Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
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Ces travaux ont été financés par le Conseil danois pour la recherche indépendante [accord 5054-00165B].

1. Préparation Liposome
REMARQUE : En bref, la préparation des liposomes comprend habituellement trois étapes cruciales : 1) la préparation des films secs de lipide de la composition désirée de lipide ; 2) réhydratation des lipides pour la formation des liposomes ; et 3) contrôlant la taille et la lamillarité de la population liposome.
<ol><li>Peser les lipides et les dissoudre dans tert-butanol:water (9:1) dans des flacons de verre.<ol>
<li>Dissoudre le POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-g...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+spots:+Complex+phase+behavior+in+simple+membranes.">Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+curved+membranes+recruit+amphipathic+helices+and+protein+anchoring+motifs.">How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs.</a> Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Elizondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+Preparation+Route+on+the+Supramolecular+Organization+of+Lipids+in+a+Vesicular+System.">Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).</li><li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Inhomogeneity+in+the+Lipid+Composition+of+Individual+Nanoscale+Liposomes.">Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li><li>Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+Efficiency+Measured+on+Single+Small+Unilamellar+Vesicles.">Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).</li><li>Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intermediates+in+SNARE-induced+membrane+fusion.">Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).</li><li>Fix, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+membrane+fusion+events+mediated+by+SNARE+proteins.">Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

Il est important de noter que si nous décrivons en détail comment l'analyse des liposomes simples peut être utilisée pour étudier l'inhomogénéité de composition entre les liposomes individuels, la plate-forme est très polyvalente. Comme indiqué précédemment et discuté dans l'introduction, le protocole peut facilement être adapté pour étudier des aspects de la fusion membrane-membrane, des interactions protéine-membrane, ou de la caractérisation liposomique de porteur de drogue. Pour toutes les questions...

