Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

وقد مول هذا العمل المجلس الدانمركي للبحوث المستقلة [المنحة رقم 5054-00165B].

1. اعداد الليليسوم
ملاحظه: لفتره وجيزة ، واعداد الشحمية عاده ما يتضمن ثلاث خطوات حاسمه: 1) اعداد الأفلام الدهنية الجافة من تكوين الدهون المطلوب ؛ 2) الاماهه من الدهون لتشكيل الشحمية. و 3) السيطرة علي حجم و lamellarity من السكان الدهنية.
<ol><li>تزن الدهون وتذوب في tert-butanol: المياه (9:1) في قو...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+spots:+Complex+phase+behavior+in+simple+membranes.">Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+curved+membranes+recruit+amphipathic+helices+and+protein+anchoring+motifs.">How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs.</a> Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Elizondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+Preparation+Route+on+the+Supramolecular+Organization+of+Lipids+in+a+Vesicular+System.">Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).</li><li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Inhomogeneity+in+the+Lipid+Composition+of+Individual+Nanoscale+Liposomes.">Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li><li>Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+Efficiency+Measured+on+Single+Small+Unilamellar+Vesicles.">Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).</li><li>Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intermediates+in+SNARE-induced+membrane+fusion.">Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).</li><li>Fix, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+membrane+fusion+events+mediated+by+SNARE+proteins.">Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

من المهم ان نلاحظ انه في حين اننا وصف بالتفصيل كيف يمكن استخدام المقايسة الشحمية واحده لدراسة التجانس التركيبي بين الدهنية الفردية ، ومنصة متعددة جدا. كما هو مبين سابقا ومناقشتها في المقدمة ، يمكن تكييف البروتوكول بسهوله لدراسة جوانب من الانصهار غشاء غشاء ، والتفاعلات غشاء البروتين ، أو ?...

