Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af det danske råd for uafhængig forskning [tilskudsnummer 5054-00165B].

1. præparation af liposome
Bemærk: forberedelse af Liposomer omfatter normalt tre afgørende trin: 1) tilberedning af tørre lipid-film af den ønskede lipid-sammensætning; 2) rehydrering af lipiderne til dannelse af Liposomer; og 3) kontrol af størrelsen og lamellaritet af Liposom populationen.
<ol><li>Afvejes lipiderne og opløse dem i tert-butanol: vand (9:1) i hætteglas.<ol>
<li>Opløs POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin; MW = 760 g/mol) til 50 mM.</li>
		<li>Kolester...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+spots:+Complex+phase+behavior+in+simple+membranes.">Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+curved+membranes+recruit+amphipathic+helices+and+protein+anchoring+motifs.">How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs.</a> Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Elizondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+Preparation+Route+on+the+Supramolecular+Organization+of+Lipids+in+a+Vesicular+System.">Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).</li><li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Inhomogeneity+in+the+Lipid+Composition+of+Individual+Nanoscale+Liposomes.">Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li><li>Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+Efficiency+Measured+on+Single+Small+Unilamellar+Vesicles.">Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).</li><li>Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intermediates+in+SNARE-induced+membrane+fusion.">Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).</li><li>Fix, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+membrane+fusion+events+mediated+by+SNARE+proteins.">Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

Det er vigtigt at bemærke, at mens vi beskriver i detaljer, hvordan den enkelte Liposomer assay kan bruges til at studere kompositoriske inhomogenitet mellem individuelle Liposomer, platformen er meget alsidig. Som tidligere vist og diskuteret i indledningen, kan protokollen let tilpasses til at studere aspekter af membran-membran fusion, protein-membran interaktioner, eller liposomal Drug Carrier karakterisering. For alle videnskabelige spørgsmål, der behandles, kraften i den enkelte Liposom assay ligger i evnen til ...

