Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Forskning i Wright Lab som hänför sig till ARP/MARP stöddes av Ontarios forskningsfond och kanadensiska institut of Health Research Grant (FRN-148463). Vi skulle vilja erkänna Sommer Chou för att bistå i utbyggnaden och organisationen av ARP-biblioteket.

1. beredning av E. coli bibliotek glycerol lager (från agar slants)
<ol><li>Strimma ARP/MARP E. coli stammar från lysogeny buljong (lb) agar lutar på petriskålar som innehåller lb agar och lämplig valbar markör (tabell 1).</li>
	<li>Förbered kulturer för var och en av E. coli -stammar genom att vaccinera 3 ml lb som innehåller lämplig valbar markör med en enda koloni. Växa över natten vid 37 ° c med luftning (250 rpm).</li>
	<li>Kombinera 800 μL kultur och 200...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

Det protokoll som beskrivs ovan kan tillämpas på både upptäckten av nya antimikrobiella substanser och adjuvans som kan användas tillsammans med befintliga antibiotika för att rädda sin verksamhet. Plattformen utnyttjar den höga substrat specificiteten hos resistensmekanismer och deras besläktat antibiotika, för att dereplicate föreningar inom rå naturliga produkt extrakt. Även om den tid som krävs för dereplication plattor som skall förberedas är lång (~ 2 veckor), den dereplication processen i sig är...

Sedan upptäckten av penicillin i 1928, naturliga produkter som härrör från miljömikroorganismer har visat sig vara en rik källa av antimikrobiella föreningar1. Cirka 80% av naturliga produkt antibiotika härrör från bakterier av släktet Streptomyces och andra actinomycetes, medan resterande 20% produceras av svamparter1. Några av de vanligaste antibiotiska ställningar som används på kliniken som β-lactams, tetracykliner, Rifamycins och aminoglykosider, var ursprungligen isolerade från mikrober2. Men på grund av uppkomsten av Multidrug resistenta (Mdr) bakterier, vår nuvarande panel av antibiotika har blivit mindre effektiv i behandling3,4. Dessa inkluderar "ESKAPE"-patogener (dvs. vankomycinresistenta enterokocker och β-laktamresistenta Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanniioch Enterobacter SP.), som är en delmängd av bakterier som bedöms vara förknippade med den högsta risken av ett antal stora folkhälsomyndigheter som Världshälsoorganisationen3,4,5. Uppkomsten och den globala spridningen av dessa Mdr patogener resulterar i ett konstant behov av nya antibiotika3,4,5. Beklagligt nog har de senaste två decennierna visat att upptäckten av nya antibiotika från mikrobiella källor blir allt svårare6. Aktuella metoder för läkemedels upptäckt omfattar hög genomströmning screening av bioaktiva föreningar, inklusive naturliga produkter extrahera bibliotek, vilket gör att tusentals utdrag som ska testas vid en given tidpunkt2. Men när antimikrobiell aktivitet upptäcks, är nästa steg att analysera innehållet i rå extrakt för att identifiera den aktiva komponenten och eliminera de som innehåller kända eller överflödiga föreningar7,8. Denna process, kallad dereplication, är avgörande för att förhindra och/eller avsevärt minska den tid som ägnas åt återupptäckten av kända antibiotika7,9. Även om ett nödvändigt steg i naturliga produkt Drug discovery, dereplication är notoriskt mödosam och resurskrävande10.
Ända sedan Beutler et al. först myntade termen "dereplication", omfattande ansträngningar har gjorts för att utveckla innovativa strategier för snabb identifiering av kända antibiotika11,12. I dag omfattar de vanligaste verktygen för dereplication analytiska kromatografiska system såsom högpresterande vätskekromatografi, masspektrometri och nukleära magnetresonans-baserade detektionsmetoder11,13. Tyvärr, var och en av dessa metoder kräver användning av dyr analytisk utrustning och sofistikerad data tolkning.
I ett försök att utveckla en dereplication metod som snabbt kan utföras utan specialiserad utrustning, etablerade vi antibiotikaresistens plattform (ARP)10. ARP kan användas för upptäckten av antibiotika adjuvans, profilering av nya antibiotika föreningar mot kända resistensmekanismer, och dereplication av kända antibiotika i extrakt som härrör från Actinobacteria och andra mikrober. Här fokuserar vi på dess tillämpning i antibiotika dereplication. ARP använder ett bibliotek av isogena Escherichia coli -stammar som uttrycker individuella motstånds gener som är effektiva mot de vanligast återupptäckta antibiotika14,15. När e. coli biblioteket odlas i närvaro av en sekundär metabolitproducerande organism, identiteten hos föreningen kan härledas genom tillväxten av e. coli stammar som uttrycker dess associerade resistens gen10. När ARP rapporterades första gången bestod biblioteket av > 40 gener som ger resistens mot 16 antibiotika klasser. Den ursprungliga dereplication mallen utformades för att omfatta en delmängd av resistens gener per antibiotika klass för att ge information om antibiotika underklass under dereplication processen. Idag består ARP av > 90 gener som ger resistens mot 18 antibiotika klasser. Med hjälp av vår omfattande samling av resistensgener, en sekundär dereplication mall har utvecklats och är känd som den minimala antibiotikaresistens plattform (MARP). Denna mall skapades för att eliminera genredundans och att helt enkelt ge information om den allmänna antibiotika klass som en dereplicated metabolit är relaterat till. Dessutom, den MARP mallen besitter både vildtyp och en hyperpermeable/efflux bristfällig stam av e. coli BW25113 (e. coli BW25113 δbambδTolc), jämfört med den ursprungliga inkarnationen av ARP, som endast utnyttjar den hyperpermeabla stammen. Denna unika aspekt skapar ytterligare fenotyper under dereplication, indikerar en föreningar förmåga att korsa det yttre membranet av gramnegativa bakterier. Här beskriver vi ett robust protokoll som ska följas vid borttagande av antingen ARP och/eller MARP, belysa de mest kritiska steg som ska följas, och diskutera de olika möjliga resultaten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