Les liposomes sont des vésicules sphériques à base de phospholipides qui sont fortement utilisées à la fois dans la recherche fondamentale et appliquée. Ils fonctionnent comme d'excellents systèmes de modèle membranaire, parce que leurs propriétés physiochimiques peuvent être facilement manipulées en variant les composants lipidiques composant le liposome1,2. En outre, les liposomes constituent le système de nanoporteur de livraison de médicaments le plus utilisé, offrant une pharmacocinétique et une pharmacodynamiie améliorées ainsi qu'une biocompatibilité élevée3.
Pendant de nombreuses années, les liposomes ont principalement été étudiés à l'aide de techniques en vrac, ne donnant accès qu'aux valeurs moyennes de lecture de l'ensemble. Cela a conduit la majorité de ces études à supposer que tous les liposomes de l'ensemble sont identiques. Toutefois, ces valeurs moyennes d'ensemble ne sont correctes que si l'ensemble de données sous-jacent est uniformément réparti autour de la valeur moyenne, mais peut représenter une conclusion fausse et biaisée si l'ensemble de données comprend plusieurs populations indépendantes, par exemple. En outre, en supposant que l'ensemble signifie représenter l'ensemble de la population peut négliger l'information contenue dans l'inhomogénéité entre les liposomes. Ce n'est que récemment que des essais quantitatifs ont émergé qui sont capables de sonder les liposomes simples, révélant de grandes inhomogénéités entre les liposomes individuels en ce qui concerne les propriétés physicochimiques importantes, y compris la taille liposome4, composition lipidique5,6, et l'efficacité de l'encapsulation7, soulignant l'importance d'étudier les liposomes au niveau liposome unique.
Un domaine de recherche où la moyenne d'ensemble des propriétés liposome a été montrée aux résultats de biais est étudiant les interactions de protéine-membrane dépendantes de liposome8,9. Traditionnellement, les chercheurs qui étudient de tels processus ont été limités à la préparation de liposomes avec différents diamètres moyens d'ensemble par extrusion à travers des filtres avec différentes tailles de pores9. Cependant, l'extraction du diamètre des liposomes individuels à l'aide d'essais liposome simples a révélé de grands chevauchements de population, avec des liposomes extrudés utilisant des filtres de 100 nm et 200 nm affichant jusqu'à 70% de chevauchement dans leur distribution de taille4. Ceci pourrait sérieusement biaiser des mesures en vrac des interactions protéine-membrane dépendantes de la taille liposome10. En effectuant les études d'interaction membrane-protéine à l'aide de l'analyse liposome unique, les chercheurs ont plutôt profité de la taille-polydispersity dans l'échantillon, leur permettant d'étudier un large éventail de diamètres de liposome dans chaque expérience, facilitant de nouvelles découvertes de la façon dont la courbure et la composition de membrane peuvent affecter le recrutement de protéine aux membranes4,11,12. Un autre domaine où l'application d'essais liposome simples a prouvé instrumental est dans les études mécanistes de la fusion de membrane protéine-négociée13,14. Pour de telles mesures cinétiques, la capacité d'étudier des événements individuels de fusion a atténué le besoin de synchronisation expérimentale du processus de fusion, permettant de nouvelles perspicacités mécanistes qui auraient autrement été perdues dans la moyenne spatiotemporale faite dans les mesures d'ensemble en vrac. En outre, les liposomes simples ont été employés comme échafaudage de membrane, permettant la mesure des protéines individuelles et offrant de nouvelles connaissances sur la dynamique structurale de protéine transmembrane15,16. En outre, ces configurations à base de protéoliposome ont permis d'étudier la fonction des transporteurs transmembranaires individuels17 et les complexes protéiques de formation de pores18 ainsi que le mécanisme des peptides bioactifs de lamembrane-perméabilisant19. Les liposomes simples ont également été utilisés comme nanofluidiques de matière molle avec des liposomes simples immobilisés de surface servant de chambres pour des réactions enzymatiques dans des volumes de 10-19 L, augmentant le débit et la complexité des essais de criblage avec la consommation minimale de produit20.
Récemment, des essais de liposome simples ont été employés pour caractériser des liposomes d'administration de drogue à un niveau précédemment non-precendented de détail. Les chercheurs ont été en mesure de quantifier des inhomogénéités significatives dans la quantité de polymère attachée à la surface des liposomes individuels21. Les essais de liposome simples ont également permis des mesures des liposomes d'administration de drogue dans les médias complexes, tels que le plasma sanguin, révélant comment les éléments ancrés à la surface de liposome par des ancres de lipide peuvent être susceptibles à la dissociation quand les liposomes sont exposés aux conditions imitant ceux éprouvés pendant la circulation in vivo22. Dans l'ensemble, la polyvalence et l'utilité des essais de liposome unique sont corroborées par la grande variété de problèmes que ces configurations ont été employées pour traiter, et nous prévoyons que la méthodologie continuera d'être développée et de trouver l'utilisation dans de nouveaux domaines scientifiques.
Ici, nous décrivons un test de liposome unique à base de fluorescence qui permet d'étudier les liposomes individuels d'une manière à haut débit (figure 1). Pour illustrer la méthode, nous l'utilisons pour quantifier la taille et l'inhomogénéité de composition entre les liposomes individuels au sein d'un ensemble. L'assay utilise l'imagerie au microscope à fluorescence de liposomes simples immobilisés sur une surface de verre passivated. Nous décrivons d'abord les étapes critiques dans le processus de fabrication de liposome qui assure l'étiquetage fluorescent approprié et l'immobilisation. Ensuite, nous décrivons la préparation de surface nécessaire pour faciliter l'immobilisation de liposome avant d'exposer la procédure pour assurer les densités appropriées de surface de liposome. Nous discutons des paramètres de microscopie importants pour l'acquisition d'images de haute qualité et délinuons comment effectuer l'analyse simple de données, permettant l'extraction de la taille de liposome et de l'inhomogénéité compositionnelle. Ce protocole générique devrait fournir une bonne base pour le chercheur intéressé de développer l'essai plus loin pour son intérêt spécifique de recherche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

La plupart des recherches utilisant des liposomes comme systèmes de modèles membranaires ou porteurs de médicaments s'appuient sur des techniques de lecture en vrac et supposent donc intrinsèquement que tous les liposomes de l'ensemble sont identiques. Cependant, de nouvelles plates-formes expérimentales capables d'observer les liposomes au niveau d'une seule particule ont permis d'effectuer des études très sophistiquées et quantitatives sur les interactions protéines-membranes ou les propriétés des porteurs de médicaments sur des liposomes individuels, évitant ainsi les erreurs de la moyenne d'ensemble. Ici, nous présentons un protocole pour la préparation, la détection et l'analyse de liposomes simples à l'aide d'un test de microscopie à base de fluorescence, facilitant ces mesures à partiilule unique. La configuration permet d'imagerie liposomes individuels d'une manière massive parallèle et est utilisé pour révéler la taille intra-échantillon et les inhomogénéités de composition. En outre, le protocole décrit les avantages de l'étude des liposomes au niveau liposome unique, les limites de l'assay, et les caractéristiques importantes à considérer lors de sa modification pour étudier d'autres questions de recherche.

