Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
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La investigación en el laboratorio Wright relacionada con el ARP/MARP fue apoyada por el Fondo de Investigación de Ontario y la subvención de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (FRN-148463). Nos gustaría reconocer a Sommer Chou por ayudar en la expansión y organización de la biblioteca ARP.

1. Preparación de las existencias de glicerol de la biblioteca E. coli (a partir de inclinadores de agar)
<ol><li>Rayar las cepas ARP/MARP E. coli del caldo de lisabagenia (LB) inclina sobre platos de Petri que contienen agar LB y el marcador seleccionable apropiado (Tabla 1).</li>
	<li>Preparar cultivos para cada una de las cepas de E. coli inoculando 3 ml de LB que contengan el marcador seleccionable apropiado con una sola colonia. Crecer durante la noche a 37oC con aireac...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

El protocolo descrito anteriormente puede aplicarse tanto al descubrimiento de nuevos compuestos antimicrobianos como a los adyuvantes que pueden utilizarse junto con los antibióticos existentes para rescatar su actividad. La plataforma aprovecha la alta especificidad del sustrato de los mecanismos de resistencia y sus antibióticos cognados, para desreplicar compuestos dentro de extractos de productos naturales crudos. Aunque el tiempo necesario para que las placas de desreplicación se preparen es largo (2 semanas), e...

Desde el descubrimiento de la penicilina en 1928, los productos naturales derivados de microorganismos ambientales han demostrado ser una rica fuente de compuestos antimicrobianos1. Aproximadamente el 80% de los antibióticos de productos naturales se derivan de bacterias del género Streptomyces y otros actinomycetes, mientras que el 20% restante es producido por las especies de hongos1. Algunos de los andamios antibiótico más comunes utilizados en la clínica, tales como los lactams, las tetraciclinas, las rifamicinas y los aminoglucósidos, fueron originalmente aislados de los microbios2. Sin embargo, debido al aumento de las bacterias multirresistentes (MDR), nuestro panel actual de antibióticos se ha vuelto menos eficaz en el tratamiento3,4. Estos incluyen los patógenos "ESKAPE" (es decir, enterococos resistentes a la vancomicina y Staphylococcus aureusresistentes a la lactam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii,y Enterobacter sp.), que son un subconjunto de bacterias consideradas asociadas al mayor riesgo por una serie de importantes autoridades de salud pública como la Organización Mundial de la Salud3,4,5. La aparición y propagación global de estos patógenos MDR da lugar a una necesidad constante de nuevos antibióticos3,4,5. Lamentablemente, las últimas dos décadas han demostrado que el descubrimiento de nuevos antibióticos de fuentes microbianas es cada vez más difícil6. Los enfoques actuales para el descubrimiento de fármacos incluyen el cribado de alto rendimiento de compuestos bioactivos, incluidas las bibliotecas de extractos de productos naturales, lo que permite probar miles de extractos en un momento dado2. Sin embargo, una vez detectada la actividad antimicrobiana, el siguiente paso es analizar el contenido del extracto crudo para identificar el componente activo y eliminar aquellos que contienen compuestos conocidos o redundantes7,8. Este proceso, conocido como desreplicación, es vital para prevenir y/o reducir significativamente el tiempo dedicado al redescubrimiento de antibióticos conocidos7,9. Aunque es un paso necesario en el descubrimiento de fármacos de productos naturales, la dereplicación es notoriamente laboriosa y requiere muchos recursos10.
Desde que Beutler y otros acuñaron por primera vez el término "desreplicación", se han realizado amplios esfuerzos para desarrollar estrategias innovadoras para la rápida identificación de antibióticos conocidos11,12. Hoy en día, las herramientas más comunes utilizadas para la desreplicación incluyen sistemas cromatográficos analíticos como cromatografía líquida de alto rendimiento, espectrometría de masas y métodos de detección basados en resonancia magnética nuclear11,13. Desafortunadamente, cada uno de estos métodos requiere el uso de costosos equipos analíticos y una sofisticada interpretación de datos.
En un intento de desarrollar un método de desreplicación que se puede realizar rápidamente sin equipo especializado, establecimos la plataforma de resistencia a antibióticos (ARP)10. El ARP se puede utilizar para el descubrimiento de adyuvantes antibióticos, la elaboración de perfiles de nuevos compuestos antibióticos contra mecanismos de resistencia conocidos, y la dereplicación de antibióticos conocidos en extractos derivados de actinobacterias y otros microbios. Aquí, nos centramos en su aplicación en la dereplicación de antibióticos. El ARP utiliza una biblioteca de cepas isogénicas de Escherichia coli que expresan genes de resistencia individuales que son eficaces contra los antibióticos más comúnmente redescubiertos14,15. Cuando la biblioteca de E. coli se cultiva en presencia de un organismo secundario productor de metabolitos, la identidad del compuesto puede deducirse por el crecimiento de cepas de E. coli que expresan su gen de resistencia asociado10. Cuando se informó por primera vez de la ARP, la biblioteca consistió en >40 genes que confieren resistencia a 16 clases de antibióticos. La plantilla de desreplicación original fue diseñada para abarcar un subconjunto de genes de resistencia por clase de antibióticos para proporcionar información sobre la subclase de antibióticos durante el proceso de desreplicación. Hoy en día, la ARP se compone de >90 genes que confieren resistencia a 18 clases de antibióticos. Utilizando nuestra extensa colección de genes de resistencia, se ha desarrollado una plantilla de desreplicación secundaria que se conoce como la plataforma de resistencia mínima a los antibióticos (MARP). Esta plantilla fue creada para eliminar la redundancia genética y simplemente proporcionar información sobre la clase general de antibióticos con la que está relacionado un metabolito desreplicado. Además, la plantilla MARP posee tanto el tipo salvaje como una cepa deficiente hiperpermeable/eflujo de E. coli BW25113 (E. coli BW25113 -bamB-tolC),en comparación con la encarnación original de la ARP, que sólo utiliza la cepa hiperpermeable. Este aspecto único crea fenotipos adicionales durante la dereplicación, lo que indica una capacidad de compuestos para cruzar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Aquí, describimos un protocolo robusto a seguir al dereplicar con el ARP y/o MARP, resaltamos los pasos más críticos a seguir, y discutimos los diversos resultados posibles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

