Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Forskning på Wright-laboratoriet vedrørende ARP/MARP ble støttet av Ontario Research Fund og Canadian Institutes of Health Research Grant (FRN-148463). Vi ønsker å erkjenne sommer Chou for å bistå i ekspansjon og organisering av ARP biblioteket.

1. utarbeidelse av E. coli bibliotek glyserol Stocks (fra agar slants)
<ol><li>Stripe ARP/MARP E. coli stammer fra lysogeny BULJONG (LB) agar slants på Petri retter som inneholder lb agar og riktig valgbar markør (tabell 1).</li>
	<li>Forbered kulturer for hver av E. coli stammer av vaksinere 3 ml lb inneholder riktig valgbar markør med en enkelt koloni. Vokser over natten ved 37 ° c med lufting (250 RPM).</li>
	<li>Kombiner 800 μL av kultur og 200 μL av steril 80% glys...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

Protokollen beskrevet ovenfor kan brukes til både oppdagelsen av romanen antimikrobielle forbindelser og adjuvans som kan brukes i forbindelse med eksisterende antibiotika for å redde sin aktivitet. Plattformen utnytter det høye underlaget spesifisitet av motstands mekanismer og deres beslektet antibiotika, til dereplicate forbindelser innenfor råolje naturlige produkt ekstrakter. Selv om tiden som kreves for dereplication plater å være forberedt er lang (~ 2 uker), den dereplication prosessen i seg selv er fullfø...

Siden oppdagelsen av penicillin i 1928, naturlige produkter avledet fra miljømessige mikroorganismer har vist seg å være en rik kilde til antimikrobielle forbindelser1. Omtrent 80% av naturlig produkt antibiotika er avledet fra bakterier av slekten Streptomyces og andre aktinomyceter, mens de resterende 20% er produsert av fungal arter1. Noen av de vanligste antibiotika stillaser som brukes i klinikken som β-lactams, tetracykliner, rifamycins og aminoglykosider, ble opprinnelig isolert fra mikrober2. Men på grunn av fremveksten av multidrug resistente (MDR) bakterier, vår nåværende panel av antibiotika har blitt mindre effektive i behandling3,4. Disse inkluderer "ESKAPE" patogener (dvs. Vancomycin enterokokker og β-Laktam-resistente Staphylococcus aureus, klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, og Enterobacter Sp.), som er et delsett av bakterier anses å være assosiert med den høyeste risikoen ved en rekke store offentlige helsemyndigheter som verdenshelseorganisasjon3,4,5. Fremveksten og global spredning av disse MDR patogener resulterer i en konstant behov for romanen antibiotika3,4,5. Dessverre har de siste to ti årene vist at oppdagelsen av romanen antibiotika fra mikrobielle kilder er stadig vanskeligere6. Dagens tilnærminger til narkotika funnet inkluderer høy gjennomstrømming screening av bioaktive forbindelser, inkludert naturlig produkt ekstrakt biblioteker, slik at for tusenvis av ekstrakter som skal testes på et gitt tidspunkt2. Men når antimikrobielle aktivitet oppdages, er neste trinn å analysere innholdet i råolje ekstrakt å identifisere den aktive komponenten og eliminere de som inneholder kjente eller overflødige forbindelser7,8. Denne prosessen, referert til som dereplication, er avgjørende for å forebygge og/eller redusere tiden brukt på re-oppdagelsen av kjente antibiotika7,9. Selv om det er et nødvendig skritt i naturprodukt oppdagelse, er dereplication notorisk arbeidskrevende og ressurskrevende10.
Helt siden Beutler et al. første innførte begrepet "dereplication", omfattende innsats har blitt gjort for å utvikle innovative strategier for rask identifisering av kjente antibiotika11,12. I dag er de vanligste verktøyene som brukes for dereplication inkluderer analytiske kromatografiske systemer som høy ytelse flytende kromatografi, masse massespektrometri, og kjernefysiske magnetiske resonans-baserte deteksjon metoder11,13. Dessverre krever hver av disse metodene bruk av dyrt analytisk utstyr og sofistikert data tolkning.
I et forsøk på å utvikle en dereplication metode som raskt kan utføres uten spesialisert utstyr, etablerte vi antibiotikaresistens plattformen (ARP)10. ARP kan brukes til oppdagelsen av antibiotika adjuvans, profilering av nye antibiotika forbindelser mot kjente motstands mekanismer, og dereplication av kjente antibiotika i ekstrakter avledet fra actinobacteria og andre mikrober. Her fokuserer vi på anvendelsen i antibiotika dereplication. ARP utnytter et bibliotek med isogenic Escherichia coli stammer uttrykke individuelle motstand gener som er effektive mot de vanligste re-oppdaget antibiotika14,15. Når E. coli biblioteket dyrkes i nærvær av en sekundær metabolitten-produserende organisme, identiteten til det sammensatte kan utledes av veksten av E. coli stammer som uttrykker sin tilknyttede motstanden genet10. Når ARP ble først rapportert, biblioteket besto av > 40 gener overdragelse motstand mot 16 antibiotika klasser. Den opprinnelige dereplication malen ble utformet for å omfatte en undergruppe av motstands gener per antibiotika klasse for å gi informasjon om antibiotika underklasse under dereplication prosessen. I dag er ARP består av > 90 gener som tildeler motstand til 18 antibiotika klasser. Ved hjelp av vår omfattende samling av resistens gener, en sekundær dereplication mal har blitt utviklet og er kjent som minimal antibiotikaresistens plattform (MARP). Denne malen ble opprettet for å eliminere gen redundans og å bare gi informasjon om den generelle antibiotika klassen at en dereplicated metabolitten er relatert til. I tillegg MARP malen besitter både wildtype og en hyperpermeable/utstrømming mangelfull stamme av E. coli BW25113 (E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC), sammenlignet med den opprinnelige inkarnasjonen av ARP, som bare utnytter hyperpermeable belastningen. Dette unike aspektet skaper ekstra fenotyper under dereplication, indikerer en forbindelser evne til å krysse den ytre membran av gram-negative bakterier. Her beskriver vi en robust protokoll som skal følges ved dereplicating med enten ARP og/eller MARP, fremhever de mest kritiske trinnene som skal følges, og diskuterer de ulike mulige utfall.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

