Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Dänischen Rat für unabhängige Forschung [Zuschussnummer 5054-00165B] finanziert.

1. Liposomen-Vorbereitung
HINWEIS: Kurz gesagt, die Herstellung von Liposomen umfasst in der Regel drei entscheidende Schritte: 1) Herstellung von trockenen Lipidfilmen der gewünschten Lipidzusammensetzung; 2) Rehydratation der Lipide zur Bildung von Liposomen; und 3) Kontrolle der Größe und Lamellenität der Liposomenpopulation.
<ol><li>Die Lipide abwägen und in tert-butanol:wasser (9:1) in Glasfläschchen auflösen.<ol>
<li>POPC auflösen (1-Palmitoyl-2-Oleoyl-Glycero-3-Phosphocholin; ...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. 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S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Inhomogeneity+in+the+Lipid+Composition+of+Individual+Nanoscale+Liposomes.">Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li><li>Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+Efficiency+Measured+on+Single+Small+Unilamellar+Vesicles.">Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).</li><li>Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

Es ist wichtig zu beachten, dass wir zwar detailliert beschreiben, wie der einzelne Liposomen-Assay verwendet werden kann, um die kompositorische Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen zu untersuchen, die Plattform jedoch sehr vielseitig ist. Wie bereits in der Einleitung gezeigt und diskutiert, kann das Protokoll leicht angepasst werden, um Aspekte der Membran-Membran-Fusion, Protein-Membran-Wechselwirkungen oder liposomalen Wirkstoffträgercharakterisierung zu studieren. Bei allen wissenschaftlichen Fragen, die an...