Uno de los principales desafíos en la búsqueda de nuevos antibióticos a partir de extractos de productos naturales es el redescubrimiento de compuestos comunes. Para hacer frente a este desafío, la desreplicación, que es el proceso de identificación de compuestos conocidos, se realiza en muestras de interés. Los métodos de desreplicación, como la separación analítica, seguido de la espectrometría de masas, consumen mucho tiempo y consumen muchos recursos. Para mejorar el proceso de desreplicación, hemos desarrollado la plataforma de resistencia a antibióticos (ARP). La ARP es una biblioteca de aproximadamente 100 genes de resistencia a antibióticos que han sido clonados individualmente en Escherichia coli. Esta colección de cepas tiene muchas aplicaciones, incluyendo un método rentable y fácil para la dereplicación de antibióticos. El proceso consiste en la fermentación de microbios productores de antibióticos en la superficie de platos rectangulares de Petri que contienen medio sólido, permitiendo así la secreción y difusión de metabolitos secundarios a través del medio. Después de un período de fermentación de 6 días, se elimina la biomasa microbiana, y se añade una fina superposición de agar a la placa Petri para crear una superficie lisa y permitir el crecimiento de las cepas indicadoras de E. coli. Nuestra colección de cepas ARP se fija a la superficie de la placa Petri que contiene antibióticos. La placa se incuba a continuación durante la noche para permitir el crecimiento de E. coli en la superficie de la superposición. Sólo crecen en esta superficie cepas que contienen resistencia a un antibiótico específico (o clase) permitiendo una rápida identificación del compuesto producido. Este método se ha utilizado con éxito para la identificación de los productores de antibióticos conocidos y como un medio para identificar aquellos que producen nuevos compuestos.

Los siguientes resultados se obtuvieron cuando se desató una colección de cepas de interés productoras de antibióticos utilizando el ARP y/o ELP.
En la Figura 1se muestra un diagrama del flujo de trabajo de desreplicación ARP/MARP y los mapas de placas de biblioteca se muestran en la Figura suplementaria 1 y en la Figura complementaria 2. La Figura 2 demuestra un resultado positivo de desreplicac...

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Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Describimos una plataforma que utiliza una biblioteca de Escherichia coli isogénica resistente a antibióticos para la dereplicación de antibióticos. La identidad de un antibiótico producido por bacterias u hongos puede deducirse por el crecimiento de E. coli expresando su respectivo gen de resistencia. Esta plataforma es económicamente eficaz y eficiente en el tiempo.

Desreplicación de antibióticos utilizando la plataforma de resistencia a antibióticos

