Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Исследования в лаборатории Райта, относящиеся к ARP/MARP, были поддержаны Исследовательским фондом Онтарио и канадскими институтами исследований в области здравоохранения (FRN-148463). Мы хотели бы поблагодарить Соммера Чоу за содействие в расширении и организации библиотеки ARP.

1. Подготовка E. coli Библиотека Глицерол запасов (от Агар Сланц)
<ol><li>Полоса ARP / MARP E. coli штаммов из лисогенного бульона (LB) агар наклоняется на Петри блюда, содержащие LB агар и соответствующий выбираемый маркер (Таблица 1).</li>
	<li>Подготовка культур для каждого из штаммов ?...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

Описанный выше протокол может применяться как к открытию новых противомикробных соединений, так и к адъювантам, которые могут быть использованы в сочетании с существующими антибиотиками для спасения их деятельности. Платформа использует высокую специфичность субстрата механизмов р?...

С момента открытия пенициллина в 1928 году натуральные продукты, полученные из экологических микроорганизмов, оказались богатым источником противомикробных соединений1. Приблизительно 80% антибиотиков натурального продукта получены из бактерий рода Streptomyces и других актиномицетов, в то время как остальные 20% производится грибковых видов1. Некоторые из наиболее распространенных антибиотиков леса, используемые в клинике, такие как к-лактамы, тетрациклины, рифамицины, и аминогликозиды, были первоначально изолированы от микробов2. Однако, в связи с ростом бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), наша текущая панель антибиотиков стала менее эффективной в лечении3,4. К ним относятся патогенные микроорганизмы "ESKAPE" (т.е. ванкомицин-устойчивые энтерококки и лактам-резистентный золотистый стафилококк, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterobacter sp.), которые являются подмножеством бактерий, которые считаются связанными с самым высоким риском ряда крупных органов общественного здравоохранения, таких как Всемирная организация здравоохранения3,4,5. Появление и глобальное распространение этих патогенов МЛУ приводит к постоянной потребности в новых антибиотиках3,4,5. К сожалению, последние два десятилетия показали, что открытие новых антибиотиков из микробных источников становится все труднее6. Текущие подходы к открытию наркотиков включают высокопроизводительный скрининг биологически активных соединений, включая библиотеки экстракта природного продукта, что позволяет проверить тысячи экстрактов в данный момент2. Однако, как только антимикробная активность обнаружена, следующим шагом является анализ содержимого сырого экстракта для выявления активного компонента и устранения тех, которые содержат известные или избыточные соединения7,8. Этот процесс, называемый дерепликцией, имеет жизненно важное значение для предотвращения и / или значительно сократить время, затрачиваемые на повторное открытие известных антибиотиков7,9. Хотя необходимый шаг в открытии натуральных продуктов наркотиков, dereplication, как известно, трудоемким и ресурсоемким10.
С тех пор как Beutler et al. впервые придумалтермин "дерепликация", были предприняты активные усилия по разработке инновационных стратегий для быстрого выявления известных антибиотиков11,12. Сегодня наиболее распространенными инструментами, используемыми для дерепликации, являются аналитические хроматографические системы, такие как высокопроизводительная жидкая хроматография, масс-спектрометрия и методы обнаружения ядерного магнитного резонанса11,13. К сожалению, каждый из этих методов требует использования дорогостоящего аналитического оборудования и сложной интерпретации данных.
В попытке разработать метод дерепликации, который может быть быстро выполнен без специализированного оборудования, мы создали платформу устойчивости к антибиотикам (ARP)10. ARP может быть использован для открытия антибиотиков адъювантов, профилирование новых соединений антибиотиков против известных механизмов устойчивости, и dereplication известных антибиотиков в экстрактах, полученных из актинобактерий и других микробов. Здесь мы сосредоточимся на его применении в антибиотико-дерепликации. ARP использует библиотеку изогенных штаммов Escherichia coli, выражающих индивидуальные гены резистентности, которые эффективны против наиболее часто открываемых антибиотиков14,15. Когда библиотека кишечной палочки выращивается в присутствии вторичного метаболита-производящего организма, идентичность соединения может быть выведена ростом штаммов кишечной палочки, которые выражают связанный с ним ген резистентности10. Когда ARP впервые было сообщено, библиотека состояла из генов, придающих устойчивость к 16 классам антибиотиков. Оригинальный шаблон дерепликации был разработан, чтобы охватить подмножество генов устойчивости в классе антибиотиков, чтобы предоставить информацию о подклассе антибиотиков в процессе дерепликации. Сегодня, ARP состоит из генов, которые дают устойчивость к 18 классам антибиотиков. Используя нашу обширную коллекцию генов резистентности, был разработан вторичный шаблон дерепликации, который известен как платформа минимальной устойчивости к антибиотикам (MARP). Этот шаблон был создан для устранения избыточности генов и просто предоставить информацию об общем классе антибиотиков, с которым связан дереплицированный метаболит. Кроме того, шаблон MARP обладает как диким типом, так и гиперпроницаемым/дефицитным штаммом E. coli BW25113 (E. coli BW25113 ,bamB использует гиперпроницаемый штамм. Этот уникальный аспект создает дополнительные фенотипы во время дерепликации, указывая на способность соединений пересекать внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий. Здесь мы описываем надежный протокол, которым следует следовать при дерепликации либо с ARP и/или MARP, очерчив наиболее важные шаги, которым следует следовать, и обсудим различные возможные результаты.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