الدهنية هي الحويصلات القائمة علي فسفوليبيد كرويه التي تستخدم بشكل كبير علي حد سواء في البحوث الاساسيه والتطبيقية. انها تعمل كنظم ممتازة نموذج الغشاء ، لان خصائصها الفيزيائية يمكن التلاعب بها بسهوله عن طريق مختلف مكونات الدهون التي تشكل الشحمية1،2. أيضا ، الجسيمات الشحمية تشكل نظام nanocarrier تسليم المخدرات الأكثر استخداما ، وتقدم تحسين الدوائية و دوائي وكذلك التوافق البيولوجي عاليه3.
لسنوات عديده ، وقد درست الجسيمات الشحمية في المقام الأول باستخدام التقنيات السائبة ، وإعطاء فقط الوصول إلى الفرقة متوسط قيم القراءة المغادرة. وقد ادي هذا الغالبية من هذه الدراسات ان نفترض ان جميع الدهنية في الفرقة متطابقة. ومع ذلك ، فان هذه القيم المتوسطة للفرقة تكون صحيحه فقط إذا كانت مجموعه البيانات الاساسيه موزعه بشكل موحد حول القيمة المتوسطة ، ولكن يمكن ان تمثل استنتاجا زائفا ومتحيزا إذا كانت المجموعة تتضمن مجموعات سكانية مستقله متعددة ، علي سبيل المثال. بالاضافه إلى ذلك ، علي افتراض الفرقة يعني لتمثيل السكان بأكملها يمكن ان نغفل المعلومات بالضجر داخل التجانس بين الدهنية. فقط في الاونه الاخيره قد ظهرت المقايسات الكمية التي هي قادره علي التحقيق الشحمية واحده ، وكشف الجينات الكبيرة بين الدهنية الفردية فيما يتعلق بالخصائص الفيزيائية الكيميائية الهامه بما في ذلك حجم ليبوسوم4، وتكوين الدهون5،6، وكفاءه التغليف7، وتسليط
وقد أظهرت منطقه البحث حيث المتوسطة الفرقة من خصائص الشحمية لنتائج التحيز يدرس الدهنية حجم التفاعلات غشاء البروتين المعتمدة8,9. تقليديا ، تم تقييد الباحثين دراسة مثل هذه العمليات لاعداد الشحمية مع مختلف أقطار الفرقة المتوسطة عن طريق البثق من خلال الفلاتر مع احجام مختلفه المسام9. ومع ذلك ، استخراج قطر الجسيمات الشحمية الفردية باستخدام اختبارات الشحمية واحده وكشفت عن التداخلات السكانية الكبيرة ، مع الجسيمات الشحمية مقذوف باستخدام 100 nm و 200 nm مرشحات عرض ما يصل إلى 70 ٪ تراكب في توزيع حجمها4. وهذا يمكن ان التحيز بشده قياسات السائبة من التفاعلات الدهنية حجم البروتين المعتمدة علي الغشاء10. اجراء دراسات تفاعل البروتين الغشاء باستخدام الفحص الشحمي الواحد ، والباحثين بدلا من ذلك الاستفادة من حجم-المشتتة داخل العينة ، والسماح لهم لدراسة مجموعه واسعه من أقطار الشحمية داخل كل تجربه واحده ، وتسهيل الاكتشافات الجديدة لكيفيه انحناء الغشاء وتكوين يمكن ان تؤثر عليتجنيد البروتينإلى الاغشيه4 حقل آخر حيث تطبيق اختبارات الشحمية واحده أثبتت انها مفيده في الدراسات الميكانيكية من البروتين بوساطة غشاء الانصهار13,14. النسبة لهذه القياسات الحركية ، خففت القدرة علي دراسة احداث الانصهار الفردية من الحاجة إلى التزامن التجريبي لعمليه الانصهار ، مما سمح برؤى ميكانيكيه جديده لولا ذلك لفقدت في المتوسط المكاني الذي اجري في قياسات الفرقة السائبة. بالاضافه إلى ذلك, وقد استخدمت الجسيمات الشحمية واحد كسقالة غشاء, السماح لقياس البروتينات الفردية وتقديم المعرفة الجديدة علي ديناميات البروتين الغشاء المتحول15,16. وعلاوة علي ذلك ، فان هذه الاجهزه القائمة علي البروتينات البروتينية جعلت من الممكن دراسة وظيفة الناقلات الفردية عبر الغشاء17 ومجمعات البروتين التي تشكل المسام18 وكذلك اليه الغشاء النشط بيولوجيا-الذي يتخلل الببتيدات19. وقد استخدمت الجسيمات الشحمية واحد أيضا نانوفلويديكس المواد اللينة مع الجسيمات الشحمية السطحية التي تعمل كغرف لردود الفعل الانزيميه في احجام من 10إلى 19 لتر ، وزيادة الانتاجيه وتعقيد اختبارات الفرز مع استهلاك المنتج الحد الأدنى20.
في الاونه الاخيره ، وقد استخدمت اختبارات الشحمية واحده لتوصيف الجسيمات الشحمية تسليم المخدرات في مستوي لم يسبق له سابقا من التفاصيل. وكان الباحثون قادرين علي تحديد كميات كبيره من التجانس في كميه البوليمر تعلق علي سطح الجسيمات الشحمية21. وسمحت اختبارات الشحمية الواحدة أيضا قياسات الدهنيات تسليم المخدرات في وسائل الاعلام المعقدة ، مثل بلازما الدم ، والكشف عن كيفيه العناصر الراسية إلى سطح الشحمية من خلال المراسي الدهون يمكن ان تكون عرضه للانفصام عندما تتعرض الشحمية للظروف محاكاة تلك التي شهدت خلالالدورةالمجري وبشكل عام ، فان براعة وفائدة اختبارات الشحمية الواحدة مدعمه بمجموعه كبيره من المشاكل التي استخدمت هذه الاجهزه لمعالجتها ، ونحن نتصور ان المنهجية ستستمر في التطوير والبحث عن الاستخدام في المجالات العلمية الجديدة.
هنا نقوم بوصف الفحص المجهري القائم علي المجهر الأحادي الذي يسمح بدراسة الدهنيات الفردية بطريقه عاليه الانتاجيه (الشكل 1). لتوضيح هذه الطريقة ، ونحن نستخدمها لقياس حجم والتجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية داخل الفرقة. الفحص يستخدم التصوير المجهر مضان من الجسيمات الشحمية الوحيدة التي تم تعبئتها علي سطح زجاجي تخليته. ونحن أولا وصف الخطوات الحاسمة في عمليه تصنيع الشحمية التي تضمن السليمة الفلورسنت التسمية الدهنية والتجميد. ثم ، ونحن وصف الاعداد السطحية اللازمة لتسهيل الشفط الشحمي قبل تحديد الاجراء لضمان كثافة سطح الدهنية المناسبة. نناقش المعلمات المجهرية الهامه للحصول علي صور عاليه الجودة وتحديد كيفيه اجراء تحليل البيانات البسيطة ، والسماح لاستخراج حجم الشحمية والتجانس التركيبي. وينبغي لهذا البروتوكول العام ان يوفر أساسا جيدا للباحث المهتم بالأمر لكي يطور الفحص أكثر لفائدته البحثية المحددة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