Liposomer er sfæriske phospholipid-baserede vesikler, der er stærkt anvendt både i grundlæggende og anvendt forskning. De fungerer som fremragende membran modelsystemer, fordi deres fysisk-kemiske egenskaber let kan manipuleres ved at variere de lipid komponenter, der udgør Liposom1,2. Også, Liposomer udgør den mest anvendte Drug levering nanocarrier system, tilbyder forbedret farmakokinetik og farmakodynamik samt høj biokompatibilitet3.
I mange år, Liposomer er primært blevet undersøgt ved hjælp af bulk-teknikker, giver kun adgang til ensemble gennemsnitlige læse-out værdier. Dette har ført hovedparten af disse undersøgelser til at antage, at alle Liposomer i ensemblet er identiske. Sådanne ensemble-gennemsnitlige værdier er dog kun korrekte, hvis det underliggende datasæt er jævnt fordelt omkring middelværdien, men kan repræsentere en falsk og forudindtaget konklusion, hvis datasættet omfatter flere uafhængige populationer, f. eks. Derudover, forudsat at ensemble betyder at repræsentere hele befolkningen kan overse de oplysninger, der harkede sig i inhomogeniteten mellem Liposomer. Først for nylig har der vist sig kvantitative analyser, som er i stand til at sonde enkelte Liposomer, afslører store inhomogeniteter mellem individuelle Liposomer med hensyn til vigtige fysisk-kemiske egenskaber, herunder Liposom størrelse4, lipid sammensætning5,6, og indkapsling effektivitet7, fremhæver betydningen af at studere Liposomer på det enkelte Liposom niveau.
Et forskningsområde, hvor ensemble gennemsnit af Liposom egenskaber har vist sig at bias resultater er at studere Liposom størrelse-afhængige protein-membran interaktioner8,9. Traditionelt, forskere, der studerer sådanne processer har været begrænset til at forberede Liposomer med forskellige ensemble gennemsnitlige diametre ved ekstrudering gennem filtre med forskellige porestørrelser9. Men, udtrække diameteren af individuelle Liposomer ved hjælp af enkelt Liposom assays har afsløret store befolknings overlap, med Liposomer ekstruderet ved hjælp af 100 nm og 200 Nm filtre viser op til 70% overlap i deres størrelse fordeling4. Dette kunne alvorligt bias bulk målinger af Liposom størrelse-afhængige protein-membran interaktioner10. Udførelse af membran-protein interaktion undersøgelser ved hjælp af enkelt Liposom assay, forskerne i stedet benyttede sig af størrelsen-polydispersitet i prøven, giver dem mulighed for at studere en bred vifte af Liposom diametre inden for hvert enkelt eksperiment, lette nye opdagelser af hvordan membran krumning og sammensætning kan påvirke protein rekruttering til membraner4,11,12. Et andet område, hvor anvendelsen af enkelt Liposom assays har vist sig instrumental er i Mekanistiske undersøgelser af protein-medieret membran fusion13,14. For sådanne kinetiske målinger linderede evnen til at studere individuelle fusions hændelser behovet for en eksperimentel synkronisering af fusionsprocessen, hvilket gav mulighed for ny mekanistisk indsigt, som ellers ville være gået tabt i den spatiotemporale gennemsnit udført i bulk ensemble målinger. Desuden er enkelt Liposomer blevet brugt som en membran stilladser, der gør det muligt at måle individuelle proteiner og tilbyde ny viden om transmembran protein strukturel dynamik15,16. Desuden gjorde sådanne proteoliposome-baserede opsætninger det muligt at studere funktionen af individuelle transmembran transportører17 og pore dannende protein komplekser18 samt mekanismen af bioaktive membran-permeabilizing peptider19. Enkelt Liposomer er også blevet brugt som bløde stof nanofluidics med overflade-immobiliseret enkelt Liposomer tjener som kamre til enzymatiske reaktioner i mængder på 10-19 L, øge gennemløb og kompleksiteten af screening assays med minimalt produkt forbrug20.
For nylig, enkelt Liposom assays har været brugt til at karakterisere Drug levering Liposomer på et tidligere forældet niveau af detaljer. Forskerne var i stand til at kvantificere væsentlige inhomogeniteter i mængden af polymer fastgjort til overfladen af individuelle Liposomer21. Den enkelte Liposom assays også tilladt målinger af Drug levering Liposomer i komplekse medier, såsom blodplasma, afslørende hvordan elementer forankret til liposomoverfladen gennem lipid ankre kan være modtagelige for dissociation når Liposomer er udsat for betingelser efterligne dem, der opleves under in vivo cirkulation22. Samlet set er alsidigheden og nytten af de enkelte Liposom assays underbygget af de mange forskellige problemer, som disse opsætninger har været ansat til at løse, og vi forestiller mig, at metodologien fortsat vil blive udviklet og finde anvendelse på nye videnskabelige områder.
Her beskriver vi en fluorescens Microscopy-baseret enkelt Liposom-analyse, der tillader individuelle Liposomer at blive undersøgt i en høj gennemløb måde (figur 1). For at illustrere metoden bruger vi den til at kvantificere størrelsen og den kompositoriske inhomogenitet mellem individuelle Liposomer i et ensemble. Analysen anvender fluorescens mikroskop billeder af enkelt Liposomer immobiliseret på en passiveret glasoverflade. Vi beskriver først de kritiske trin i Liposom fabrikationsprocessen, der sikrer korrekt fluorescerende Liposom mærkning og immobilisering. Derefter beskriver vi den overflade forberedelse, der er nødvendig for at lette Liposom immobilisering, før den skitserer proceduren for at sikre passende Liposom overflade tæthed. Vi diskuterer mikroskopi parametre vigtigt for at erhverve høj kvalitet billeder og afgrænse, hvordan man udfører simple dataanalyse, tillader udvinding af Liposom størrelse og kompositoriske inhomogenitet. Denne generiske protokol bør give den interesserede forsker et godt grundlag for at udvikle analysen yderligere for hans eller hendes specifikke forskningsinteresse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

De fleste forskning, der beskæftiger Liposomer som membran modelsystemer eller narkotika levering bærere er afhængig af bulk læse-out teknikker og dermed iboende antager alle Liposomer af ensemblet at være identiske. Nye eksperimentelle platforme, der kan observere Liposomer på enkelt partikel niveau, har imidlertid gjort det muligt at udføre meget sofistikerede og kvantitative undersøgelser af protein-membran interaktioner eller lægemiddel bæreegenskaber på individuelle Liposomer, således undgår fejl fra ensemble gennemsnit. Her præsenterer vi en protokol til forberedelse, påvisning og analyse af enkelte Liposomer ved hjælp af en fluorescens baseret mikroskopi analyse, der letter sådanne enkelt partikel målinger. Opsætningen giver mulighed for billeddannelse individuelle Liposomer i en massiv parallel måde og er ansat til at afsløre intra-stikprøvestørrelse og kompositoriske inhomogeniteter. Desuden, protokollen beskriver fordelene ved at studere Liposomer på det enkelte Liposom niveau, begrænsningerne af analysen, og de vigtige funktioner, der skal overvejes, når de ændrer det til at studere andre forskningsspørgsmål.

Efter den beskrevne protokol gør det muligt at afbilde enkelte Liposomer på en massiv parallel måde (figur 1). Den vellykkede overflade immobilisering af Liposomer bør straks ses ved tilsætning af liposomopløsningen til kammeret (trin 3,6 i protokollen) som diffraktion begrænset intensitet pletter bør vises i billedet (figur 1B og figur 1C).
<p class="jov...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Denne protokol beskriver fremstillingen af Liposomer, og hvordan disse kan være immobiliseret på en overflade og afbildet individuelt i en massiv parallel måde ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. Dette giver mulighed for kvantificering af størrelsen og kompositoriske inhomogenitet mellem enkelte Liposomer af befolkningen.

