Name: antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Wright laboratuvarında ARP/MARP ile ilgili araştırmalar Ontario Araştırma Fonu ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri hibesi (FRN-148463) tarafından desteklendi. Sommer Chou'ya ARP kütüphanesinin genişletilmesi ve organizasyonuna yardımcı olduğu için teşekkür etmek istiyoruz.

1. E. coli Kütüphanesi Gliserol Stoklarının Hazırlanması (Agar Eğimlerinden)
<ol><li>ARP/MARP E. coli suşlarını lysogeny suyu (LB) agar eğimlerinden LB agar ve uygun seçilebilir marker içeren Petri kaplarına doğru çizgileyin(Tablo 1).</li>
	<li>Tek bir koloni ile uygun seçilebilir marker içeren LB 3 mL aşılayarak E. coli suşlarının her biri için kültürler hazırlayın. Havalandırma (250 rpm) ile 37 °C'de bir gecede büyüyün.</li>
	<li>800 μL kü...

<ol>
	<li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Antibacterial+Compounds+from+Actinomycetes.+actinobacteria.">Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria.</a> Basics and Biotechnological Applications. , (2016).</li><li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance.">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic:+Implications+for+Drug+Design.">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892 (2019).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+bugs,+no+drugs:+no+ESKAPE!+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus.">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52 (2019).</li><li>Gaud&#234;ncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication:+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process.">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li><li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies.">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li><li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products.">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li><li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Dereplication+Strategies+in+Natural+Products.">Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products.</a> Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).</li><li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery.">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li><li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+strategies+in+natural+product+research:+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept.">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li><li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+phorbol+bioactives:+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus.">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li><li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra.">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marcel+Faber+Roundtable:+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation,+constipation+or+lack+of+inspiration.">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li><li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+discovery+from+actinomycetes:+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall.">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li></ol>

Yukarıda açıklanan protokol, hem yeni antimikrobiyal bileşiklerin keşfine hem de aktivitelerini kurtarmak için mevcut antibiyotiklerle birlikte kullanılabilecek adjuvants'a uygulanabilir. Platform direnç mekanizmaları ve onların cognate antibiyotikyüksek substrat özgüllüğü yararlanır, ham doğal ürün özleri içinde bileşikleri dereplicate için. Dereplication plakaları için gerekli süre uzun olmasına rağmen (~2 hafta), derepyon işleminin kendisi tek bir gecelik kuluçka döneminden sonra tamaml...