Liposomen sind sphärische Phospholipid-basierte Vesikel, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Forschung stark verwendet werden. Sie fungieren als ausgezeichnete Membranmodellsysteme, da ihre physiochemischen Eigenschaften leicht durch Variation der Lipidkomponenten, aus denen das Liposomen 1,2besteht, manipuliert werden können. Auch Liposomen bilden das am häufigsten verwendete Nanocarrier-System für die Arzneimittelabgabe und bieten eine verbesserte Pharmakokinetik und Pharmakodynamik sowie eine hohe Biokompatibilität3.
Seit vielen Jahren werden Liposomen hauptsächlich mit Massentechniken untersucht, so dass nur Zugang zu ensembledurchschnittlichen Auslesewerten besteht. Dies hat dazu geführt, dass die meisten dieser Studien davon ausgegangen sind, dass alle Liposomen im Ensemble identisch sind. Solche ensemble-gemittelten Werte sind jedoch nur dann korrekt, wenn das zugrunde liegende Dataset gleichmäßig um den Mittelwert verteilt ist, kann jedoch eine falsche und verzerrte Schlussfolgerung darstellen, wenn das Dataset z. B. mehrere unabhängige Ebenen enthält. Darüber hinaus kann die Annahme, dass das Ensemble die gesamte Bevölkerung repräsentieren soll, die Informationen übersehen, die in der Inhomogenität zwischen Liposomen enthalten sind. Erst vor kurzem sind quantitative Assays aufgetaucht, die in der Lage sind, einzelne Liposomen zu untersuchen, die große Inhomogenitäten zwischen einzelnen Liposomen in Bezug auf wichtige physikalisch-chemische Eigenschaften wie Liposomengröße4,Lipidzusammensetzung5,6und Verkapselungseffizienz7aufdecken, was die Bedeutung der Untersuchung von Liposomen auf der Ebene der einzelnen Liposomen unterstreicht.
Ein Forschungsgebiet, in dem die Ensemble-Mittelung der Liposomen-Eigenschaften gezeigt wurde, um Verzerrungergebnisse zu untersuchen, ist die Untersuchung von Liposomengrößenabhängigen Protein-Membran-Wechselwirkungen8,9. Traditionell beschränkten sich Forscher, die solche Prozesse untersuchen, auf die Herstellung von Liposomen mit unterschiedlichen durchschnittlichen Ensembledurchmessern durch Extrusion durch Filter mit unterschiedlichen Porengrößen9. Die Extraktion des Durchmessers einzelner Liposomen mit einzelnen Liposomen-Assays hat jedoch große Populationsüberlappungen ergeben, wobei Liposomen mit 100 nm und 200 nm Filtern extrudiert werden, die bis zu 70 % überlappen in ihrer Größenverteilung4. Dies könnte Massenmessungen von liposomen größenabhängigen Protein-Membran-Wechselwirkungen stark verzerrt10. Durch die Durchführung der Membran-Protein-Interaktionsstudien mit dem einzigen Liposomen-Assay nutzten die Forscher stattdessen die Größen-Polydispersität innerhalb der Probe, so dass sie eine breite Palette von Liposomendurchmessern in jedem einzelnen Experiment untersuchen konnten, was neue Entdeckungen darüber ermöglichte, wie Membrankrümmung und -zusammensetzung die Proteinrekrutierung an Membranen4,11,12beeinflussen können. Ein weiteres Feld, in dem sich die Anwendung einzelner Liposomen-Assays als instrumentelle Seithers erwiesen hat, ist die mechanistische Entwicklung der proteinvermittelten Membranfusion13,14. Für solche kinetischen Messungen hat die Fähigkeit, einzelne Fusionsereignisse zu untersuchen, die Notwendigkeit einer experimentellen Synchronisation des Fusionsprozesses verringert und neue mechanistische Einsichten ermöglicht, die sonst in der räumzeitlichen Mittelung in Massenensemblemessungen verloren gegangen wären. Zusätzlich wurden einzelne Liposomen als Membrangerüst eingesetzt, das die Messung einzelner Proteine ermöglichte und neue Erkenntnisse über die Transmembranproteinstrukturdynamik15,16. Darüber hinaus ermöglichten solche proteoliposome-basierten Setups die Untersuchung der Funktion einzelner Transmembrantransporter17 und porenbildender Proteinkomplexe18 sowie des Mechanismus bioaktiver membranpermeabilisierender Peptide19. Einzelne Liposomen wurden auch als Weichstoff-Nanofluidik mit oberflächenimmobilisierten Einzelliposomen verwendet, die als Kammern für enzymatische Reaktionen in Volumen von 10-19 L dienten, wodurch der Durchsatz und die Komplexität der Screening-Assays mit minimalem Produktverbrauch20erhöht werden.
Kürzlich wurden einzelne Liposomen-Assays zur Charakterisierung von Wirkstoffabgabe-Liposomen auf einer bisher unvorhergesagten Detaillierungsebene verwendet. Die Forscher konnten signifikante Inhomogenitäten in der Menge an Polymer quantifizieren, die an der Oberfläche einzelner Liposomen befestigt ist21. Die einzelnen Liposomen-Assays erlaubten auch Messungen von Liposomen der Arzneimittelabgabe in komplexen Medien wie Blutplasma, die aufzeigen, wie Elemente, die durch Lipidanker an der Liposomenoberfläche verankert sind, anfällig für Dissoziation sein können, wenn Liposomen Bedingungen ausgesetzt sind, die jene imitieren, die während der in vivo Zirkulation nachgeahmt werden22. Insgesamt werden die Vielseitigkeit und Nützlichkeit der einzelnen Liposomen-Assays durch die große Vielfalt der Probleme belegt, die diese Setups angehen, und wir gehen davon aus, dass die Methodik weiter entwickelt wird und in neuen wissenschaftlichen Bereichen Anwendung findet.
Hier beschreiben wir einen fluoreszenzmikroskopischen Einzelliposomen-Assay, der es ermöglicht, einzelne Liposomen in einer Hochdurchsatz-Manier zu untersuchen (Abbildung 1). Um die Methode zu veranschaulichen, verwenden wir sie, um die Größe und kompositorische Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen innerhalb eines Ensembles zu quantifizieren. Der Test verwendet Fluoreszenzmikroskop-Bildgebung von einzelnen Liposomen, die auf einer passivierten Glasoberfläche immobilisiert sind. Wir beschreiben zunächst die kritischen Schritte im Liposomen-Herstellungsprozess, der eine ordnungsgemäße fluoreszierende Liposomenkennzeichnung und Immobilisierung sicherstellt. Anschließend beschreiben wir die Oberflächenvorbereitung, die erforderlich ist, um die Liposomenimmobilisierung zu erleichtern, bevor wir das Verfahren zur Sicherstellung geeigneter Liposomenoberflächendichten skizzieren. Wir besprechen die Mikroskopieparameter, die für den Erwerb hochwertiger Bilder wichtig sind, und zeigen, wie eine einfache Datenanalyse durchgeführt werden kann, die die Extraktion von Liposomengröße und kompositorische Inhomogenität ermöglicht. Dieses generische Protokoll sollte dem interessierten Forscher eine gute Grundlage bieten, um den Assay für sein spezifisches Forschungsinteresse weiterzuentwickeln.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