معظم البحوث التي توظف الجسيمات الشحمية كما نظم نموذج الغشاء أو ناقلات تسليم المخدرات تعتمد علي تقنيات القراءة السائبة التالي يفترض في جوهرها جميع الشحمية من الفرقة لتكون متطابقة. ومع ذلك ، منصات تجريبية جديده قادره علي مراقبه الجسيمات الشحمية علي مستوي الجزيئات الواحدة جعلت من الممكن لاجراء دراسات عاليه التطور والكمية علي التفاعلات غشاء البروتين أو خصائص الناقل المخدرات علي الجسيمات الشحمية الفردية ، التالي تجنب الأخطاء من المتوسط الفرقة. هنا نقدم بروتوكولا لاعداد وكشف وتحليل الجسيمات الشحمية واحده باستخدام الفحص المجهري القائم علي الفلورية ، وتسهيل هذه القياسات أحاديه الجزيئات. الاعداد يسمح للتصوير الدهنية الفردية بطريقه موازيه ضخمه ويستخدم للكشف عن حجم داخل العينة والتركيبية المتجانسة. بالاضافه إلى ذلك ، يصف البروتوكول مزايا دراسة الجسيمات الشحمية في مستوي الشحمية الواحدة ، وحدود الفحص ، والميزات الهامه التي يجب مراعاتها عند تعديلها لدراسة الاسئله البحثية الأخرى.

بعد البروتوكول الموصوف يجعل من الممكن لصوره الجسيمات الشحمية واحد بطريقه متوازية ضخمه (الشكل 1). التجميد السطحي الناجح من الجسيمات الشحمية يجب ان يكون واضحا علي الفور عند أضافه محلول الليبوسوم إلى الغرفة (الخطوة 3.6 في البروتوكول) كما ينبغي ان تظهر بقع شده ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

يصف هذا البروتوكول تلفيق الجسيمات الشحمية وكيف يمكن ان يتم تعبئتها علي سطح وبشكل فردي بطريقه متوازية ضخمه باستخدام المجهر الفلوري. وهذا يسمح للقياس الكمي للحجم والتجانس التركيبي بين الدهنيات واحد من السكان.

A الكمي الفلورية المجهري القائم علي فحص ليبوسوم واحد للكشف عن التجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية الفردية