En kvantitativ Fluorescens mikroskopi-baseret enkelt Liposome-analyse til påvisning af den kompositoriske Inhomogenitet mellem individuelle Liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

De fleste forskning med liposomer stole på dristige teknikker i sig selv under forudsætning af alle liposomer at være identiske. Ved at studere enkelte liposomer kan der observeres signifikante inhomogeniteter. Den enkelt liposom teknik præsenteret her giver os mulighed for at studere hundredvis af liposomer samtidigt og opdage inhomogeneities i deres størrelse og sammensætning.Metoden kan nemt justeres til at studere andre systemer på et enkelt liposom niveau såsom proteinmembran interaktioner. Alt du behøver er det stof, du studerer for at blive fluorescerende mærket. Med denne video, vi giver forskerne med værktøjet på, hvordan de kan udføre enkelt liposome undersøgelser.Vi håber, at det er klart, at analysen let kan ændres for at studere en række andre videnskabelige emner. Til at begynde, bland de forberedte lipid bestande 138 mikroliter AF POPC og 120 mikroliter af kolesterol i en frisk glas hætteglas. Derefter tilsættes 500 mikroliter hver af to fluorescerende mærket lipider og 50 mikroliter DSPE-PEG-biotin.Løsne låget af glas hætteglasset og snap fryse hætteglasset i flydende nitrogen i et til to minutter. Lyophilize den frosne lipid blandingen natten over i en fryse tørretumbler. Om morgenen tilsættes en milliliter 200 millimolar D-sorbitol buffer til de tørre lipider.Varm blandingen til 45 grader Celsius og udsætte den for magnetisk omrøring i mindst en time. Derefter fryse lipid suspension ved at dyppe hætteglasset i flydende nitrogen og vente, indtil suspensionen er helt frosset. Dernæst dyppe den frosne suspension i et varmebad ved 55 grader Celsius, indtil blandingen er helt optøet.Eksponere blandingen til i alt 11 fryse-tø cykler. Efter at, ved hjælp af en mini ekstrudering kit, ekstrudere liposomet suspension en gang gennem en 800 nanometer polycarbonat filter. Bland 1, 200 mikroliter BSA og 120 mikroliter BSA biotin.Tilføj 300 mikroliter af blandingen til hver brønd i en otte-brønd dias og inkubere dias i 20 minutter ved stuetemperatur. Vip sliden lidt og fra kanten af hvert brøndsspirer mediet. Tilsæt straks 300 mikroliter HEPES buffer i hver brønd til vask.Vask hver brønd otte gange i alt. Tilsæt 250 mikroliter af streptavidin og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Gentag de otte vaske som tidligere beskrevet.Placer dias på mikroskopet og juster mikroskopets joystick for at fokusere på kammerets overflade. Dette kan nemt gøres ved hjælp af den øgede laser refleksion signal fra glas buffer interface som en guide. I et mikrocentrifugerør tilsættes 10 mikroliter af den fortyndede liposombestand, der indeholder 20 mikromolar total lipid.Overfør 100 mikroliter af buffer fra kammeret til mikrocentrifugerøret, bland korrekt, og overfør de 110 mikroliter tilbage ind i kammeret. Sæt kammeret under mikroskopet og bruge en rudimental mikroskop indstilling i stand til at detektere signal fra liposom fluorophores at observere liposomer bliver immobiliseret på overfladen. Sæt mikroskopet op som beskrevet i manuskriptet.At billedet både DOPE ATTO488 og DOPE ATTO655 fluorophores i liposomer, billede flere kanaler. Sørg for, at hver kanal er afbildet sekventielt for at undgå kryds-excitation. For eksempel, først tage et billede ved spændende på 488 nanometer og læsning emission på 495 til 590 nanometer.Derefter ændre indstillingerne og tage et andet billede ved spændende på 633 nanometer, men læsning emission kun på 660 til 710 nanometer. Analysere. Vælg farve i billedmenuen, og brug funktionen Fletkanal til at oprette en sammensætning af de to kanaler. Overhold, om liposomerne, der er afbildet i to forskellige kanaler, viser god co-lokalisering, eller om der opstod synlig drift.Hvis du vil registrere partikler, skal du åbne plugins-menuen, vælge ComDet og klikke på detekter partikler. I ComDet skal du kontrollere, at indstillingerne er korrekte, og trykke på OK. Efter at have kørt analysen, to popup-vinduer med resultater og resumé viser. Resultattabellen indeholder intensitetsforholdet mellem de to kanaler.Eksportér datatabelresultaterne, der indeholder samde lokaliseringsdataene. Tilpas intensitetsforholdet histogram med en gaussisk funktion og udtrække middelværdi og standardafvigelse. Middel- og standardafvigelsen kan bruges til at beregne graden af inhomogenitet.Forbered en liposom formulering, der er blevet ekstruderet flere gange gennem en 50 nanometer filter. Kalibrer størrelsen af liposomerne ved at sammenligne fluorescensintensiteten