1928 yılında penisilin keşfinden bu yana, çevresel mikroorganizmalardan elde edilen doğal ürünler antimikrobiyal bileşiklerin zengin bir kaynak olduğu kanıtlanmıştır1. Doğal ürün antibiyotiklerin yaklaşık % 80'i Streptomyces ve diğer aktinomycetes cinsinin bakterilerinden elde edilirken, geri kalan %20'si mantar türleri tarafından üretilmektedir1. Klinikte β-laktamlar, tetrasiklinler, rifamycins ve aminoglikozitler gibi en yaygın antibiyotik iskelelerinden bazıları başlangıçta mikroplardan izole edilmiştir2. Ancak, çoklu ilaca dirençli (MDR) bakterilerin yükselişi nedeniyle, antibiyotik mevcut panel tedavide daha az etkili hale gelmiştir3,4. Bunlar arasında "ESKAPE" patojenleri (yani vankomisindirençli enterokoklar ve β-laktam dirençli Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, ve Enterobacter sp.), dünya sağlık örgütü 3 gibi büyük halk sağlığı yetkilileri nin en yüksek risk ile ilişkili olduğu düşünülen bakterilerin bir alt kümesi olan3,4,5. Bu MDR patojenlerinin ortaya çıkması ve küresel yayılması yeniantibiyotikleriçin sürekli bir ihtiyaç3,4,5sonuçları . Ne yazık ki, son yirmi yılda mikrobiyal kaynaklardan yeni antibiyotiklerin keşfi giderek zor olduğunu göstermiştir6. İlaç keşfi için mevcut yaklaşımlar biyoaktif bileşiklerin yüksek iş gücü tarama dahil, doğal ürün özü kütüphaneler de dahil olmak üzere, belirli bir zamanda test edilecek özleri binlerce izin2. Ancak, bir kez antimikrobiyal aktivite tespit edilir, bir sonraki adım aktif bileşeni tanımlamak ve bilinen veya gereksiz bileşikler7içeren ortadan kaldırmak için ham özü içeriğini analiz etmektir7 ,8. Bu süreç, dereplication olarak anılacaktır, önlemek ve / veya önemli ölçüde bilinenantibiyotiklerinyeniden keşfi harcanan zamanı azaltmak için hayati önem taşımaktadır 7,9. Doğal ürün ilaç keşfi gerekli bir adım olmasına rağmen, dereplication kötü üne sahip zahmetli ve kaynak yoğun10.
Beutler ve ark. ilk dönem "dereplication" icat beri, geniş çabalar bilinen antibiyotiklerin hızlı belirlenmesi için yenilikçi stratejiler geliştirmek için yapılmıştır11,12. Bugün dereplik için kullanılan en yaygın araçlar yüksek performanslı sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans tabanlı algılama yöntemleri11,13gibi analitik kromatografik sistemleri içerir. Ne yazık ki, bu yöntemlerin her biri pahalı analitik ekipman ve sofistike veri yorumu kullanımını gerektirir.
Hızla özel ekipman olmadan yapılabilir bir dereplication yöntemi geliştirmek için bir girişim, biz antibiyotik direnç platformu (ARP)10kurdu. ARP antibiyotik adjuvants keşfi için kullanılabilir, bilinen direnç mekanizmalarına karşı yeni antibiyotik bileşiklerin profilleme, ve aktinobakteriler ve diğer mikroplardan elde edilen özlerde bilinen antibiyotiklerin derepifasyonu. Burada antibiyotik derepyonu uygulamasına odaklanıyoruz. ARP en sık yeniden keşfedilen antibiyotiklere karşı etkili bireysel direnç genleri ifade izojenik Escherichia coli suşları bir kütüphane kullanır14,15. E. coli kütüphanesi ikincil bir metabolit üreten organizmanın varlığında büyüdüğünde, bileşiğin kimliği, ilişkili dirençgeniniifade eden E. coli suşlarının büyümesi ile ortaya çıkarılabilir 10 . ARP ilk rapor edildiğinde, kütüphane 16 antibiyotik sınıfına direnç kazandıran >40 genden oluşuyordu. Orijinal dereplication şablonu derepifasyon işlemi sırasında antibiyotik alt sınıf ile ilgili bilgi sağlamak için antibiyotik sınıfı başına direnç genlerinin bir alt kümesini kapsayacak şekilde tasarlanmıştır. Bugün, ARP 18 antibiyotik sınıflarına direnç veren >90 genlerden oluşmaktadır. Direnç genleri bizim geniş koleksiyonu kullanarak, ikincil bir dereplik şablonu geliştirilmiştir ve minimal antibiyotik direnç platformu (MARP) olarak bilinir. Bu şablon, gen artıklığını ortadan kaldırmak ve sadece dereplicated metabolitin ilişkili olduğu genel antibiyotik sınıfı ile ilgili bilgi sağlamak için oluşturuldu. Ayrıca, MARP şablonu hem wildtype ve E. coli BW25113(E. coli BW25133ΔB ΔBΔtolC)bir hiperpermeable / efflux eksik suşu sahip, Sadece ARP orijinal cisimleşme ile karşılaştırıldığında, hiperpermeable suş kullanır. Bu benzersiz yönü dereplik sırasında ek fenotipler oluşturur, Gram-negatif bakterilerin dış membran çapraz bir bileşikler yeteneği gösteren. Burada, ARP ve/veya MARP ile çoğaltma yaparken izlenecek sağlam bir protokolü açıklar, izlenecek en kritik adımları vurgular ve çeşitli olası sonuçları tartışırız.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AGR003.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal CS Films for cold storage</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722642-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>AMP201.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Phytone Peptone (Soytone)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>CAR303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure Tube 1.8ml mix.colour</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.379.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLU501.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tube, 16x100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, Solid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>GLY001.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant sealing sterilization pouch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>KAN201.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Lennox</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LBL405.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>HAWP00010</td>
			<td>10 FT roll, hydrophillic, white, plain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest Plate 96 well, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1582.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova&#160;44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>with lid, sterile, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92x16mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinning tools</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato starch</td>
			<td>Bulk Barn</td>
			<td>279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S343-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Applicators</td>
			<td>Dukal Corporation</td>
			<td>9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibiotic dereplication using the antibiotic resistance platform