Одной из основных проблем в поиске новых антибиотиков из экстрактов натуральных продуктов является повторное открытие общих соединений. Для решения этой проблемы, dereplication, который является процесс идентификации известных соединений, осуществляется на образцах, представляющих интерес. Методы дерепликации, такие как аналитическое разделение с последующей масс-спектрометрией, отнимают много времени и ресурсоемки. Для улучшения процесса дерепликации мы разработали платформу устойчивости к антибиотикам (ARP). ARP представляет собой библиотеку из примерно 100 генов устойчивости к антибиотикам, которые были индивидуально клонированы в кишечную палочку. Эта коллекция штаммов имеет много применений, в том числе экономически эффективный и поверхностный метод для антибиотиков dereplication. Этот процесс включает в себя брожение антибиотикопроизводящих микробов на поверхности прямоугольных блюд Петри, содержащих твердую среду, тем самым позволяя секрецию и диффузию вторичных метаболитов через среду. После 6-дневного периода брожения микробная биомасса удаляется, а в блюдо Петри добавляется тонкая агар-накладка, чтобы создать гладкую поверхность и обеспечить рост штаммов индикатора кишечной палочки. Наша коллекция штаммов ARP затем прикрепляется на поверхность антибиотикосодержащей чашки Петри. Пластина следующий инкубируется на ночь, чтобы обеспечить рост кишечной палочки на поверхности наложения. Только штаммы, содержащие устойчивость к конкретному антибиотику (или классу), растут на этой поверхности, что позволяет быстро идентифицировать произведенное соединение. Этот метод успешно используется для выявления производителей известных антибиотиков и в качестве средства для выявления лиц, производящих новые соединения.

Следующие результаты были получены, когда коллекция антибиотикообразующих штаммов, представляющих интерес, была дереплицирована с помощью ARP и/или MARP.
Диаграмма рабочего процесса dereplication ARP/MARP изображена на рисунке 1,а библиотечные карты пластины показан...

Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Мы описываем платформу, которая использует библиотеку изогенных устойчивых к антибиотикам Escherichia coli для дерепликации антибиотиков. Идентичность антибиотика, вырабатываемого бактериями или грибами, может быть выведена ростом кишечной палочки, выражающей свой ген резистентности. Эта платформа является экономически эффективной и действенной по времени.

Антибиотическая дерепликация с использованием платформы устойчивости к антибиотикам

