Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

A pesquisa no laboratório de Wright que pertence ao ARP/MARP foi apoiada pelo fundo da pesquisa de Ontário e pelos institutos canadenses da concessão da pesquisa da saúde (FRN-148463). Gostaríamos de reconhecer Sommer Chou para ajudar na expansão e organização da biblioteca ARP.

1. preparação de E. coli biblioteca de estoques de glicerol (a partir de agar Slants)
<ol><li>Raia as cepas de ARP/MARP e. coli de inclinações de agar de caldo de lisogenia (lb) em placas de Petri contendo Agar lb e o marcador selecionável apropriado (tabela 1).</li>
	<li>Prepare culturas para cada uma das cepas de E. coli inoculando 3 ml de lb contendo o marcador selecionável apropriado com uma única colônia. Cresça durante a noite em 37 ° c com aeração (250 rpm)...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

O protocolo descrito acima pode ser aplicado à descoberta de novos compostos antimicrobianos e adjuvantes que podem ser usados em conjunto com os antibióticos existentes para resgatar sua atividade. A plataforma aproveita a especificidade elevada da carcaça de mecanismos da resistência e de seus antibióticos cognato, aos compostos do dereplicate dentro dos extratos naturais crus do produto. Embora o tempo necessário para que as placas de desreferência sejam preparadas seja longa (~ 2 semanas), o processo de derepl...

Desde a descoberta da penicilina em 1928, os produtos naturais derivados de microrganismos ambientais provaram ser uma fonte rica de compostos antimicrobianos1. Aproximadamente 80% dos antibióticos do produto natural são derivados de bactérias do gênero Streptomyces e outros Actinomycetes, enquanto os 20% restantes são produzidos por espécies fúngicas1. Alguns dos andaimes antibióticos mais comuns utilizados na clínica, como os β-lactams, tetraciclinas, rifamicinas e aminoglicosídeos, foram originalmente isolados de micróbios2. No entanto, devido ao surgimento de bactérias multirresistentes (MDR), nosso atual painel de antibióticos tornou-se menos eficaz no tratamento3,4. Estes incluem os patógenos "ESKAPE" (i.e., enterococos resistentes à vancomicina e Staphylococcus aureusresistentes a β-lactâmicos, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanniie Enterobacter SP.), que são um subconjunto de bactérias consideradas associadas ao maior risco por um número de grandes autoridades de saúde pública, como a Organização Mundial da saúde3,4,5. O surgimento e a disseminação global desses patógenos do MDR resultam em uma necessidade constante de novos antibióticos3,4,5. Lamentavelmente, as duas últimas décadas demonstraram que a descoberta de novos antibióticos a partir de fontes microbianas é cada vez mais difícil6. As abordagens atuais para a descoberta de drogas incluem a triagem de alto débito de compostos bioativos, incluindo bibliotecas de extração de produtos naturais, permitindo que milhares de extratos sejam testados em um determinado momento2. No entanto, uma vez detectada a atividade antimicrobiana, o próximo passo é analisar o conteúdo do extrato bruto para identificar o componente ativo e eliminar aqueles que contenham compostos conhecidos ou redundantes7,8. Este processo, referido como dereplication, é vital para prevenir e/ou reduzir significativamente o tempo gasto na redescoberta de antibióticos conhecidos7,9. Embora um passo necessário na descoberta de medicamentos de produto natural, a desreferência é notoriamente trabalhosa e intensiva de recursos10.
Desde que Beutler et al. primeiro cunhou o termo "dereplicação", esforços extensivos têm sido feitos para desenvolver estratégias inovadoras para a rápida identificação de antibióticos conhecidos11,12. Hoje, as ferramentas mais comuns utilizadas para a dereplicação incluem sistemas cromatográficosanalíticos, comocromatografia líquida de alta eficiência, espectrometria de massas e métodos de detecção baseados em ressonância magnética nuclear11,13. Infelizmente, cada um desses métodos requer o uso de equipamentos analíticos caros e interpretação de dados sofisticados.
Na tentativa de desenvolver um método de desreferência que pode ser realizado rapidamente sem equipamento especializado, estabelecemos a plataforma de resistência a antibióticos (ARP)10. O ARP pode ser usado para a descoberta de adjuvantes antibióticos, o perfilamento de novos compostos antibióticos contra mecanismos de resistência conhecidos, e a desreferência de antibióticos conhecidos em extratos derivados de actinobactérias e outros micróbios. Aqui, nós nos concentramos em sua aplicação na dereplicação de antibióticos. O ARP utiliza uma biblioteca de cepas isogênicas de Escherichia coli expressando genes de resistência individuais que são eficazes contra os antibióticos mais comumente redescobertos14,15. Quando a biblioteca de e. coli é cultivada na presença de um organismo produtor de metabolito secundário, a identidade do composto pode ser deduzada pelo crescimento de cepas de e. coli que expressam seu gene de resistência associado10. Quando o ARP foi relatado pela primeira vez, a biblioteca consistiu em > 40 genes conferindo resistência a 16 classes de antibióticos. O modelo de dereplicação original foi projetado para abranger um subconjunto de genes de resistência por classe antibiótica para fornecer informações sobre subclasse antibiótica durante o processo de desreferência. Hoje, o ARP é compreendido de > 90 genes que conferem a resistência a 18 classes antibióticas. Usando nossa extensa coleção de genes de resistência, um modelo de dereplicação secundária foi desenvolvido e é conhecido como a plataforma mínima de resistência a antibióticos (MARP). Este modelo foi criado para eliminar a redundância genética e simplesmente fornecer informações sobre a classe geral de antibióticos que um metabolito dereplicated está relacionado. Adicionalmente, o modelo de MARP possui o tipo selvagem e uma tensão deficiente hyperpermeable/efflux de e. coli BW25113 (e. coli BW25113 δBAMBδTolc), comparado à encarnação original do ARP, que somente utiliza a estirpe hiperpermeável. Este aspecto único cria fenótipos adicionais durante a dereplicação, indicando uma capacidade de compostos para atravessar a membrana externa de bactérias Gram-negativas. Aqui, nós descrevemos um protocolo robusto a ser seguido quando dereplicating com o ARP e/ou o MARP, realça as etapas as mais críticas a ser seguidas, e discute os vários resultados possíveis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