Doğal ürün özleri yeni antibiyotikler için arama ana zorluklardan biri ortak bileşiklerin yeniden keşfi. Bu zorluğu gidermek için, bilinen bileşikleri tanımlama işlemi olan çoğaltma, ilgi örnekleri üzerinde gerçekleştirilir. Analitik ayırma ve kütle spektrometresi gibi dereplik yöntemleri zaman alıcı ve kaynak yoğun. Dereplik sürecini iyileştirmek için antibiyotik direnci platform (ARP) geliştirdik. ARP, Escherichia coli içine tek tek klonlanmış yaklaşık 100 antibiyotik direnci geninin yer aldığı bir kütüphanedir. Bu suş toplama antibiyotik dereplication için bir maliyet-etkin ve kolay yöntem de dahil olmak üzere birçok uygulama vardır. Süreç, katı ortam içeren dikdörtgen Petri kaplarının yüzeyinde antibiyotik üreten mikropların fermantasyonunu içerir ve böylece ikincil metabolitlerin orta yoluyla salgılanmasına ve yayılmasına olanak tanır. 6 günlük fermantasyon döneminden sonra mikrobiyal biyokütle çıkarılır ve petri kabına ince bir agar-bindirme ilave edilip pürüzsüz bir yüzey oluşturur ve E. coli indikatörlerinin büyümesini sağlar. ARP suşları koleksiyonumuz daha sonra antibiyotik içeren Petri kabının yüzeyine sabitlenir. Plaka bir sonraki bindirme yüzeyinde E. coli büyüme sağlamak için bir gecede kuluçka. Sadece belirli bir antibiyotiğe (veya sınıfa) direnç içeren suşlar bu yüzeyde büyür ve üretilen bileşiğin hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu yöntem, bilinen antibiyotik üreticilerinin belirlenmesi nde ve yeni bileşikler üretenleri belirlemek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır.

Aşağıdaki sonuçlar, antibiyotik üreten bir ilgi suşlarının arp ve/veya MARP kullanılarak çoğaltılması yla elde edilebildi.
ARP/MARP dereplik iş akışının diyagramı Şekil 1'degösterilmiştir ve kütüphane plaka haritaları Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2'degösterilmiştir. Şekil 2, çevresel ekstre WAC 8921'in kloramfenikol üreticisi olarak tanımlandığı pozitif bir dereplik sonuc...

Watch this Scientific Journal Video about Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform at JoVE.com

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Biz antibiyotik dereplication için izojenik antibiyotiğe dirençli Escherichia coli bir kütüphane kullanan bir platform açıklar. Bakteri veya mantarlar tarafından üretilen bir antibiyotiğin kimliği, kendi direnç genini ifade eden E. coli'nin büyümesi ile ortaya çıkarılabilir. Bu platform ekonomik açıdan etkili ve zaman etkindir.