Die meisten Forschungen, die Liposomen als Membranmodellsysteme oder Arzneimittelzufuhrträger einsetzen, basieren auf Massenauslesetechniken und gehen daher von einer identischen Liposomen des Ensembles aus. Neue experimentelle Plattformen, die Liposomen auf Einteilchenebene beobachten können, haben es jedoch ermöglicht, hochentwickelte und quantitative Studien über Protein-Membran-Wechselwirkungen oder Wirkstoffträgereigenschaften an einzelnen Liposomen durchzuführen. fehlervermeidung durch Ensemble-Mittelung. Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung, Detektion und Analyse einzelner Liposomen mit hilfe eines fluoreszenzbasierten Mikroskopie-Assays vor, der solche Einzelpartikelmessungen erleichtert. Das Setup ermöglicht die massive parallele Abbildung einzelner Liposomen und wird eingesetzt, um die Größe der Intra-Proben und kompositorische Inhomogenitäten aufzudecken. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die Vorteile der Untersuchung von Liposomen auf der ebene Liposomenebene, die Grenzen des Assays und die wichtigen Merkmale, die bei der Änderung berücksichtigt werden müssen, um andere Forschungsfragen zu untersuchen.

Nach dem beschriebenen Protokoll ist es möglich, einzelne Liposomen massiv parallel abzubilden (Abbildung 1). Die erfolgreiche Oberflächenimmobilisierung von Liposomen sollte sofort bei Zugabe der Liposomenlösung in die Kammer sichtbar sein (Schritt 3.6 im Protokoll), da beugungsbegrenzte Intensitätsflecken im Bild erscheinen sollten (Abbildung 1B und Abbildung 1C</strong...

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A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Liposomen und wie diese auf einer Oberfläche immobilisiert und mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie massiv parallel abgebildet werden können. Dies ermöglicht die Quantifizierung der Größe und der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen der Population.