En suivant le protocole décrit, il est possible d'imager des liposomes uniques d'une manière parallèle massive (figure 1). L'immobilisation réussie de surface des liposomes devrait être immédiatement apparente lors de l'ajout de la solution liposome à la chambre (étape 3.6 dans le protocole) car les taches d'intensité limitée de diffraction devraient apparaître dans l'image(figure 1B et <strong class="...

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A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Ce protocole décrit la fabrication de liposomes et comment ceux-ci peuvent être immobilisés sur une surface et représentés individuellement d'une manière parallèle massive à l'aide de la microscopie fluorescence. Cela permet de quantifier la taille et l'inhomogénéité compositionnelle entre les liposomes simples de la population.

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

La plupart des recherches avec des liposomes reposent sur des techniques audacieuses qui supposent intrinsèquement que tous les liposomes sont identiques. En étudiant les liposomes simples, des inhomogènes significatifs peuvent être observés. La technique liposome unique présentée ici nous permet d’étudier des centaines de liposomes simultanément et de détecter les inhomogènes dans leur taille et leur composition.La méthode peut facilement être ajustée pour étudier d’autres systèmes à un seul niveau de liposome tels que les interactions protéinées membranaires. Tout ce dont vous avez besoin, c’est du composé que vous étudiez pour être étiqueté fluorescentement. Avec cette vidéo, nous fournissons aux chercheurs l’outil sur la façon dont ils peuvent effectuer des études liposome unique.Nous espérons qu’il est clair que l’analyse peut facilement être modifiée pour étudier un éventail d’autres sujets scientifiques. Pour commencer, mélanger les stocks de lipides préparés 138 microlitres de POPC et 120 microlitres de cholestérol dans un flacon de verre frais. Ajoutez ensuite 500 microlitres chacun de deux lipides étiquetés fluorescents et 50 microlitres de DSPE-PEG-biotine.Desserrer le couvercle du flacon de verre et casser le flacon dans de l’azote liquide pendant une à deux minutes. Lyophiliser le mélange de lipides congelés toute la nuit dans un séchoir à congélation. Le matin, ajouter un millilitre de tampon D-sorbitol de 200 millimlaires aux lipides secs.Chauffer le mélange à 45 degrés Celsius et l’exposer à l’agitation magnétique pendant au moins une heure. Congelez ensuite la suspension lipidique en trempant le flacon dans de l’azote liquide et attendez que la suspension soit complètement gelée. Ensuite, trempez la suspension congelée dans un bain chauffant à 55 degrés Celsius jusqu’à ce que le mélange soit complètement décongelé.Exposez le mélange à un total de 11 cycles de gel-dégel. Après cela, à l’aide d’un kit d’extrusion mini, extruder la suspension liposome une fois à travers un filtre en polycarbonate de 800 nanomètres. Mélanger 1 200 microlitres de BSA et 120 microlitres de biotine BSA.Ajouter 300 microlitres du mélange à chaque puits dans une glissade de huit puits et incuber la lame pendant 20 minutes à température ambiante. Inclinez légèrement la glissière et du bord de chaque puits aspirez le milieu. Ajouter immédiatement 300 microlitres de tampon HEPES dans chaque puits pour les laver.Lavez chaque puits huit fois au total. Ajouter 250 microlitres de streptavidine et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Répétez les huit lavages comme décrit précédemment.Placez la lame sur le microscope et ajustez le joystick du microscope pour vous concentrer sur la surface de la chambre. Cela peut facilement être fait en utilisant le signal de réflexion laser accrue de l’interface tampon en verre comme un guide. Dans un tube de microcentrifugeuse, ajouter 10 microlitres du bouillon liposome dilué contenant 20 lipides totaux micromolaires.Transférer 100 microlitres de tampon de la chambre au tube de microcentrifugeuse, mélanger correctement et transférer les 110 microlitres dans la chambre. Mettez la chambre sous le microscope et utilisez un microscope rudimentaire capable de détecter le signal des fluorophores liposome pour observer les liposomes immobilisés à la surface. Installez le microscope tel que décrit dans le manuscrit.Pour image à la fois le DOPE ATTO488 et DOPE ATTO655 fluorophores dans les liposomes, l’image de multiples canaux. Assurez-vous que chaque canal est photographié séquentiellement pour éviter les excitations croisées. Par exemple, prenez d’abord une image en excitant à 488 nanomètres et l’émission de lecture à 495 à 590 nanomètres.Par la suite, changer les paramètres et prendre une autre image en excitant à 633 nanomètres, mais l’émission de lecture seulement à 660 à 710 nanomètres. Analyser. Dans le menu image, choisissez la couleur et utilisez la fonction de canal de fusion pour créer un composite des deux canaux. Observez si les liposomes photographiés