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Наш протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет как экономически эффективным, так и своевременным дереплицией известных антибиотиков без использования специализированного оборудования. Основным преимуществом этой техники является настройка шаблонов. Это означает, что человек может адаптировать гены резистентности, которые они хотят включить в свой шаблон библиотеки, основываясь на желаемом уровне широкой или узкой субстратной специфичности.Например, бета-лактам выражает E.coli шаблон может быть подготовлен для того, чтобы для весьма специфической дерепликации бета-лактамов и их различных подклассов. Используя септик, пипетка 500 микролитров катионной регулируется MHB из стерильного резервуара в каждый колодец стерильной, 96 глубокой пластины хорошо. С подготовленными пластинами штамма ARP или MARP используйте аппликаторную палочку для прививки пластины 96 глубоких колодец в соответствии с картой ARP или MARP.Поместите дышащий уплотнительной мембраны на поверхности глубокой пластины хорошо и инкубировать его на ночь при 37 градусов по Цельсию, 250 об /мин. Убедитесь, что нет загрязненных скважин. Используя многоканальную пипетку, перенесите 100 микролитров из каждого колодец глубокой пластины хорошо в стерильную 96-хорошо круглую нижнюю пластину.Добавьте 100 микролитров стерильного 50%глицерола в каждую колодец и смешайте, аккуратно трубя вверх и вниз. Подготовь как минимум пять библиотечных тарелок. Обложка пластины с стерильными алюминиевыми уплотнениями и убедитесь, что каждый колодец индивидуально запечатаны.Поместите крышку пластины поверх алюминиевого уплотнения и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Используя деревянную палку аппликатора, аккуратно соскребать споры с поверхности стрептомицей колонии и перенести его в пробирку, содержащую один стерильный стеклянный шарик и три миллилитров стрептомицей антибиотика среды. Закрыть пробирку свободно с крышкой, чтобы аэрация.Используя ту же деревянную палку аппликатора, полоса контроля стерильности на чашке Петри, содержащей агар Беннетта. Инкубировать трубку, содержащую культуру семян при 30 градусах по Цельсию с аэрацией в течение шести дней при 250 об/мин и стерильную контрольную пластину при 30 градусах по Цельсию в течение шести дней. Затем, на ровень поверхности, подготовить dereplication пластин.Аспират 23 миллилитров теплого агара Беннетта в серологическую пипетку и равномерно распределить 20 миллилитров по всей поверхности прямоугольной чашки Петри, оставляя оставшуюся часть среды в пипетке, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Накройте тарелку крышкой. Аккуратно поверните пластину до тех пор, пока среда не накрывет все области пластины и не беспокоить его, пока агар не установит полностью.Затем подготовьте мембранные листы нитроцеллюлозы, используя прямоугольную крышку чашки Петри в качестве шаблона трассировки, чтобы листы соответствовали поверхности пластины дереплиции. Вырезать листы и автоклав их в стерильный мешок. Теперь проверьте стерильную контрольную пластину, чтобы убедиться, что после шести дней инкубации загрязняющих веществ не присутствует.При загрязнении, удалите крышку прямоугольной чашки Петри и пипетки 200 микролитров культуры семян на поверхность агара Беннетта в прямоугольной тарелке. Используйте стерильный ватный тампон, чтобы равномерно распределить культуру по всей пластине. Чтобы расположить подготовленную мембрану нитроцеллюлозы поверх культуры на поверхности чашки Петри, выровнять нижний край мембраны к нижнему краю чашки Петри и медленно применять мембрану от нижнего края до верхнего края пластины.Используйте стерильный ватный тампон, чтобы сгладить любые пузырьки воздуха, которые, возможно, сформировались между интерфейсом мембранного агара, гарантируя, что мембрана заподлицо с агаром. Мембрана позволяет организмам sporulate на своей поверхности в то время как вторичные метаболиты могут быть выведены в среде ниже. Положите крышку обратно на прямоугольную чашку Петри и поместите его вверх ногами в запечатанный полиэтиленовый пакет.Инкубировать при 30 градусах по Цельсию в течение шести дней. Через шесть дней снимите де теплицу с инкубатора. Используя стерильные пинцеты, тщательно удалите мембрану нитроцеллюлозы с поверхности агара Беннетта.Убедитесь, что есть только незначительный рост спор по краям пластины, чтобы уменьшить шансы загрязнения наложения, которые будут добавлены. Убедитесь, что рабочая поверхность является ровной и использовать серологическую пипетку, чтобы аспирировать 23 миллилитров теплой катионики скорректированы MHB агара. Создайте наложение, распределяя 20 миллилитров равномерно по всей поверхности пластины dereplication, оставляя оставшуюся часть агара в пипетки, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.Поместите крышку на тарелку. Аккуратно поверните пластину до тех пор, пока среда не покрывает все области и не беспокоить его, пока агар не установит полностью. После охлаждения и затвердевания, верните пластину dereplication в запечатанный полиэтиленовый пакет и храните его вверх ногами при четырех градусах Цельсия на ночь, что позволяет диффузии вторичных метаболитов в MHB агар наложения.В тот же день, привить свежий шаблон ARP или MARP, сначала пипетки 100 микролитров катион скорректированы MHB в каждой колодец 96-хорошо пластины. Возьмите замороженный запас ARP или MARP библиотеки пластины из минус 80 градусов по Цельсию морозильник. Удалите алюминиевый уплотнитель до того, как конденсат начнет формироваться на его нижней стороне.