En av de största utmaningarna i sökandet efter nya antibiotika från naturliga produkt extrakt är återupptäckten av gemensamma föreningar. För att lösa denna utmaning, dereplication, som är processen för att identifiera kända föreningar, utförs på prover av intresse. Metoder för dereplication såsom analytisk separation följt av masspektrometri är tidskrävande och resurskrävande. För att förbättra dereplication processen har vi utvecklat antibiotikaresistens plattform (ARP). ARP är ett bibliotek med cirka 100 antibiotikaresistens gener som har varit individuellt klonade till Escherichia coli. Denna stam samling har många tillämpningar, inklusive en kostnadseffektiv och facile metod för antibiotika dereplication. Processen innebär jäsning av antibiotika-producerande mikrober på ytan av rektangulära petriskålar som innehåller fast medium, vilket möjliggör utsöndring och diffusion av sekundära metaboliter genom mediet. Efter en 6 dagars fermenterings period, den mikrobiella biomassan avlägsnas, och en tunn agar-overlay läggs till petriskål för att skapa en slät yta och möjliggöra tillväxt av E. coli indikatorn stammar. Vår samling av ARP stammar fästs sedan på ytan av antibiotikum som innehåller petriskål. Plattan är nästa inkuberas över natten för att möjliggöra E. coli tillväxt på ytan av överlägget. Endast stammar som innehåller resistens mot ett specifikt antibiotikum (eller klass) växer på denna yta vilket möjliggör snabb identifiering av den producerade substansen. Denna metod har använts med framgång för att identifiera tillverkare av kända antibiotika och som ett sätt att fastställa vilka som producerar nya föreningar.

Följande resultat erhölls när en samling av antibiotika-producerande stammar av intresse dereplicated med hjälp av ARP och/eller MARP.
Ett diagram över arbetsflödet för ARP/MARP-dereplication avbildas i figur 1, och biblioteks plattans kartor visas i kompletterande figur 1 och kompletterande figur 2. Figur 2 visar ett positivt resultat av resultatet vari miljö extraktet wac 8921 identifieras s...

Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Vi beskriver en plattform som använder ett bibliotek av isogena antibiotikaresistenta Escherichia coli för dereplication av antibiotika. Identiteten hos ett antibiotikum som produceras av bakterier eller svampar kan härledas genom tillväxten av E. coli som uttrycker dess respektive motstånds gen. Denna plattform är ekonomiskt effektiv och tidseffektiv.