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

معظم البحوث مع liposomes تعتمد على تقنيات جريئة في جوهرها على افتراض جميع liposomes لتكون متطابقة. من خلال دراسة الدهنيات واحدة، يمكن ملاحظة تشوهات كبيرة. تسمح لنا تقنية الليبوسومات الوحيدة المعروضة هنا بدراسة مئات الليبوزومات في وقت واحد واكتشاف التشوهات في حجمها وتكوينها.يمكن بسهولة تعديل هذه الطريقة لدراسة أنظمة أخرى على مستوى واحد من الدهون مثل التفاعلات غشاء البروتين. كل ما تحتاجه هو المركب الذي تدرسه ليتم تصنيفه بفلورسنت. مع هذا الفيديو، ونحن نقدم للباحثين مع أداة على كيفية إجراء دراسات ليبوسومات واحدة.نأمل أن يكون من الواضح أن من السهل تعديل الفحص لدراسة مجموعة من الموضوعات العلمية الأخرى. للبدء، مزيج من الأسهم الدهون المعدة 138 ميكرولترات من POPC و 120 ميكرولترات من الكوليسترول في قارورة الزجاج الطازج. ثم إضافة 500 ميكروليتر كل من اثنين من الدهون الفلورسنت المسمى و 50 ميكرولترات من DSPE-PEG-البيوتين.تخفيف غطاء الزجاج قارورة و المفاجئة تجميد القارورة في النيتروجين السائل لمدة دقيقة إلى دقيقتين. Lyophilize خليط الدهون المجمدة بين عشية وضحاها في مجفف تجميد. في الصباح، إضافة ملليلتر واحد من 200 ميلي متر D-السوربيتول العازلة إلى الدهون الجافة.سخني الخليط إلى 45 درجة مئوية وتعرّضه للتحريك المغناطيسي لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم تجميد تعليق الدهون عن طريق غمس القارورة في النيتروجين السائل والانتظار حتى يتم تجميد التعليق تماما. بعد ذلك، تراجع التعليق المجمد في حمام التدفئة في 55 درجة مئوية حتى يذوب الخليط تماما.يعرض الخليط لما مجموعه 11 دورة تجميد ذوبان. بعد ذلك، وذلك باستخدام مجموعة صغيرة من البثق، بثق تعليق liposome مرة واحدة من خلال مرشح البولي كربونات 800 نانومتر. مزيج 1، 200 ميكرولترات من BSA و 120 ميكرولترات من البيوتين BSA.إضافة 300 ميكرولترات من الخليط إلى كل بئر في شريحة ثمانية بئر واحتضان الشريحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إمالة قليلاً الشريحة ومن حافة كل التعرق جيدا المتوسطة. إضافة على الفور 300 ميكرولترات من العازلة HEPES في كل بئر لغسل.غسل كل بئر ثماني مرات في المجموع. إضافة 250 ميكرولترات من streptavidin واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الغسلات الثمانية كما سبق وصفها.ضع الشريحة على المجهر وضبط عصا التحكم المجهرية للتركيز على سطح الغرفة. ويمكن بسهولة القيام بذلك باستخدام زيادة إشارة انعكاس الليزر من واجهة العازلة الزجاج كدليل. في أنبوب microcentrifuge، إضافة 10 ميكرولترات من مخزون liposome المخفف التي تحتوي على 20 الدهون الإجمالية ميكرومولار.نقل 100 ميكرولترات من العازلة من الغرفة إلى أنبوب microcentrifuge، مزيج بشكل صحيح، ونقل 110 ميكرولترات مرة أخرى إلى الغرفة. وضع الغرفة تحت المجهر واستخدام المجهر بدائية الإعدادية قادرة على الكشف عن إشارة من الفلوروفورات liposomes لمراقبة liposomes يجري شل على السطح. إعداد المجهر كما هو موضح في المخطوطة.لتصوير كل من DOPE ATTO488 و DOPE ATTO655 فلوريد في liposomes، صورة قنوات متعددة. تأكد من أن كل قناة يتم تصويرها بشكل تسلسلي لتجنب الإثارة المتقاطعة. على سبيل المثال، أولاً تأخذ صورة واحدة من قبل مثيرة في 488 نانومتر وقراءة الانبعاثات في 495 إلى 590 نانومتر.بعد ذلك ، قم بتغيير الإعدادات واتخاذ صورة أخرى عن طريق مثيرة في 633 نانومتر ولكن قراءة الانبعاثات فقط في 660 إلى 710 نانومتر. تحليل. في قائمة الصور، اختر اللون واستخدم وظيفة قناة الدمج لإنشاء مركب للقنوتين. لاحظ ما إذا كانت الليبوسومات المصوّرة في قناتين مختلفتين تعرض توطينًا مشتركًا جيدًا أو ما إذا كان الانجراف المرئي قد حدث أم لا.للكشف عن الجسيمات، افتح قائمة المكونات الإضافية، اختر ComDet وانقر على اكتشاف الجسيمات. في ComDet، تحقق من صحة الإعدادات ثم اضغط موافق. بعد تشغيل التحليل، نوافذ منبثقة اثنين مع النتائج وعرض ملخص. يحتوي جدول النتائج على نسبة الكثافة بين القناتين.تصدير نتائج جدول البيانات التي تحتوي على بيانات الترجمة المشتركة. تناسب الرسم البياني نسبة كثافة مع وظيفة الغاوسية واستخراج الانحراف المتوسط والواس. يمكن استخدام الانحراف المعياري و المتوسط لحساب درجة عدم الاتّاج.