Antibiyotik Direnci Platformu Kullanarak Antibiyotik Dereplication

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Özel ekipman kullanmadan bilinen antibiyotiklerin hem maliyet etkin hem de zamanında derepiyonu sağlar, çünkü bizim protokol önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı şablon özelleştirmedir. Bu, bir bireyin, istenilen geniş veya dar substrat özgüllüğü düzeyine göre kütüphane şablonuna eklemek istediği direnç genlerini uyarlayabileceği anlamına gelir.Örneğin, bir beta-laktam e.coli şablonu beta-laktamlar ve çeşitli alt sınıfların son derece özel derepifasyonu için izin vermek için hazırlanabilir ifade ediyor. Bir septik tekniği kullanarak, pipet 500 katyon mikrolitre steril bir rezervuar dan steril bir rezervuar dan steril, 96 derin kuyu plaka her kuyuiçine MHB ayarlı. Hazırlanan ARP veya MARP gerinim plakaları ile, ARP veya MARP haritasına uygun olarak 96 derin kuyu plakasını aşılamak için aplikatör çubuğu kullanın.Derin kuyu plaka yüzeyine bir nefes sızdırmazlık membran ı yerleştirin ve 37 santigrat derece, 250 RPM gecede kuluçka. Kontamine kuyu olmadığından emin olun. Çok kanallı pipet kullanarak, derin kuyu plakasının her kuyudan 100 mikrolitreyi steril 96 kuyulu yuvarlak alt plakaya aktarın.Her kuyuya 100 mikrolitre steril %50 gliserol ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı boru lar ekleyerek karıştırın. En az beş kütüphane plakası hazırlayın. Plakaları steril alüminyum contalarla kaplayın ve her kuyunun ayrı ayrı mühürlenmesini sağlayın.Plaka kapağını alüminyum contanın üzerine yerleştirin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ahşap aplikatör çubuğu kullanarak, bir streptomyces koloniyüzeyinden yavaşça sporlar kazımak ve bir steril cam boncuk ve streptomyces antibiyotik orta üç mililitre içeren bir test tüpü içine aktarın. Havalandırmaya izin vermek için test tüpünü bir kapakla gevşek bir şekilde kapatın.Aynı ahşap aplikatör çubuğunu kullanarak, Bennett'in agarını içeren bir Petri kabında sterilite kontrolü yerleştirin. Tohum kültürünü içeren tüpü 30 derecede 250 RPM'de altı gün havalandırma ile ve sterilite kontrol plakasını 6 gün boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, düz bir yüzeyde, çoğaltma plakaları hazırlayın.Bir serolojik pipet içine sıcak Bennett's agar 23 mililitre aspire ve dikdörtgen Petri kabının yüzeyinde eşit 20 mililitre dağıtmak, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için pipet içinde orta kalan bırakarak. Tabağı bir kapakla kapatın. Orta plakanın tüm alanlarını kaplayana kadar plakayı yavaşça döndürün ve agar tamamen ayarlanana kadar onu rahatsız etmeyin.Daha sonra, dikdörtgen Petri çanak kapağını bir izleme şablonu olarak kullanarak nitroselüloz membran levhaları hazırlayın, böylece yapraklar çoğaltma plakasının yüzeyine uyun. Çarşafları kesin ve steril bir kese içinde otoklavlayın. Şimdi, altı günlük kuluçkadan sonra hiçbir kirletici madde bulunmadığından emin olmak için sterilite kontrol plakasını kontrol edin.Kontaminasyon yoksa, dikdörtgen Petri kabının kapağını ve tohum kültürünün 200 mikrolitrelik pipetini dikdörtgen çanaktaki Bennett'in agarının yüzeyine çıkarın. Kültürü tüm plakanın yüzeyine eşit olarak yaymak için steril bir pamuklu bez kullanın. Hazırlanan nitroselüloz membranı Petri kabının yüzeyindeki kültürün üzerine konumlandırmak için, membranın alt kenarını Petri kabının alt kenarına hizalayın ve membranı alt kenardan plakanın üst kenarına yavaşça uygulayın.Membran agar arayüzü arasında oluşmuş olabilecek hava kabarcıklarını düzeltmek için steril pamuklu bir bez kullanın, membranA agar floş olmasını sağlamak. Sekonder metabolitler aşağıdaki ortama atılabilirken membran organizmaların yüzeyinde sporulate sağlar. Kapağı dikdörtgen Petri kabına geri koyun ve ters bir şekilde kapalı bir plastik torbaya koyun.6 gün boyunca 30 derecede kuluçkaya yat. Altı gün sonra, dereplik plakasını kuvözden çıkarın. Steril cımbız kullanarak, dikkatle Bennett's agar yüzeyinden nitroselüloz membran kaldırın.Eklenecek kaplamayı kirletme olasılığını azaltmak için plakanın kenarlarında sadece küçük bir spor büyümesi olduğundan emin olun. Çalışma yüzeyinin düz olduğundan emin olun ve 23 mililitre sıcak katyon agar agar aspire etmek için serolojik pipet kullanın. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için agarın geri kalanını pipette bırakarak, çoğaltma plakasının yüzeyine 20 mililitre eşit olarak dağıtarak bir kaplama oluşturun.Kapağı tabağa yerleştirin. Orta tüm alanları kaplayana kadar plakayı yavaşça döndürün ve agar tamamen ayarlanana kadar onu rahatsız etmeyin. Bir kez soğutulmuş ve katılaşmış, mühürlü plastik torbaya dereplik plakası dönmek ve baş aşağı dört derece santigrat gecede saklamak, MHB agar bindirme içine ikincil metabolitlerin difüzyon için izin.Aynı gün, 100 mikrolitre katyon ayarlı MHB'yi 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna borulandırarak yeni bir ARP veya MARP şablonuna inoküle edin. Eksi 80 derece santigrat dondurucu dan dondurulmuş stok ARP veya MARP kütüphane plakası atın. Yoğuşma alt tarafında oluşmaya başlamadan önce alüminyum mührü çıkarın.Steril 96 kuyulu sabitleme araçlarını kullanarak, dondurulmuş stok ARP veya MARP kütüphane plakasından dikkatlice sabitlenin ve 96 kuyulu plakalar içeren taze MHB'yi inceltin. Çoğaltma sırasında kontaminasyonu en aza indirmek için, kitaplık plakası başına yalnızca iki ila üç çoğaltma plakasını çoğaltmak için gereken sayıda ARP veya MARP kitaplık plakası kadar hazırlayın. Tamamlandıktan sonra, dondurulmuş şablon üzerine yeni bir steril alüminyum mühür koymak ve eksi 80 derece Santigrat dondurucu dönmek.Aşılanmış 96 kuyulu plakaları gevşek bir şekilde kapatılmış bir plastik torbanın içine yerleştirin ve 18 saat boyunca 250 RPM'de sallayarak 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kuvözden ARP veya MARP şablonu çıkarın ve plakayı ARP veya MARP şablon haritasıyla karşılaştırarak hiçbir kirletici madde bulunmadığından emin olun. Dereplication plakaları dört santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığına dengede izin verin.Yoğuşma varsa, kapakları açın ve steril bir ortamda kurumasını bekleyin. Steril sabitleme araçlarını kullanarak, ARP veya MARP kitaplık plakasından dereplik plakalarının MHB agar kaplamasının yüzeyine sabitlenin. Agar'ı delmemeye dikkat et.Şablon inoculum üç ila beş dakika kurumasını bekleyin. Aşılanmış ayrıştırıcılık plakalarını kapalı bir plastik torbaya ters çevirin ve gece boyunca 37 santigrat derece kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, dereplication plakaüzerindeki büyümeyi ARP veya MARP haritasına karşılık gelen kuyularla karşılaştırarak çoğaltma sonuçlarını analiz edin.Bu ARP veya MARP dereplication iş akışında, pozitif bir çoğaltma sonucu elde edildi. Wac 8921 için hazırlanan ekstre kloramfenikol üreticisi olarak tanımlanmıştı. ARP büyüme eksikliği ya bilinmeyen bir antibiyotik ya da ARP veya MARP kütüphane plakası hesaba katmadı daha az yaygın olarak bulunan antibiyotik varlığını gösterir.MARP'ye özgü bir büyüme modeli, hem vahşi tip E.coli BW25113 hem de hiper geçirgen ve e-akı eksikliği mutant E.coli BW25113 bamB tolC'nin kullanımı nedeniyle oluşmuştur. Bu sonuç, bozulmamış bir dış zarı geçemeyen antimikrobiyal aktiviteye sahip bir bileşiğin varlığını göstermektedir. Bu E.coli büyüme desenleri sabitleme araçlarının yanlış sterilizasyonunu göstermektedir, bu da bilinmeyen E.coli suşlarının bindirme boyunca aktarılmasıyla sonuçlanır.Ve ARP veya MARP dondurulmuş stok kütüphane plaka kirlenme bir örnek burada dikdörtgen Petri çanak yüzeyinde yetiştirilen üç farklı E.coli kolonileri ile gösterilir. Bu sonuç, agar bindirmesinin dereplik sırasında delindiğini gösterir. MHB bindirme ile ilgili kontaminasyon da dereplication işlemi sırasında oluşabilir, bindirme yüzeyinde düzensiz bir büyüme deseni gösteren.Bu protokolü takip ederken hatırlanması gereken en önemli şey, kontaminasyon nedeniyle herhangi bir adımda geri tutulmamanızı sağlamak için uygun sterilizasyon ve aseptik teknikleri kullanmaktır. Bu, MHB bindirme sini dökerken sporların yayılmasını en aza indirmek için Bennett'in agar plakasının yüzeyine mümkün olduğunca yakın bir şekilde sığacak şekilde nitroselüloz membranının hazırlanmasını içerir. Ayrıca, kütüphane plakalarını aşılarken ve en temiz sonucu elde etmek için çoğaltma yaparken düzgün sterilize edilmiş sabitleme ekipmanı kullanmak da son derece önemlidir.Bilinen antibiyotiklerin çoğaltılmasına ek olarak, bu yöntem aktivitelerini kurtarmak için mevcut antibiyotiklerle birlikte kullanılabilecek sıfatların belirlenmesinde de uygulanabilir. Antibiyotik dereplik yeni bir teknik olmamasına rağmen, kaynak yoğun ve zaman alıcı olduğu için kötü üne sahiptir. ARP ve MARP platformu antibiyotik dereplik büyük bir üretim olması gerekmez nasıl bir ışık tutmak için yardımcı, ama daha ziyade en az ekipman kullanılarak iki haftalık bir süre içinde tamamlanabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Hızlı Bakteriyel Teşhis ve Antibiyotik Duyarlılık Testi için bir Kan Kültürü Peleti hazırlanması

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Ana fenotipleri incelenmesi halinde<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Takiben Antibiyotik Tedavisi

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Antibiyotik Tedavisine Yanıt Vermek

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Oral antibiyotik tedavisinden sonra fare bağırsak Microbiota nicel polimeraz zincir reaksiyonu tabanlı analiz

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Otomatik davranış analizi büyük C. elegans nüfus kullanarak bir geniş alan bakış açısı izleme platformu

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Nicel muayene, antibiyotik duyarlılık Neisseria gonorrhoeae toplamları kullanarak ATP-kullanımı ticari deneyleri ve canlı/ölü boyama

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...