En av de viktigste utfordringene i jakten på nye antibiotika fra naturlige produkt ekstrakter er re-oppdagelsen av felles forbindelser. For å møte denne utfordringen, dereplication, som er prosessen med å identifisere kjente forbindelser, er utført på prøver av interesse. Metoder for dereplication som analytisk separasjon etterfulgt av masse massespektrometri er tidkrevende og ressurskrevende. For å forbedre dereplication prosessen, har vi utviklet antibiotikaresistens plattformen (ARP). ARP er et bibliotek på ca 100 antibiotikaresistens gener som er individuelt klonet inn Escherichia coli. Denne belastningen samlingen har mange programmer, inkludert en kostnadseffektiv og facile metode for antibiotika dereplication. Prosessen innebærer gjæring av antibiotika-produserende mikrober på overflaten av rektangulære Petri retter som inneholder solid medium, og dermed gir mulighet for utskillelsen og diffusjon av sekundære metabolitter gjennom mediet. Etter en 6 dagers gjæring periode, er den mikrobielle biomasse fjernet, og en tynn agar-overlegg er lagt til Petri parabolen å skape en glatt overflate og aktivere veksten av E. coli indikator stammer. Vår samling av ARP stammer deretter festet på overflaten av antibiotika-inneholdende Petri parabolen. Platen er neste inkubert over natten for å tillate E. coli vekst på overflaten av overlegget. Bare stammer som inneholder resistens mot en bestemt antibiotika (eller klasse) vokse på denne overflaten muliggjør rask identifisering av produserte sammensatte. Denne metoden har blitt brukt for identifisering av produsenter av kjente antibiotika og som et middel til å identifisere de produserende romanen forbindelser.

Følgende resultater ble oppnådd når en samling av antibiotika-produserende stammer av interesse ble dereplicated ved hjelp av ARP og/eller MARP.
Et diagram av ARP/MARP dereplication arbeidsflyt er avbildet i figur 1, og bibliotek plate kart er vist i supplerende figur 1 og supplerende figur 2. Figur 2 demonstrerer en positiv dereplication resultat der miljø ekstrakt WAC 8921 er identifisert som en...

Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Vi beskriver en plattform som utnytter et bibliotek av isogenic antibiotika resistente Escherichia coli for dereplication av antibiotika. Identiteten til en antibiotika produsert av bakterier eller sopp kan utledes av veksten av E. coli uttrykke sine respektive motstand genet. Denne plattformen er økonomisk effektiv og tidseffektiv.