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Nuestro protocolo es significativo porque permite tanto la desreplicación rentable y oportuna de antibióticos conocidos sin el uso de equipos especializados. La principal ventaja de esta técnica es la personalización de plantillas. Esto significa que un individuo puede adaptar los genes de resistencia que desean incluir en su plantilla de biblioteca en función de su nivel deseado de especificidad de sustrato amplio o estrecho.Por ejemplo, un beta-lactam está expresando plantilla de E.coli se puede preparar con el fin de permitir la desreplicación muy específica de beta-lactams y sus diversas subclases. Utilizando una técnica séptica, la pipeta 500 microlitros de catión ajustaron MHB de un depósito estéril en cada pozo de una placa estéril de pozo de 96 profundidades. Con las placas de deformación unitaria ARP o MARP preparadas, utilice un stick aplicador para inocular la placa de pozo de 96 profundidad de acuerdo con el mapa ARP o MARP.Coloque una membrana de sellado transpirable en la superficie de la placa del pozo profundo e i incubarlo durante la noche a 37 grados Celsius, 250 RPM. Asegúrese de que no haya pozos contaminados. Con una pipeta multicanal, transfiera 100 microlitros de cada pozo de la placa de pozo profundo a una placa inferior redonda estéril de 96 pozos.Agregue 100 microlitros de 50% de glicerol estéril en cada pozo y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Prepare al menos cinco placas de biblioteca. Cubra las placas con sellos de aluminio estériles y asegúrese de que cada pozo esté sellado individualmente.Coloque la tapa de la placa encima del sello de aluminio y guárdelo a menos 80 grados Centígrados. Usando un palo aplicador de madera, raspa suavemente las esporas de la superficie de una colonia de estreptomyces y transfiérala a un tubo de ensayo que contenga un cordón de vidrio estéril y tres mililitros de estreptomyces antibiotic medio. Cierre el tubo de ensayo libremente con una tapa para permitir la aireación.Usando el mismo palillo aplicador de madera, raya un control de esterilidad en un plato de Petri que contenga el agar de Bennett. Incubar el tubo que contiene el cultivo de semillas a 30 grados Celsius con aireación durante seis días a 250 RPM y la placa de control de esterilidad a 30 grados centígrados durante seis días. Luego, en una superficie nivelada, prepare placas de desreplicación.Aspirar 23 mililitros de agar caliente de Bennett en una pipeta serológica y dispensar 20 mililitros uniformemente a través de la superficie de una placa rectangular Petri, dejando el resto del medio en la pipeta para evitar la formación de burbujas de aire. Cubra el plato con una tapa. Gire suavemente la placa hasta que el medio cubra todas las áreas de la placa y no la moleste hasta que el agar se haya ajustado completamente.A continuación, prepare las láminas de membrana de nitrocelulosa utilizando una tapa rectangular de la placa Petri como plantilla de trazado para que las hojas se ajusten a la superficie de la placa de desreplicación. Cortar las sábanas y autoclave en una bolsa estéril. Ahora, revise la placa de control de esterilidad para asegurarse de que no haya contaminantes presentes después de seis días de incubación.Si no hay contaminación, retire la tapa de la placa rectangular Petri y pipetee 200 microlitros del cultivo de semillas sobre la superficie del agar del Bennett en el plato rectangular. Utilice un hisopo de algodón estéril para esparcir uniformemente el cultivo a través de la superficie de toda la placa. Para colocar la membrana de nitrocelulosa preparada sobre la parte superior del cultivo en la superficie de la placa Petri, alinee el borde inferior de la membrana con el borde inferior de la placa Petri y aplique lentamente la membrana desde el borde inferior hasta el borde superior de la placa.Utilice un hisopo de algodón estéril para suavizar cualquier burbuja de aire que pueda haberse formado entre la interfaz del agar de membrana, asegurando que la membrana esté al ras del agar. La membrana permite que los organismos esporular en su superficie, mientras que los metabolitos secundarios se pueden excretar en el medio inferior. Vuelva a colocar la tapa en el plato rectangular Petri y colóquela boca abajo en una bolsa de plástico sellada.Incubar a 30 grados centígrados durante seis días. Después de seis días, retire la placa de desreplicación de la incubadora. Usando pinzas estériles, retire cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa de la superficie del agar de Bennett.Asegúrese de que sólo haya un crecimiento menor de esporas alrededor de los bordes de la placa para disminuir las posibilidades de contaminar la superposición que se agregará. Asegúrese de que la superficie de trabajo esté nivelada y utilice una pipeta serológica para aspirar 23 mililitros de agar MHB ajustado por catión. Cree una superposición dispensando 20 mililitros uniformemente a través de la superficie de la placa de desreplicación, dejando el resto del agar en la pipeta para evitar la formación de burbujas de aire.Coloque la tapa en la placa. Gire suavemente la placa hasta que el medio cubra todas las áreas y no la moleste hasta que el agar se haya ajustado por completo. Una vez enfriada y solidificada, devuelva la placa de desreplicación a la bolsa de plástico sellada y guárdela boca abajo a cuatro grados centígrados durante la noche, lo que permite la difusión de metabolitos secundarios en la superposición de agar MHB.El mismo día, inocular una plantilla fresca de ARP o MARP pipeteando primero 100 microlitros de catión ajustados MHB en cada pozo de una placa de 96 pozos. Saque la placa de la biblioteca ARP o MARP congelada del congelador de menos 80 grados Celsius. Retire el sello de aluminio antes de que la condensación comience a formarse en