Um dos principais desafios na busca de novos antibióticos a partir de extratos de produtos naturais é a re-descoberta de compostos comuns. Para abordar esse desafio, a dereplicação, que é o processo de identificação de compostos conhecidos, é realizada em amostras de interesse. Os métodos de desreferência, como a separação analítica seguida por espectrometria de massas, são demorados e com uso intensivo de recursos. Para melhorar o processo de dereplicação, desenvolvemos a plataforma de resistência a antibióticos (ARP). O ARP é uma biblioteca de aproximadamente 100 genes da resistência antibiótica que foram clonados individualmente em Escherichia coli. Esta coleção de estirpe tem muitas aplicações, incluindo um método rentável e facile para a dereplicação de antibióticos. O processo envolve a fermentação de micróbios de produção de antibióticos na superfície de placas de Petri retangulares contendo meio sólido, permitindo assim a secreção e difusão de metabólitos secundários através do meio. Após um período de fermentação de 6 dias, a biomassa microbiana é removida e uma fina sobreposição de agar é adicionada à placa de Petri para criar uma superfície lisa e permitir o crescimento das cepas do indicador e. coli . Nossa coleção de cepas de ARP é fixada na superfície do prato de Petri contendo antibióticos. A placa é incubada em seguida durante a noite para permitir o crescimento de E. coli na superfície da sobreposição. Apenas cepas que contenham resistência a um antibiótico específico (ou classe) crescem nesta superfície, possibilitando a rápida identificação do composto produzido. Este método tem sido usado com sucesso para a identificação de produtores de antibióticos conhecidos e como um meio para identificar aqueles que produzem novos compostos.

Os seguintes resultados foram obtidos quando uma coleta de cepas produtoras de antibióticos de interesse foi desreferência utilizando o ARP e/ou MARP.
Um diagrama do fluxo de trabalho de dereplicação ARP/MARP é representado na Figura 1, e os mapas da placa de biblioteca são mostrados na figura 1 suplementar e na Figura 2 suplementar. A Figura 2 demonstra um resultado de dereplicação positiva e...

Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Nós descrevemos uma plataforma que utilize uma biblioteca de Escherichia coli resistente antibiótico isogênicos para o desreplicação dos antibióticos. A identidade de um antibiótico produzido por bactérias ou fungos pode ser deduzada pelo crescimento de E. coli expressando seu respectivo gene de resistência. Esta plataforma é economicamente eficaz e tempo-eficiente.