Antibiotikum Dereplication med hjälp av antibiotikaresistens plattform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Vårt protokoll är betydande eftersom det möjliggör både kostnadseffektiva och tid dereplication av kända antibiotika utan användning av specialiserad utrustning. Den största fördelen med denna teknik är mall anpassning. Detta innebär att en individ kan skräddarsy vilka resistensgener som de vill inkludera i sin biblioteksmall utifrån önskad nivå av bred eller smal substratss specificitet.Till exempel är en beta-laktam uttrycker E.coli mall kan förberedas för att möjliggöra den mycket specifika dereplication av beta-laktamer och deras olika underklasser. Med hjälp av en septisk teknik, pipettera 500 mikroliter av katjon justeras MHB från en steril reservoar i varje brunn av en steril, 96 djupa väl platta. Med de förberedda ARP- eller MARP-töjningsplattorna ska du använda en applikatorspinne för att inokulera 96 djupa brunnsplattan i enlighet med ARP- eller MARP-kartan.Placera ett ventilerande tätningsmembran på ytan av den djupa brunnsplattan och inkubera det över natten vid 37 grader Celsius, 250 RPM. Se till att det inte finns några kontaminerade brunnar. Med hjälp av en flerkanalspipett överför du 100 mikroliter från varje brunn av den djupa brunnsplattan till en steril 96-brunns rund bottenplatta.Tillsätt 100 mikroliter sterila 50%glycerol i varje brunn och blanda genom att försiktigt pipettera upp och ner. Förbered minst fem biblioteksplåtar. Täck plattorna med sterila aluminiumtätningar och se till att varje brunn är individuellt förseglad.Placera plåtlocket ovanpå aluminiumtätningen och förvara på minus 80 grader Celsius. Med hjälp av en trä applikator pinne, skrapa försiktigt sporer från ytan av en streptomyces koloni och överföra den till ett provrör som innehåller en steril glaspärla och tre milliliter streptomyces antibiotika medium. Stäng provröret löst med en mössa för att möjliggöra avering.Med samma trä applikator pinne, strimma en sterilitet kontroll på en Petri maträtt som innehåller Bennetts agar. Inkubera röret som innehåller frökultur vid 30 grader Celsius med avering i sex dagar vid 250 RPM och sterilitetsregleringsplattan vid 30 grader Celsius i sex dagar. Sedan, på en jämn yta, förbereda dereplicering plattor.Aspirera 23 milliliter av varma Bennetts agar i en serologisk pipett och fördela 20 milliliter jämnt över ytan av en rektangulär Petriskål, lämnar resten av mediet i pipetten för att förhindra luftbubbla bildas. Täck plattan med lock. Rotera plattan försiktigt tills mediet täcker alla områden av plattan och inte störa den förrän agar har ställt in helt.Därefter förbereda nitrocellulosa membran ark med hjälp av en rektangulär Petri skålen locket som en tracing mall så att arken passar ytan av dereplication plattan. Klipp arken och autoklavera dem i en steril påse. Nu, kontrollera sterilitet kontrollplattan för att säkerställa att inga föroreningar är närvarande efter sex dagars inkubation.Om förorening-fri, ta bort locket på den rektangulära Petri skålen och pipetten 200 mikroliter av utsädet kultur på ytan av Bennetts agar i rektangulära skålen. Använd en steril bomullspinne för att jämnt sprida kulturen över hela plattans yta. För att placera det förberedda nitrocellulosamembranet över toppen av kulturen på petriskålens yta, rikta in underkanten av membranet till petriskålens nederkant och applicera långsamt membranet från bottenkanten till plattans överkant.Använd en steril bomullspinne för att jämna ut eventuella luftbubblor som kan ha bildats mellan membranagargränssnittet, vilket säkerställer att membranet spolas till agaren. Membranet gör det möjligt för organismer att sporulera på dess yta medan sekundära metaboliter kan utsöndras i mediet nedan. Sätt tillbaka locket på den rektangulära petriskålen och lägg det upp och ner i en förseglad plastpåse.Inkubera vid 30 grader Celsius i sex dagar. Efter sex dagar, ta bort derepliceringsplattan från inkubatorn. Använd sterila pincett, försiktigt ta bort nitrocellulosa membranet från ytan av Bennetts agar.Se till att det bara finns mindre sportillväxt runt kanterna på plattan för att minska chanserna att förorena överlägget som ska läggas till. Se till att arbetsytan är jämn och använd en serologisk pipett för att aspirera 23 milliliter varm katjonjusterad MHB-agar. Skapa ett överlägg genom att fördela 20 milliliter jämnt över ytan av derepliceringsplattan, vilket lämnar resten av agar i pipetten för att förhindra luftbubblabildning.Placera locket på plattan. Rotera plattan försiktigt tills mediet täcker alla områden och stör den inte förrän agarn har ställt in helt. När kyls och stelnat, tillbaka dereplication plattan till den förseglade plastpåsen och förvara den upp och ner på fyra grader Celsius över natten, vilket möjliggör spridning av sekundära metaboliter i MHB agar overlay.Samma dag, vaccinera en färsk ARP eller MARP mall genom att först pipettering 100 mikroliter av katjon justeras MHB i varje brunn av en 96-brunnsplatta. Ta den frusna stocken ARP eller MARP biblioteksplatta ur minus 80 grader Celsius frys. Ta bort aluminiumtätningen innan kondens börjar bildas på dess undersida.Med hjälp av sterila 96-brunnspintverktyg, nåla försiktigt fast från det frysta buldet ARP- eller MARP-biblioteksplattan och inokulera den färska MHB