Antibiotika Dereplication bruke antibiotikaresistens plattform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Vår protokoll er betydelig fordi den gir både kostnadseffektiv og be stundvis duplisering av kjente antibiotika uten bruk av spesialisert utstyr. Den største fordelen med denne teknikken er maltilpasning. Dette betyr at en person kan skreddersy hvilke resistensgener som de ønsker å inkludere i bibliotekmalen basert på ønsket nivå av bred eller smal substratspesifisitet.For eksempel uttrykker en beta-laktam E.coli-mal for å tillate svært spesifikk avregistrering av beta-laktam og deres ulike underklasser. Ved hjelp av en septikteknikk justerte pipette 500 mikroliter kation MHB fra et sterilt reservoar til hver brønn av en steril, 96 dyp brønnplate. Med de tilberedte ARP- eller MARP-stammeplatene, bruk en applikatorpinne til å inokulere den 96 dype brønnplaten i henhold til ARP- eller MARP-kartet.Legg en pustende tetningsmembran på overflaten av den dype brønnplaten og inkuber den over natten ved 37 grader Celsius, 250 RPM. Sørg for at det ikke er forurensede brønner. Bruk en flerkanals pipette til å overføre 100 mikroliter fra hver brønn av den dype brønnplaten til en steril 96-brønns rund bunnplate.Tilsett 100 mikroliter sterile 50% glyserol i hver brønn og bland ved å forsiktig pipettering opp og ned. Forbered minst fem bibliotekplater. Dekk platene med sterile aluminiumsforseglinger og sørg for at hver brønn er individuelt forseglet.Plasser platelokket på toppen av aluminiumsforseglingen og oppbevar det på minus 80 grader Celsius. Ved hjelp av en treapplikatorpinne skraper du forsiktig sporer fra overflaten av en streptomyces koloni og overfører den til et reagensrør som inneholder en steril glassperle og tre milliliter streptomyces antibiotikamedium. Lukk røret løst med en hette for å tillate aerasjon.Bruk samme treapplikatorpinne, strek en sterilitetskontroll på en petriskål som inneholder Bennetts agar. Inkuber røret som inneholder frøkultur ved 30 grader Celsius med vanning i seks dager ved 250 RPM og sterilitetskontrollplaten ved 30 grader Celsius i seks dager. Deretter, på et jevnt underlag, forberede dereplication plater.Aspirer 23 milliliter varm Bennetts agar inn i en serologisk pipette og dispenser 20 milliliter jevnt over overflaten av en rektangulær petriskål, slik at resten av mediet i pipetten for å forhindre luftbobledannelse. Dekk platen med et lokk. Roter platen forsiktig til mediet dekker alle deler av platen og ikke forstyrr den før agaren er helt innstilt.Deretter forbereder nitrocellulosemembranark ved hjelp av et rektangulært petriskållokk som en sporingsmal, slik at arkene passer til overflaten av avregistreringsplaten. Klipp arkene og autoklav dem i en steril pose. Kontroller nå sterilitetskontrollplaten for å sikre at ingen forurensninger er tilstede etter seks dager med inkubasjon.Hvis kontamineringsfritt, fjern lokket på den rektangulære petriskålen og pipetten 200 mikroliter av frøkulturen på overflaten av Bennetts agar i den rektangulære parabolen. Bruk en steril bomullspinne for å jevnt spre kulturen over overflaten av hele platen. For å plassere den tilberedte nitrocellulosemembranen over toppen av kulturen på overflaten av petriskålen, juster den nederste kanten av membranen til den nederste kanten av petriskålen og påfør sakte membranen fra den nederste kanten til den øverste kanten av platen.Bruk en steril bomullspinne for å glatte ut eventuelle luftbobler som kan ha dannet mellom membran agargrensesnittet, slik at membranen er flush til agaren. Membranen gjør det mulig for organismer å sporulate på overflaten mens sekundære metabolitter kan utskilles i mediet nedenfor. Sett lokket tilbake på den rektangulære petriskålen og legg det opp ned i en forseglet plastpose.Inkuber ved 30 grader Celsius i seks dager. Etter seks dager, fjern deplication platen fra inkubatoren. Bruk sterile pinsett, fjern forsiktig nitrocellulosemembranen fra overflaten av Bennetts agar.Pass på at det bare er mindre sporvekst rundt kantene på platen for å redusere sjansene for å forurense overlegget som skal legges til. Sørg for at arbeidsflaten er i nivå og bruk en serologisk pipette til å aspirere 23 milliliter varm kationjustert MHB agar. Lag et overlegg ved å dispensere 20 milliliter jevnt over overflaten av avregistreringsplaten, slik at resten av agaren i pipetten for å forhindre luftbobledannelse.Plasser lokket på platen. Roter platen forsiktig til mediet dekker alle områder og ikke forstyrr den før agaren er helt innstilt. Når den er avkjølt og størknet, returnerer du dupliseringsplaten til den forseglede plastposen og oppbevarer den opp ned ved fire grader Celsius over natten, noe som åpner for diffusjon av sekundære metabolitter i MHB agaroverlegget.Samme dag inokulerer du en ny ARP- eller MARP-mal ved først å pipettere 100 mikroliter kationjustert MHB i hver brønn av en 96-brønnsplate. Ta den frosne ARP eller MARP bibliotekplaten ut av minus 80 grader Celsius fryser. Fjern aluminiumsforseglingen før kondens begynner å danne seg på undersiden.Bruk