med størrelsesdata fra DLS. Med de samme eksperimentelle mikroskopindstillinger som tidligere, billede kalibrering liposomer.Plot en kvadratrod intensitet histogram af fluorescens intensitet af kalibrering liposomer. Sæt histogrammet sammen med en normal fordeling af log og udtrække den gennemsnitlige fluorescensintensitet af kalibrerings liposomer som det geometriske gennemsnit. For at bestemme forholdet mellem kvadratrodsintensiteten og liposomstørrelsen skal korrektionsfaktoren beregnes ved at dividere den gennemsnitlige liposomdiameter, der er opnået fra de dynamiske lyssprændemål, med kvadratrodens geometriske gennemsnit.Beregn kvadratrodsintensitetsværdier for liposomerne i det kompositoriske inhomogenitetseksperiment, og omvend disse to diametre ved at gange med korrektionsfaktoren. Der afbildes intensitetsforholdets værdi som en funktion af diameteren for de kompositoriske inhomogenitetsliposomer og opnår dermed inhomogeniteten som en funktion af liposomstørrelse for en population af liposomer, der spænder fra ca. 50 nanometer til 800 nanometer. I denne protokol, den vellykkede overflade immobilisering af liposomer var umiddelbart synlige ved tilsætning af liposom opløsning til kammeret angivet ved diffraktion begrænset intensitet pletter.Det anbefales at immobilisere nok liposomer til at opnå en tæthed på 300 til 400 liposomer pr ramme. En lavere tæthed gør dataanalysen mere tidskrævende, mens en højere tæthed gør det udfordrende at skelne enkelte liposomer. Hvis hele synsfeltet ikke er i korrekt fokus, kan prøvepladen vippe.Også, hvis liposomer synes store og sløret, dette indikerer buffer i kammeret kan have fordampet og overfladen tørret ud. Intensiteten forholdet histogrammer typisk afslører en Gaussisk fordeling omkring en gennemsnitlig ratio værdi. Hvis der observeres stærke afvigelser fra en gaussisk fordeling, indikerer det et problem med detektionsfølsomhed, der tyder på, at en delmængde liposomer, der viser et svagere signal, er blevet udelukket.Efter montering af intensitetsforholdet histogram med en gaussisk funktion, en grad af inhomogenitet værdi på 0,23 blev oversat til 32% af befolkningen adskiller sig med mere end 23% fra den gennemsnitlige molar forholdet mellem ensemblet. Kvantificeringen af den eksperimentelle usikkerhed blev anset for at være 0,1. Analysen vil aldrig blive bedre end de materialer, du bruger så høj kvalitet unilaminar liposomer er afgørende.Så når du forbereder disse, ikke skære nogen hjørner såsom at udelade fryse-tø cykler. Dårlige billeder vil føre til høj eksperimentel usikkerhed og gøre dig overvurdere inhomogenitet, så tag dig tid til at erhverve gode in-focus billeder. Hvad analysen dybest set gøre, er at studere overfladetætheden af fluorescerende etiket.Hvis denne fluorescerende etiket er på en percolated lipid, så denne analyse kan bruges til kvalitet test liposomer for levering af narkotika. Opsætningen er blevet anvendt til at undersøge, hvordan peptider binder sig til membraner og fornemmer krumningen. Dette har givet forskerne unikke indsigter i de molekylære signaler, der styrer, hvordan peptider er sorteret inde i celler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Kvantitative og Temporal Kontrol af ilt mikromiljø på det indre Islet Level

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Drug-induceret sensibilisering af adenylylcyclase: Assay Strømlining og Minituriasering for Small Molecule og siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modificeret to-foton mikroskop: en ansøgning til sporing af intracellulære vesikler

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Hurtig fluorescensimagografi til molekylær diffusion lov om levende cellemembraner i en kommerciel mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analyserer Blanding Inhomogeniteter i en mikrofluidapparat af Individuel Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Fluorescens Biomembrane Kraft Probe: Samtidig Kvantificering af receptor-ligand Kinetics og Binding-induceret intracellulær signalering på en enkelt celle

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Single Molecule Fluorescens Mikroskopi på Planar Understøttet dobbeltlag

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescens Detection for Droplet Microfluidics Brug af optiske fibre

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Engineering Molekylær Anerkendelse med Bio-mimetiske Polymerer på Single Walled kulstofnanorør

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En Ultrahigh-overførselshastighed mikrofluid Platform for encellede Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...