分析

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

淋菌ATP の使用率が集計を使用して商業試金およびライブ/デッド染色の抗生物質感受性の定量的検討

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...