Ein quantitativer Fluoreszenzmikroskopie-basierter Single Liposome-Assay zum Nachweis der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Die meisten Forschungen mit Liposomen verlassen sich auf kühne Techniken, die intrinsisch davon ausgehen, dass alle Liposomen identisch sind. Durch die Untersuchung einzelner Liposomen können signifikante Inhomogenitäten beobachtet werden. Die hier vorgestellte einzige Liposomentechnik ermöglicht es uns, Hunderte von Liposomen gleichzeitig zu untersuchen und Inhomogenitäten in ihrer Größe und Zusammensetzung zu erkennen.Die Methode kann leicht angepasst werden, um andere Systeme auf einer einzigen Liposomenebene wie Proteinmembran-Wechselwirkungen zu untersuchen. Alles, was Sie brauchen, ist die Verbindung, die Sie studieren, um fluoreszierend gekennzeichnet zu werden. Mit diesem Video stellen wir Forschern das Werkzeug zur Verfügung, wie sie einzelne Liposomenstudien durchführen können.Wir hoffen, dass klar ist, dass der Test leicht geändert werden kann, um eine Reihe anderer wissenschaftlicher Themen zu studieren. Zunächst die vorbereiteten Lipidvorräte 138 Mikroliter POPC und 120 Mikroliter Cholesterin in eine frische Glasdurchstechflasche mischen. Dann fügen Sie 500 Mikroliter von je zwei fluoreszierend markierten Lipiden und 50 Mikroliter DSPE-PEG-Biotin hinzu.Lösen Sie den Deckel der Glasdurchstechflasche und fangen Sie die Durchstechflasche in flüssigem Stickstoff für ein bis zwei Minuten einfrieren. Lyophilisieren Sie die gefrorene Lipidmischung über Nacht in einem Gefriertrockner. Am Morgen einen Milliliter 200 Millimolar D-Sorbitol Puffer zu den trockenen Lipiden hinzufügen.Erhitzen Sie das Gemisch auf 45 Grad Celsius und setzen Sie es mindestens eine Stunde lang dem magnetischen Rühren aus. Dann frieren Sie die Lipidsuspension ein, indem Sie die Durchstechflasche in flüssigen Stickstoff tauchen und warten, bis die Suspension vollständig eingefroren ist. Als nächstes tauchen Sie die gefrorene Suspension in einem Heizbad bei 55 Grad Celsius, bis die Mischung vollständig aufgetaut ist.Setzen Sie die Mischung insgesamt 11 Gefrier-Tau-Zyklen aus. Danach extrudieren Sie die Liposomensuspension mit einem Mini-Extrusionskit einmal durch einen 800 Nanometer Polycarbonatfilter. Mischen Sie 1, 200 Mikroliter BSA und 120 Mikroliter BSA-Biotin.Fügen Sie 300 Mikroliter der Mischung in einem Acht-Well-Dia zu jedem Brunnen und inkubieren Sie die Folie für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Kippen Sie den Schlitten leicht und vom Rand jedes Brunnens das Medium ansaugen. Fügen Sie sofort 300 Mikroliter HEPES Puffer in jeden Brunnen zum Waschen.Waschen Sie jeden Gut insgesamt acht Mal. 250 Mikroliter Streptavidin hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur brüten. Wiederholen Sie die acht Wässer wie zuvor beschrieben.Platzieren Sie das Dia auf dem Mikroskop und passen Sie den Mikroskop-Joystick so an, dass er sich auf die Oberfläche der Kammer konzentriert. Dies kann ganz einfach über das erhöhte Laserreflexionssignal von der Glaspufferschnittstelle als Führung erfolgen. In einem Mikrozentrifugenrohr 10 Mikroliter des verdünnten Liposomenbestands mit 20 mikromolarem Gesamtfett hinzufügen.100 Mikroliter Puffer aus der Kammer in das Mikrozentrifugenrohr geben, richtig mischen und die 110 Mikroliter wieder in die Kammer übertragen. Stellen Sie die Kammer unter das Mikroskop und verwenden Sie eine rudimentale Mikroskopeinstellung, die in der Lage ist, Signale von den Liposomenfluorophoren zu erkennen, um zu beobachten, wie die Liposomen auf der Oberfläche immobilisiert werden. Richten Sie das Mikroskop wie im Manuskript beschrieben ein.Um sowohl die DoPE ATTO488 als auch die DOPE ATTO655 Fluorophore in den Liposomen abzubilden, bilde mehrere Kanäle ab. Stellen Sie sicher, dass jeder Kanal sequenziell abgebildet ist, um eine Quererregung zu vermeiden. Nehmen Sie beispielsweise zuerst ein Bild, indem Sie es mit 488 Nanometern spannend machen und die Emission bei 495 bis 590 Nanometern ablesen.Danach ändern Sie die Einstellungen und nehmen Sie ein anderes Bild, indem Sie mit 633 Nanometern spannend werden, aber die Emission nur bei 660 bis 710 Nanometern ablesen. Analysieren. Wählen Sie im Bildmenü Farbe aus und verwenden Sie die Mergekanalfunktion, um eine Kombination der beiden Kanäle zu erstellen. Beobachten Sie, ob die liposomen, die in zwei verschiedenen Kanälen abgebildet sind, eine gute Kolokalisierung aufweisen oder ob eine sichtbare Drift aufgetreten ist.Um Partikel zu erkennen, öffnen Sie das Plugin-Menü, wählen Sie ComDet und klicken Sie auf Partikel erkennen. Überprüfen Sie in ComDet, ob die Einstellungen