Desreferência antibiótica usando a plataforma de resistência a antibióticos

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Nosso protocolo é significativo porque permite tanto a dereplicação econômica quanto oportuna de antibióticos conhecidos sem o uso de equipamentos especializados. A principal vantagem dessa técnica é a personalização do modelo. Isso significa que um indivíduo pode adaptar quais genes de resistência eles desejam incluir em seu modelo de biblioteca com base no nível desejado de especificidade de substrato amplo ou estreito.Por exemplo, um modelo beta-lactam está expressando e.coli modelo pode ser preparado a fim de permitir a dereplicação altamente específica de beta-lactams e suas várias subclasses. Utilizando uma técnica séptica, pipeta 500 microliters de alcagração ajustada MHB de um reservatório estéril em cada poço de uma placa de poço estéril, 96 profunda. Com as placas de tensão ARP ou MARP preparadas, use uma vara aplicadora para inocular a placa de poço profundo 96 de acordo com o mapa ARP ou MARP.Coloque uma membrana de vedação respirável na superfície da placa do poço profundo e incuba-a durante a noite a 37 graus Celsius, 250 RPM. Certifique-se de que não há poços contaminados. Usando uma pipeta multicanal, transfira 100 microliters de cada poço da placa de poço profundo para uma placa inferior redonda estéril de 96 poços.Adicione 100 microliters de 50% glicerol estéril em cada poço e misture suavemente tubos para cima e para baixo. Prepare pelo menos cinco placas da biblioteca. Cubra as placas com vedações de alumínio estéreis e certifique-se de que cada poço esteja selado individualmente.Coloque a tampa da placa em cima do selo de alumínio e armazene a menos 80 graus Celsius. Usando uma vara aplicadora de madeira, raspe suavemente os esporos da superfície de uma colônia de estreptomoses e transfira-o para um tubo de ensaio contendo uma conta de vidro estéril e três mililitros de meio antibiótico streptomyces. Feche o tubo de ensaio livremente com uma tampa para permitir a aeração.Usando a mesma vara de aplicador de madeira, traço um controle de esterilidade em uma placa de Petri contendo ágar bennett. Incubar o tubo contendo cultura de sementes a 30 graus Celsius com aeração por seis dias a 250 RPM e a placa de controle de esterilidade a 30 graus Celsius por seis dias. Em seguida, em uma superfície nivelada, prepare placas de desreplicação.Aspire 23 mililitros de ágar quente bennett em uma pipeta sorológica e dispense 20 mililitros uniformemente através da superfície de uma placa de Petri retangular, deixando o restante do meio na pipeta para evitar a formação de bolhas de ar. Cubra a placa com uma tampa. Gire suavemente a placa até que o meio cubra todas as áreas da placa e não a perturbe até que o ágar esteja completamente definido.Em seguida, prepare as folhas de membrana de nitrocelulose usando uma tampa retangular da placa de Petri como modelo de rastreamento para que as folhas se encaixem na superfície da placa de desreplicação. Corte os lençóis e autoclave-os em uma bolsa estéril. Agora, verifique a placa de controle de esterilidade para garantir que não haja contaminantes após seis dias de incubação.Se não for contaminação, remova a tampa da placa de Petri retangular e a pipeta 200 microliters da cultura de sementes na superfície do ágar bennett no prato retangular. Use um cotonete estéril para espalhar uniformemente a cultura pela superfície de toda a placa. Para posicionar a membrana de nitrocelulose preparada sobre o topo da cultura na superfície da placa de Petri, alinhe a borda inferior da membrana até a borda inferior da placa de Petri e aplique lentamente a membrana da borda inferior até a borda superior da placa.Use um cotonete estéril para suavizar quaisquer bolhas de ar que possam ter se formado entre a interface do ágar da membrana, garantindo que a membrana esteja alinhada ao ágar. A membrana permite que os organismos esporulem em sua superfície, enquanto metabólitos secundários podem ser excretados para o meio abaixo. Coloque a tampa de volta na placa de Petri retangular e coloque-a de cabeça para baixo em um saco plástico selado.Incubar a 30 graus Celsius por seis dias. Após seis dias, remova a placa de desreplicação da incubadora. Usando pinças estéreis, remova cuidadosamente a membrana de nitrocelulose da superfície do ágar bennett.Certifique-se de que há apenas um pequeno crescimento de esporos ao redor das bordas da placa para diminuir as chances de contaminar a sobreposição a ser adicionada. Certifique-se de que a superfície de trabalho esteja nivelada e use uma pipeta sorológica para aspirar 23 mililitros de ágar MHB ajustado de cáção quente. Crie uma sobreposição distribuindo 20 mililitros uniformemente através da superfície da placa de dereplicação, deixando o restante do ágar na pipeta para evitar a formação de bolhas de ar.Coloque a tampa na placa. Gire suavemente a placa até que o meio cubra todas as áreas e não a perturbe até que o ágar esteja completamente definido. Uma vez resfriado e solidificado, devolva a placa de dereplicação ao saco plástico selado e armazene-a de cabeça para baixo a quatro graus Celsius durante a noite, permitindo a difusão de metabólitos secundários na sobreposição de ágar MHB.No mesmo dia, inocular um modelo ARP ou MARP fresco, primeiro pipetting 