إعداد تركيبة الليبوسومات التي تم بثقها عدة مرات من خلال مرشح نانومتر 50. معايرة حجم liposomes من خلال مقارنة شدة الفلوريسنس إلى حجم البيانات من DLS. مع نفس إعدادات المجهر التجريبي كما كان سابقا، صورة lipوزوes المعايرة.رسم الرسم البياني كثافة الجذر التربيعي من كثافة الفلوريسنس من lipوزوes المعايرة. تناسب الرسم البياني مع توزيع عادي سجل واستخراج متوسط كثافة الفلورس من lipوزوes معايرة الوسط الهندسي. لتحديد العلاقة بين كثافة الجذر التربيعي وحجم الليبوزومات، حساب عامل التصحيح بقسمة متوسط قطر الليبوزوم التي تم الحصول عليها من قياسات تشتت الضوء الديناميكي مع الوسط الهندسي لكثافة الجذر التربيعي.حساب قيم كثافة الجذر التربيعي للليبوسومات في تجربة عدم الفهم التركيبي وتحويل هذين القطرين عن طريق ضرب مع عامل التصحيح. رسم قيمة نسبة كثافة كدالة القطر للليبوسومات غير التركيبية، وبالتالي تحقيق عدم فهم كدالة حجم الليبوزومات لسكان liposomes تمتد من حوالي 50 نانومتر إلى 800 نانومتر. في هذا البروتوكول ، كان نجاح تثبيت سطح الليبوسومات واضحًا فورًا عند إضافة محلول liposome إلى الغرفة المشار إليها من قبل بقع الكثافة المحدودة.فمن المستحسن لشل ما يكفي من liposomes لتحقيق كثافة من 300 إلى 400 liposomes في الإطار الواحد. إن انخفاض الكثافة يجعل تحليل البيانات أكثر استهلاكًا للوقت في حين أن الكثافة الأعلى تجعل التمييز بين الدهون الدهنية المفردة أمرًا صعبًا. إذا لم يكن مجال الرؤية بأكمله في التركيز الصحيح، قد تكون لوحة العينة مائلة.أيضا، إذا كان يبدو liposomes كبيرة وضبابية، وهذا يشير إلى أن العازلة في الغرفة قد تبخرت وسطح جفت. عادة ما تكشف نسبة الكثافة توزيع الغاوسي حول قيمة متوسط نسبة. إذا لوحظت انحرافات قوية عن توزيع الغاوسي، فإنه يشير إلى مشكلة حساسية الكشف مما يشير إلى أنه تم استبعاد مجموعة فرعية من الليبوزومات التي تظهر إشارة أضعف.بعد تركيب الرسم البياني نسبة كثافة مع وظيفة غاوسية، تم ترجمة درجة من قيمة 0.23 homogeneity 0.23 إلى 32٪ من السكان تختلف بأكثر من 23٪ من متوسط نسبة المولى من الفرقة. وتبين أن القياس الكمي لعدم اليقين التجريبي هو 0.1. فإن المقايسة أبدا الحصول على أفضل من المواد التي تستخدمها عالية الجودة ليبوسومات unilaminar ضرورية.حتى عند إعداد هذه، لا قطع أي زوايا مثل ترك خارج دورات التجميد ذوبان الجليد. سوف تؤدي الصور السيئة إلى عدم اليقين التجريبي العالي وتجعلك تبالغ في تقدير عدم الاتّهان لذا خذ الوقت للحصول على صور جيدة في التركيز. ما يفعله الفحص بشكل أساسي هو دراسة كثافة سطح علامة الفلورسنت.إذا كان هذا الملصق الفلورسنت على الدهون متغلغلة، ثم يمكن استخدام هذا الفحص لاختبار ليبوسومات جودة لتسليم المخدرات. وقد تم تطبيق الإعداد لدراسة كيفية ربط الببتيدات إلى الأغشية والشعور الانحناء. وقد أعطى هذا الباحثين رؤى فريدة من نوعها إلى الإشارات الجزيئية التي تحكم كيفية فرز الببتيدات داخل الخلايا.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

التحكم الكمي والزمني للأكسجين المكروية في جزيرة واحدة المستوى

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

المخدرات التي يسببها-توعية انزيمات محلقة: تبسيط الفحص والتصغير لجزيء صغير وسيرنا تطبيقات الفحص

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

تحليل خلط التجانس في جهاز ميكروفلويديك التي كتبها الميكروسكيل انعراجي تقنية

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

مضان غشاء حيوي قوة دقق: الكميات المتزامنة من حركية مستقبلات يجند والتي يسببها ملزم بين الخلايا اشارة على خلية واحدة

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

متعدد الألوان كشف الإسفار عن القطرة على microfluidics عن طريق الألياف البصرية

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

الاعتراف الجزيئية والهندسة مع البوليمرات الحيوية المحاكاة على واحدة المسورة الكربون الأنابيب النانومترية

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

منصة موائع جزيئية أولتراهيغ الإنتاجية لتسلسل جينوم خلية واحدة

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...