Используя стерильные 96-ну закрепления инструменты, тщательно контактный из замороженных запасов ARP или MARP библиотечной пластины и привить свежие MHB содержащие 96-хорошо пластин. Чтобы свести к минимуму загрязнение во время дерепликации, подготовьте как можно больше библиотечных пластин ARP или MARP, необходимых только для dereplicate от двух до трех пластин dereplication на библиотечную пластину. После завершения, положить новый стерильный алюминиевый уплотнение на замороженный шаблон и вернуть его в минус 80 градусов по Цельсию морозильник.Поместите привитые пластины 96-колодец внутри слабо запечатанного полиэтиленового пакета и инкубировать при 37 градусах по Цельсию с тряской при 250 об/мин в течение 18 часов. Удалите шаблон ARP или MARP из инкубатора и убедитесь, что загрязняющих веществ нет, сравнив пластину с картой шаблонов ARP или MARP. Удалите де теплицы от четырех градусов по Цельсию и дайте равноденствия до комнатной температуры.Если есть конденсат, откройте крышки и дайте высохнуть в стерильной среде. Используя стерильные инструменты закрепления, булавку из библиотечной пластины ARP или MARP на поверхности агара MHB наложения дееплицийных пластин. Будьте осторожны, чтобы не проколоть агар.Разрешить шаблон инокулума высохнуть в течение трех-пяти минут. Поместите привитые плиты дерепликации вверх ногами в запечатанный полиэтиленовый пакет и инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию. На следующий день проанализируйте результаты дерепликации, сравнив рост на плите дееплиции с скважинами, которые соответствуют карте ARP или MARP.В этом рабочем процессе ARP или MARP dereplication был достигнут положительный результат дерепликации. В этом случае экстракт, подготовленный для штамма WAC 8921, был идентифицирован как производитель хлорамфеникол. Отсутствие роста ARP указывает на наличие либо неизвестного антибиотика, либо менее часто встречающихся антибиотиков, которые не учитывались в библиотечной пластине ARP или MARP.Модель роста, уникальная для MARP, была сформирована из-за его использования как дикого типа E.coli BW25113, так и сверхпроницаемого и электронного потока дефицитного мутанта E.coli BW25113 bamB tolC. Этот результат свидетельствует о наличии соединения с антимикробной активностью, которое не смогло превзойти нетронутую внешнюю мембрану. Эта модель роста E.coli предполагает неправильную стерилизацию инструментов закрепления, что приводит к передаче неизвестных штаммов E.coli через наложение.И пример ARP или MARP замороженных фондовых библиотек пластин загрязнения показано здесь с тремя различными колониями E.coli, выращенных на прямоугольной поверхности чашки Петри. Этот результат указывает на то, что наложения агара были проколоты во время дерепликации. Загрязнение, связанное с наложением MHB, также может возникать в процессе дереплиции, показывая нерегулярную модель роста на поверхности наложения.Самое главное помнить, когда после этого протокола является использование надлежащей стерилизации и асептических методов для того, чтобы убедиться, что вы не задержаны в любом шаге из-за загрязнения. Это включает в себя подготовку нитроцеллюлозы мембраны так, что она соответствует поверхности агар пластины Беннетта как можно ближе, с тем чтобы свести к минимуму распространение спор при заливке MHB наложения. Кроме того, также чрезвычайно важно использовать правильно стерилизованное оборудование для закрепления при инокулировании библиотечных пластин и дерепликации для получения наиболее чистого результата.В дополнение к dereplicating известных антибиотиков, этот метод может быть применен к выявлению адъювантов, которые могут быть использованы в сочетании с существующими антибиотиками, чтобы спасти свою деятельность. Хотя антибиотик дерепликации не является новой техникой, он печально известен тем, что ресурсоемких и трудоемких. Платформа ARP и MARP помогает пролить свет на то, как дерепликация антибиотиков не должна быть большим производством, а может быть завершена в течение двух недель с использованием минимального оборудования.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Усиление и Количественная РНК ВИЧ-1 у ВИЧ-инфицированных с вирусной нагрузки ниже предела обнаружения стандартными клиническими Анализы

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Быстрого скрининга ВИЧ обратной транскриптазы и ингибиторы интегразы

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Подготовка крови культуры Пелле для быстрого идентификации бактерий и чувствительности к антибиотикам

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Исследование хост фенотипы в<em&gt; Gambusia аШшз</em&gt; После Лечение антибиотиками

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Протокол для характеристики морфологических изменений<em&gt; Сложный Clostridium</em&gt; В ответ на лечение антибиотиками

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Количественные полимеразной цепной реакции на основе анализ мышиных кишечной микробиоты после устные лечения антибиотиками

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Автоматизированная поведенческого анализа больших C. elegans населения с помощью широкого поля зрения отслеживания платформа

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Количественные экспертизы по чувствительности к антибиотикам Neisseria gonorrhoeae агрегатов с помощью АТФ использования коммерческих анализов и Live/мертвые пятнать

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...