100 microliters de cation ajustado MHB em cada poço de uma placa de 96 poços. Tire o estoque congelado ARP ou placa de biblioteca MARP do congelador menos 80 graus Celsius. Remova o selo de alumínio antes que a condensação comece a se formar na parte inferior.Usando ferramentas de fixação estéreis de 96 poços, fixar cuidadosamente a partir do estoque congelado placa de biblioteca ARP ou MARP e inocular o MHB fresco contendo placas de 96 poços. Para minimizar a contaminação durante a dereplicação, prepare quantas placas de biblioteca ARP ou MARP necessários para desreplicar apenas duas a três placas de dereplicação por placa de biblioteca. Uma vez concluído, coloque uma nova vedação de alumínio estéril no modelo congelado e devolva-o ao congelador de menos 80 graus Celsius.Coloque as placas de 96 poços inoculadas dentro de um saco plástico selado e incubar a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM por 18 horas. Remova o modelo ARP ou MARP da incubadora e certifique-se de que não há contaminantes, comparando a placa ao mapa do modelo ARP ou MARP. Remova as placas de derreplicação a partir de quatro graus Celsius e deixe equilibrar a temperatura ambiente.Se houver condensação, abra as tampas e deixe secar em um ambiente estéril. Utilizando ferramentas de fixação estéreis, pino da placa de biblioteca ARP ou MARP sobre a superfície da sobreposição de ágar MHB das placas de derreplicação. Tenha cuidado para não furar o ágar.Deixe o modelo inóculo secar por três a cinco minutos. Coloque as placas de dereplicação inoculadas de cabeça para baixo em um saco plástico selado e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, analise os resultados da derreplicação comparando o crescimento da placa de desreplicação com os poços que correspondem ao mapa ARP ou MARP.Neste fluxo de trabalho de dereplicação ARP ou MARP, obteve-se um resultado positivo de dereplicação. Em que o extrato preparado para a cepa WAC 8921 foi identificado como um produtor de clorofenicol. A falta de crescimento de ARP indica a presença de um antibiótico desconhecido ou de um antibiótico menos comumente encontrado que não foi contabilizado na placa de biblioteca ARP ou MARP.Um padrão de crescimento exclusivo do MARP foi formado devido à sua utilização tanto do tipo selvagem E.coli BW25113 quanto de um mutante hiper-permeável e deficiente e-flux E.coli BW25113 bamB tolC. Este resultado sugere a presença de um composto com atividade antimicrobiana que não foi capaz de superar uma membrana externa intacta. Estes padrões de crescimento de E.coli sugerem a esterilização inadequada de ferramentas de fixação, resultando na transferência de cepas E.coli desconhecidas através da sobreposição.E um exemplo de contaminação da placa de biblioteca congelada ARP ou MARP é mostrado aqui com três colônias distintas de E.coli cultivadas na superfície retangular da placa de Petri. Este resultado indica que a sobreposição de ágar foi perfurada durante a dereplicação. A contaminação relacionada à sobreposição do MHB também pode ocorrer durante o processo de derreplicação, mostrando um padrão de crescimento irregular na superfície da sobreposição.A coisa mais importante a ser lembrada ao seguir este protocolo é usar técnicas adequadas de esterilização e assépticas, a fim de garantir que você não seja retido em nenhuma etapa devido à contaminação. Isso inclui o preparo da membrana de nitrocelulose para que se encaixe na superfície da placa de ágar do Bennett o mais próximo possível, a fim de minimizar a propagação de esporos ao derramar a sobreposição de MHB. Além disso, também é extremamente importante usar equipamentos de fixação devidamente esterilizados ao vacinar as placas da biblioteca e desreplicar para produzir o resultado mais limpo.Além de desreplicar antibióticos conhecidos, este método pode ser aplicado à identificação de adjuvantes que podem ser usados em conjunto com antibióticos existentes para resgatar sua atividade. Embora a dereplicação de antibióticos não seja uma técnica nova, é notória por ser intensiva em recursos e demorada. A plataforma ARP e MARP ajudam a esclarecer como a dereplicação de antibióticos não precisa ser uma grande produção, mas pode ser concluída durante um período de duas semanas usando equipamentos mínimos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Imunologia e Infecção

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Preparação de uma Cultura Pellet sangue para rápida identificação bacteriana e Antibiótico Teste à Susceptibilidade

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Exame de fenótipos de acolhimento em<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Após o tratamento antibiótico

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Protocolo para Caracterizar as Alterações Morfológicas<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Em resposta ao tratamento antibiótico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Análise comportamental de grande c. elegans populações usando um amplo campo de visão de rastreamento plataforma automatizada

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Exame quantitativos de susceptibilidade antibiótica de Neisseria gonorrhoeae agregados usando ATP-utilização comercial ensaios e coloração Live/mortos

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...