sterile 96-brønns festeverktøy, fest forsiktig fra den frosne ARP- eller MARP-bibliotekplaten og inokulerer den friske MHB som inneholder 96-brønnsplater. For å minimere kontaminering under avregistrering, klargjør så mange ARP- eller MARP-bibliotekplater som trengs for å bare forfalle to til tre forfallsplater per bibliotekplate. Når du er ferdig, legg en ny steril aluminiumsforsegling på den frosne malen og returner den til minus 80 grader Celsius fryser.Plasser de vaksinerte 96-brønnplatene inne i en løst forseglet plastpose og inkuber ved 37 grader Celsius med risting ved 250 O/min i 18 timer. Fjern ARP- eller MARP-malen fra inkubatoren og kontroller at det ikke finnes forurensninger ved å sammenligne platen med ARP- eller MARP-malkartet. Fjern de dupliseringsplatene fra fire grader Celsius og la det likevekte til romtemperatur.Hvis det er kondens, åpne lokkene og la det tørke i et sterilt miljø. Bruk sterile festeverktøy til å feste fra ARP- eller MARP-bibliotekplaten på overflaten av MHB agaroverlegget på de dupliseringsplatene. Vær forsiktig så du ikke pierce agaren.La malen tørke i tre til fem minutter. Legg de vaksinerte dekripasjonsplatene opp ned i en forseglet plastpose og inkuber over natten ved 37 grader Celsius. Dagen etter analyserer du resultatene ved å sammenligne vekst på avregistreringsplaten med brønner som tilsvarer ARP- eller MARP-kartet.I denne arbeidsflyten for ARP eller MARP-forlikasjon ble det oppnådd et positivt avvik. Hvor ekstraktet forberedt for stammen WAC 8921 ble identifisert som en kloramfenikol produsent. Mangelen på ARP vekst indikerer tilstedeværelsen av enten et ukjent antibiotika eller et mindre vanlig antibiotika som ikke ble redegjøret for i ARP eller MARP bibliotekplate.Et vekstmønster som er unikt for MARP ble dannet på grunn av bruken av både vill type E.coli BW25113 og en hypergjennomtrengelig og e-fluks mangelfull mutant E.coli BW25113 bamB tolC. Dette resultatet antyder tilstedeværelsen av en forbindelse med antimikrobiell aktivitet som ikke var i stand til å overgå en intakt ytre membran. Dette E.coli vekstmønstre antyder feil sterilisering av festeverktøy, noe som resulterer i overføring av ukjente E.coli stammer over overlegget.Og et eksempel på ARP eller MARP frossen lager bibliotek plate forurensning er vist her med tre forskjellige E.coli kolonier dyrket på rektangulær Petri parabolen overflaten. Dette resultatet indikerer at agaroverlegget ble gjennomboret under avregistrering. MHB-overlegget til relatert forurensning kan også forekomme under avregistreringsprosessen, som viser et uregelmessig vekstmønster på overflaten av overlegget.Det viktigste å huske når du følger denne protokollen er å bruke riktig sterilisering og aseptiske teknikker for å sikre at du ikke holdes tilbake i noe trinn på grunn av forurensning. Dette inkluderer å forberede nitrocellulosemembranen slik at den passer til overflaten av Bennetts agarplate så nært som mulig for å minimere spredningen av sporer når mhb-overlegget helles. I tillegg er det også svært viktig å bruke riktig sterilisert festeutstyr når du vaksinerer bibliotekplatene og avfaller for å produsere det reneste resultatet.I tillegg til å dereplicating kjente antibiotika, kan denne metoden brukes til å identifisere adjuvanser som kan brukes sammen med eksisterende antibiotika for å redde sin aktivitet. Selv om antibiotika dereplisering ikke er en ny teknikk, er det beryktet for å være ressurskrevende og tidkrevende. ARP- og MARP-plattformen bidrar til å belyse hvordan antibiotikadeplisering ikke trenger å være en stor produksjon, men kan heller fullføres over en to ukers periode ved hjelp av minimalt utstyr.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Bruk av kunstig Oppspytt Medium til Test antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Forhold mer relevant for Cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Rapid Screening av HIV revers transkriptase og integrasehemmere

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Utarbeidelse av en blodkultur Pellet for Rapid Bakteriell Identifisering og antibiotika resistenstesting

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Undersøkelse av Host fenotyper i<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Etter antibiotikabehandling

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

En protokoll for å karakterisere de morfologiske endringene av<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Som svar på antibiotisk behandling

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Kvantitativ Polymerase kjedereaksjon-baserte analyser av Murine tarmen bakterieflora etter muntlig antibiotika behandling

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatisert atferdsdata analyse av store C. elegans bestander bruke et bredt felt-of-view sporing Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Kvantitativ undersøkelse av antibiotika mottakelighet av Neisseria gonorrhoeae aggregater bruker ATP-utnyttelse kommersielle analyser og Live/Dead flekker

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...