korrekt sind, und drücken Sie OK. Nach dem Ausführen der Analyse werden zwei Popupfenster mit Ergebnissen und Zusammenfassung angezeigt. Die Ergebnistabelle enthält das Intensitätsverhältnis zwischen den beiden Kanälen.Exportieren Sie die Ergebnisse der Datentabelle, die die Daten der Kolokalisierung enthalten. Passen Sie das Intensitätsverhältnis Histogramm mit einer Gaußschen Funktion an und extrahieren Sie den Mittelwert und die Standardabweichung. Der Mittelwert und die Standardabweichung können verwendet werden, um den Grad der Inhomogenität zu berechnen.Bereiten Sie eine Liposomenformulierung vor, die mehrmals durch einen 50-Nanometer-Filter extrudiert wurde. Kalibrieren Sie die Größe der Liposomen, indem Sie die Fluoreszenzintensität mit Größendaten von DLS vergleichen. Mit den gleichen experimentellen Mikroskopeinstellungen wie bisher, bilden Sie die Kalibrierungsliposomen.Zeichnen Sie ein Quadratischewurzel-Intensitätshistogramm der Fluoreszenzintensität der Kalibrierliposomen. Passen Sie das Histogramm mit einer Log-Normalverteilung an und extrahieren Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der Kalibrierliposomen als geometrischen Mittelwert. Um die Beziehung zwischen der Quadratwurzelintensität und der Liposomengröße zu bestimmen, berechnen Sie den Korrekturfaktor, indem Sie den durchschnittlichen Liposomendurchmesser, der aus den dynamischen Lichtstreuungsmessungen gewonnen wird, mit dem geometrischen Mittelwert der Quadratwurzelintensität dividieren.Berechnen Sie die Quadratischewurzelintensitätswerte für die Liposomen im Experiment zur kompositorischen Inhomogenität und wandeln Sie diese beiden Durchmesser um, indem Sie sie mit dem Korrekturfaktor multiplizieren. Plotten Sie den Intensitätsverhältniswert als Funktion des Durchmessers für die kompositorischen Inhomogenitätsliposomen und erreichen So die Inhomogenität als Funktion der Liposomengröße für eine Population von Liposomen, die sich von etwa 50 Nanometern bis 800 Nanometern erstreckt. In diesem Protokoll wurde die erfolgreiche Oberflächenimmobilisierung von Liposomen sofort bei Zugabe der Liposomenlösung in die Kammer sichtbar, die durch die beugungsbegrenzten Intensitätsflecken angezeigt wird.Es wird empfohlen, genügend Liposomen zu immobilisieren, um eine Dichte von 300 bis 400 Liposomen pro Rahmen zu erreichen. Eine niedrigere Dichte macht die Datenanalyse zeitaufwändiger, während eine höhere Dichte es schwierig macht, einzelne Liposomen zu unterscheiden. Wenn das gesamte Sichtfeld nicht richtig im Fokus steht, kann die Probenplatte geneigt sein.Auch, wenn die Liposomen groß und verschwommen erscheinen, deutet dies darauf hin, dass der Puffer in der Kammer verdampft und die Oberfläche ausgetrocknet sein könnte. Die Histogramme des Intensitätsverhältnisses zeigen in der Regel eine Gaußsche Verteilung um einen mittleren Verhältniswert. Wenn starke Abweichungen von einer Gaußschen Verteilung beobachtet werden, deutet dies auf ein Erkennungsempfindlichkeitsproblem hin, das darauf hindeutet, dass eine Teilmenge von Liposomen, die ein schwächeres Signal zeigen, ausgeschlossen wurde.Nach Anpassung des Intensitätsverhältnisses Histogramms mit einer Gaußschen Funktion wurde ein Inhomogenitätsgrad von 0,23 zu 32% der Bevölkerung übersetzt, die sich um mehr als 23% vom mittleren Molverhältnis des Ensembles unterscheidet. Die Quantifizierung der experimentellen Unsicherheit ergab 0,1. Der Assay wird nie besser als die Materialien, die Sie verwenden, so hochwertige unilaminare Liposomen sind wichtig.Also, wenn Sie diese vorbereiten, schneiden Sie keine Ecken wie das Auslassen von Frost-Tau-Zyklen. Schlechte Bilder führen zu einer hohen experimentellen Unsicherheit und lassen Sie die Inhomogenität überschätzen, also nehmen Sie sich die Zeit, gute Infokussbilder zu erhalten. Was der Assay im Grunde tut, ist die Oberflächendichte des fluoreszierenden Etiketts zu untersuchen.Wenn dieses fluoreszierende Etikett auf einem perkolierten Lipid ist, dann kann dieser Test verwendet werden, um Liposomen für die Medikamentenabgabe zu testen. Das Setup wurde angewendet, um zu untersuchen, wie Peptide an Membranen binden und die Krümmung spüren. Dies hat Forschern einzigartige Einblicke in die molekularen Hinweise gegeben, die steuern, wie Peptide innerhalb von Zellen sortiert werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Quantitative und zeitliche Steuerung der Sauerstoff-Mikromilieu in der Einzel-Islet Niveau

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Forschung

Biotechnik

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

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