dans deux canaux différents affichent une bonne co-localisation ou si la dérive visible s’est produite.Pour détecter les particules, ouvrez le menu plugins, choisissez ComDet et cliquez sur détecter les particules. Dans ComDet, vérifiez que les paramètres sont corrects et appuyez sur OK. Après avoir exécuter l’analyse, deux fenêtres popup avec des résultats et des résumés montrent. Le tableau des résultats contient le rapport d’intensité entre les deux canaux.Exporter les résultats du tableau de données contenant les données de co-localisation. Adapter l’histogramme de rapport d’intensité avec une fonction gaussienne et extraire l’écart moyen et standard. L’écart moyen et type peut être utilisé pour calculer le degré d’inhomogeneity.Préparer une formulation liposome qui a été extrudé plusieurs fois à travers un filtre de 50 nanomètres. Calibrer la taille des liposomes en comparant l’intensité de fluorescence aux données de taille de DLS. Avec les mêmes réglages de microscope expérimental qu’auparavant, imagez les liposomes d’étalonnage.Tracez un histogramme carré d’intensité de racine de l’intensité de fluorescence des liposomes d’étalonnage. Adaptez l’histogramme avec une distribution normale de notation et extrayez l’intensité moyenne de fluorescence des liposomes d’étalonnage comme moyenne géométrique. Pour déterminer la relation entre l’intensité de la racine carrée et la taille liposome, calculer le facteur de correction en divisant le diamètre liposome moyen obtenu à partir des mesures dynamiques de diffusion de la lumière avec la moyenne géométrique de l’intensité de la racine carrée.Calculer les valeurs carrées d’intensité des racines pour les liposomes dans l’expérience d’inhomogeneity compositionnelle et convertir ces deux diamètres en se multipliant avec le facteur de correction. Tracer la valeur du rapport d’intensité en fonction du diamètre pour les liposomes d’inhomogeneity compositionnelle, atteignant ainsi l’inhomogeneity en fonction de la taille liposome pour une population de liposomes s’étendant d’environ 50 nanomètres à 800 nanomètres. Dans ce protocole, l’immobilisation réussie de surface des liposomes était immédiatement apparente sur l’addition de la solution liposome à la chambre indiquée par les taches limitées d’intensité de diffraction.Il est recommandé d’immobiliser suffisamment de liposomes pour atteindre une densité de 300 à 400 liposomes par image. Une densité plus faible rend l’analyse des données plus longue tandis qu’une densité plus élevée rend difficile la distinction des liposomes simples. Si l’ensemble du champ de vision n’est pas au point, la plaque d’échantillonnage peut être inclinée.En outre, si les liposomes semblent grands et flous, cela indique que le tampon dans la chambre pourrait s’être évaporé et la surface asséchée. Les histogrammes de rapport d’intensité révèlent typiquement une distribution gaussienne autour d’une valeur moyenne de rapport. Si de fortes déviations par rapport à une distribution gaussienne sont observées, il indique un problème de sensibilité à la détection suggérant qu’un sous-ensemble de liposomes montrant un signal plus faible ont été exclus.Après ajustement de l’histogramme de rapport d’intensité avec une fonction gaussienne, un degré de valeur d’inhomogeneity de 0.23 a été traduit à 32% de la population différant de plus de 23% du rapport molaire moyen de l’ensemble. La quantification de l’incertitude expérimentale s’est trouvée à 0,1. Le test ne sera jamais mieux que les matériaux que vous utilisez si de haute qualité liposomes unilaminar sont essentiels.Ainsi, lorsque vous les préparez, ne coupez pas les coins ronds tels que laisser de côté les cycles gel-dégel. De mauvaises images entraîneront une grande incertitude expérimentale et vous feront surestimer l’inhomogeneity afin de prendre le temps d’acquérir de bonnes images au point. Ce que l’analyse fait essentiellement est d’étudier la densité de surface de l’étiquette fluorescente.Si cette étiquette fluorescente est sur un lipide percolé, alors cet essai peut être utilisé pour tester la qualité liposomes pour l’administration de médicaments. La configuration a été appliquée pour étudier comment les peptides se lient aux membranes et détectent la courbure. Cela a donné aux chercheurs des idées uniques sur les indices moléculaires qui régissent la façon dont les peptides sont triés à l’intérieur des cellules.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de l&#39;oxygène à l&#39;Islet Plain

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Recherche

Bio-ingénierie

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Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

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Fluorescence Biomembrane la Force Probe: quantification simultanée de Kinetics récepteur-ligand et induits Reliure-signalisation intracellulaire sur une cellule unique

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