som innehåller 96-brunnsplattor. För att minimera kontaminering under dereplicering, förbereda så många ARP eller MARP biblioteksplattor som behövs för att endast dereplicera två till tre derepliceringsplattor per biblioteksplatta. När du är klar, sätta en ny steril aluminium tätning på den frusna mallen och returnera den till minus 80 grader Celsius frys.Placera de inokulerade 96-brunnsplattorna inuti en löst förseglad plastpåse och inkubera i 37 grader Celsius med skakningar vid 250 RPM i 18 timmar. Ta bort ARP- eller MARP-mallen från inkubatorn och se till att inga föroreningar finns med genom att jämföra plattan med ARP- eller MARP-mallkartan. Ta bort derepliceringsplattorna från fyra grader Celsius och låt jämvikt till rumstemperatur.Om det finns kondens, öppna locken och låt torka i en steril miljö. Med hjälp av sterila pinnverktyg, stift från ARP eller MARP biblioteksplattan på ytan av MHB agar överlagring av dereplication plattorna. Var försiktig så att du inte sticker hål på agaren.Låt mallinokulat torka i tre till fem minuter. Placera de inokulerade avräkningsplattorna upp och ner i en förseglad plastpåse och inkubera över natten vid 37 grader Celsius. Följande dag, analysera dereplicering resultat genom att jämföra tillväxten på dereplicering plattan till brunnar som motsvarar ARP eller MARP kartan.I detta ARP eller MARP dereplication arbetsflödet uppnåddes en positiv dereplicering resultatet. Vari extraktet som förberetts för stammen WAC 8921 identifierades som en kloramfenikolproducent. Bristen på ARP tillväxt indikerar förekomsten av antingen en okänd antibiotika eller en mindre vanligt förekommande antibiotikum som inte redovisas i ARP eller MARP bibliotek plattan.En tillväxt mönster som är unika för MARP bildades på grund av dess utnyttjande av både vilda typ E.coli BW25113 och en hyper-permeable och e-flux bristfällig mutant E.coli BW25113 bamB tolC. Detta resultat tyder på förekomsten av en förening med antimikrobiell aktivitet som inte kunde överträffa en intakt yttre membran. Detta E.coli tillväxtmönster föreslår felaktig sterilisering av nålning verktyg, vilket resulterar i överföring av okända E.coli stammar över överlägg.Och ett exempel på ARP eller MARP frysta lager bibliotek plattan kontaminering visas här med tre distinkta E.coli kolonier odlas på rektangulära Petri skålen yta. Detta resultat indikerar att agaröverlagringen genomborrades vid dereplicering. MHB-överlagringsrelaterad kontaminering kan också ske under derepliceringsprocessen, vilket visar ett oregelbundet tillväxtmönster på överlagringens yta.Det viktigaste att komma ihåg när du följer detta protokoll är att använda korrekt sterilisering och aseptiska tekniker för att säkerställa att du inte hålls tillbaka i något steg på grund av kontaminering. Detta inkluderar att förbereda nitrocellulosamembranet så att det passar ytan på Bennetts agarplatta så nära som möjligt för att minimera spridningen av sporer när man häller MHB-överlägget. Dessutom är det också oerhört viktigt att använda korrekt steriliserad pinning utrustning vid inokulering av biblioteket plattor och avsnämning för att producera det renaste resultatet.Förutom att dereplicera kända antibiotika, kan denna metod tillämpas på att identifiera adjuvans som kan användas tillsammans med befintliga antibiotika för att rädda sin verksamhet. Även om antibiotika dereplication är inte en ny teknik, är det ökänd för att vara resurskrävande och tidskrävande. ARP och MARP-plattformen bidrar till att belysa hur antibiotikadereplicering inte behöver vara en stor produktion, utan snarare kan slutföras under en tvåveckorsperiod med hjälp av minimal utrustning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Förstärka och kvantifiera HIV-1 RNA i hiv-infekterade individer med virusnivåer under gränsen för upptäckt med vanliga kliniska analyser

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Användning av artificiell Sputum Medium för att testa antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I villkor som är mer relevanta för cystisk fibros Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Snabb Screening av hiv omvänt transkriptas och Grashämmare

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Framställning av en Blood Culture Pellet för Rapid Bacterial Identifiering och Antibiotikum resistensbestämning

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Undersökning av värd Fenotyper i<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Efter antibiotikabehandling

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Ett protokoll för att karaktärisera de morfologiska förändringarna av<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Som svar på antibiotisk behandling

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Kvantitativa Polymerase Chain Reaction-baserade analyser av murina tarmens bakterieflora efter Oral antibiotikabehandling

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatiserad beteendevetenskaplig analys av stor C. elegans populationer med ett brett fält-of-view spårning plattform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Kvantitativ undersökning av antibiotikakänsligheten hos Neisseria gonorrhoeae aggregat använder ATP-utnyttjande kommersiella analyser och Live/Dead färgning

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...