su parte inferior.Usando herramientas de fijación estériles de 96 pozos, pine cuidadosamente de la placa de biblioteca ARP o MARP de stock congelado e inocular el MHB fresco que contiene placas de 96 pozos. Para minimizar la contaminación durante la desreplicación, prepare tantas placas de biblioteca ARP o MARP necesarias para desreplicar solo dos a tres placas de desreplicación por placa de biblioteca. Una vez completado, coloque un nuevo sello de aluminio estéril en la plantilla congelada y devuélvalo al congelador Celsius de menos 80 grados.Coloque las placas inoculadas de 96 pozos dentro de una bolsa de plástico sellada libremente e incubar a 37 grados centígrados con agitación a 250 RPM durante 18 horas. Quite la plantilla ARP o MARP de la incubadora y asegúrese de que no haya contaminantes presentes comparando la placa con el mapa de plantillas ARP o MARP. Retire las placas de desreplicación de cuatro grados Centígrados y deje que se equilibren a temperatura ambiente.Si hay condensación, abra las tapas y deje secar en un ambiente estéril. Usando herramientas de fijación estériles, pin de la placa de la biblioteca ARP o MARP en la superficie de la superposición de agar MHB de las placas de desreplicación. Tenga cuidado de no perforar el agar.Deje que el inóculo de la plantilla se seque durante tres a cinco minutos. Coloque las placas de desreplicación inoculadas boca abajo en una bolsa de plástico sellada e incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, analice los resultados de la desreplicación comparando el crecimiento en la placa de desreplicación con los pozos que corresponden al mapa ARP o MARP.En este flujo de trabajo de desreplicación ARP o MARP, se logró un resultado positivo de desreplicación. Donde el extracto preparado para la cepa WAC 8921 fue identificado como un productor de cloramphenicol. La falta de crecimiento de ARP indica la presencia de un antibiótico desconocido o un antibiótico menos comúnmente encontrado que no se consideró en la placa de la biblioteca ARP o MARP.Se formó un patrón de crecimiento único para el MARP debido a su utilización tanto del tipo salvaje E.coli BW25113 como de un mutante hiper-permeable y con deficiencia de flujo electrónico E.coli BW25113 bamB tolC. Este resultado sugiere la presencia de un compuesto con actividad antimicrobiana que no pudo superar una membrana externa intacta. Estos patrones de crecimiento de E. coli sugieren la esterilización inadecuada de herramientas de fijación, lo que resulta en la transferencia de cepas desconocidas de E.coli a través de la superposición.Y un ejemplo de la contaminación de placas de la biblioteca de stock congelado ARP o MARP se muestra aquí con tres colonias distintas de E.coli cultivadas en la superficie rectangular de la placa Petri. Este resultado indica que la superposición de agar se perforó durante la desreplicación. La contaminación relacionada con la superposición de MHB también puede ocurrir durante el proceso de desreplicación, mostrando un patrón de crecimiento irregular en la superficie de la superposición.Lo más importante a recordar al seguir este protocolo es utilizar técnicas asépticas y de esterilización adecuadas para asegurarse de que no se le retendrá en ningún paso debido a la contaminación. Esto incluye la preparación de la membrana de nitrocelulosa para que se ajuste a la superficie de la placa de agar del Bennett lo más cerca posible con el fin de minimizar la propagación de esporas al verter la superposición MHB. Además, también es extremadamente importante utilizar equipos de fijación esterilizados correctamente al inocular las placas de la biblioteca y desreplicar con el fin de producir el resultado más limpio.Además de desreplicar los antibióticos conocidos, este método se puede aplicar a la identificación de adyuvantes que se pueden utilizar junto con los antibióticos existentes para rescatar su actividad. Aunque la desreplicación de antibióticos no es una técnica nueva, es notoria por ser intensiva en recursos y consumir mucho tiempo. La plataforma ARP y MARP ayudan a arrojar luz sobre cómo la desreplicación de antibióticos no tiene que ser una producción grande, sino que puede completarse durante un período de dos semanas utilizando un equipo mínimo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Investigación

Inmunología e Infección

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Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

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Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

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Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Preparación de una Cultura de pellets de sangre para Rapid bacteriana Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antibióticos

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

El examen de los fenotipos de acogida en<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Tratamiento antibiótico Siguiendo

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Protocolo para Caracterizar los Cambios Morfológicos de<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En respuesta al tratamiento antibiótico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Cuantitativa de polimerasa análisis reacción-basado cadena de la Microbiota Intestinal murino después del tratamiento antibiótico Oral

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Análisis conductual de gran C. elegans las poblaciones utilizando un amplio campo de visión de seguimiento plataforma automatizada

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Examen cuantitativo de susceptibilidad antibiótica de Neisseria gonorrhoeae utilización del ATP utilizando agregados comerciales ensayos y manchas de vivos/muertos

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...