Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי המועצה הדנית למחקר עצמאי [גרנט מספר 5054-00165B].

1. ליפומין הכנה
הערה: בקצרה, הכנת ליפוזומים כוללת בדרך כלל שלושה צעדים קריטיים: 1) הכנת סרטי השומנים היבשים של הרכב השומנים הרצוי; 2) הסבה של השומנים להיווצרות ליפוזומים; ו-3) שליטה על הגודל ועל הליגליות של האוכלוסייה ליפוכמה.
<ol><li>שוקלים את השומנים וממיסים אותם ב tert-butanol: מים (9:1)...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+spots:+Complex+phase+behavior+in+simple+membranes.">Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+curved+membranes+recruit+amphipathic+helices+and+protein+anchoring+motifs.">How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs.</a> Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Elizondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+Preparation+Route+on+the+Supramolecular+Organization+of+Lipids+in+a+Vesicular+System.">Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).</li><li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Inhomogeneity+in+the+Lipid+Composition+of+Individual+Nanoscale+Liposomes.">Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li><li>Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+Efficiency+Measured+on+Single+Small+Unilamellar+Vesicles.">Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).</li><li>Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intermediates+in+SNARE-induced+membrane+fusion.">Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).</li><li>Fix, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+membrane+fusion+events+mediated+by+SNARE+proteins.">Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

חשוב לציין כי בעוד אנו מתארים בפרוטרוט כיצד שיטת ליפוזומים בודדים ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההומוגניות בין ליפוזומים בודדים, הפלטפורמה היא מאוד צדדי. כפי שהוצג בעבר ונדונו במבוא, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם כדי ללמוד היבטים של היתוך קרום קרום, החלבונים-ממברנה האינטראקציות, או ליפוזומ...

ליפוזומים הם שלפוחיות מבוססות פוספוליפיד כדוריים המשמשות בכבדות במחקר בסיסי ומיושם. הם מתפקדים כמו מערכות מודל מעולה ממברנה, מכיוון התכונות הפיזיוכימיות שלהם יכול להיות מניפולציות בקלות על ידי שינוי הרכיבים השומנים המרכיבים את ליפופי1,2. גם, ליפוזומים מהווים את מערכת התרופות משלוח הסמים הנפוץ ביותר, מציע פרמקוקינטיקה משופרת, פרמקודינמיקה, כמו גם גבוהה תאימות3.
במשך שנים רבות, ליפוזומים כבר נחקרו בעיקר באמצעות שיטות בצובר, מתן גישה רק לערכי לקרוא ממוצע ההרכב. זה הוביל את רוב המחקרים האלה כדי להניח כי כל ליפוזומים בהרכב זהים. עם זאת, ערכי הרכב-ממוצעים נכונים רק אם ערכת הנתונים הבסיסית מופצת באופן אחיד סביב הערך הממוצע, אך יכולה לייצג מסקנה שקרית ומשוחדת אם ערכת הנתונים כוללת אוכלוסיות עצמאיות מרובות, לדוגמה. בנוסף, בהנחה כי ההרכב מתכוון לייצג את כל האוכלוסייה יכול להתעלם המידע שעמום בתוך האינגניות בין ליפוזומים. רק לאחרונה יש מספר כמותי התפתחה כי הם מסוגלים לחקור ליפוזומים בודד, חשיפת מיני הומומטר גדול בין ליפוזומים בודדים ביחס למאפיינים הפיזיקליים חשוב כולל ליפופי גודל4, הרכב ליפיד5,6, ו-כימוס יעילות7, הדגשת החשיבות של ליפוזומים ברמת ליפו
אזור מחקר שבו אנסמבל ממוצע של ליפוכמה נכסים הוכח לתוצאות הטיה הוא לומד ליפופי מספר אינטראקציות חלבונים-ממברנה תלויי-גודל8,9. באופן מסורתי, החוקרים לומדים תהליכים כאלה הוגבלה להכנת ליפוזומים עם קטרים שונים הממוצע האנסמבל ידי שחול באמצעות מסננים עם מידות נקבוביות שונות9. עם זאת, לחילוץ הקוטר של ליפוזומים בודדים באמצעות ליפולי בודד כמה בחני חשף האוכלוסייה הגדולה חופפים, עם הבלטת ליפוזומים באמצעות 100 ננומטר ו 200 ננומטר מסננים המציגים עד 70% חופפים בהתפלגות גודלם4. זה יכול באופן חמור הטיה מדידות בצובר של ליפוכמה בגודל תלויי חלבון ממברנה אינטראקציות10. ביצוע לימודי האינטראקציה עם חלבון הממברנה באמצעות ליפובי היחיד, החוקרים במקום ניצל את גודל-פולידידיש בתוך המדגם, ומאפשר להם ללמוד מגוון רחב של ליפופי קטרים בתוך כל ניסוי בודד, הקלה תגליות חדשות של איך עקמומיות ממברנה הרכב יכול להשפיע על גיוס חלבונים לממברנות4,11,12 שדה נוסף שבו היישום של ליפולי בודד כמה בחני יש הוכיחה אינסטרומנטלי הוא במחקרים מכניסטיים של חלבון מתווכת ממברנה פיוז'ן13,14. עבור מדידות קינטית כזו, היכולת ללמוד אירועי היתוך בודדים להקל על הצורך בסנכרון ניסיוני של תהליך היתוך, ומאפשר תובנות מכניסטיות חדשות שאחרת אבדו בחישוב ממוצע הזמן הזמני של הרכב בכמויות גדולות. בנוסף, ליפוזומים בודדים שימשו כפיגום קרום, המאפשר את המדידה של חלבונים בודדים ומציע ידע חדשעל הדינמיקה הקונסטרוקטיבית חלבוןמבנית 15,16. יתר על כן, הגדרות כגון פרוטאוליפוכמה מבוסס מבוססי שאפשרו ללמוד את הפונקציה של מובילים בודדים חלבון טראנסממברנלי17 הנקבוביות מכלולי חלבון מתחמי18 , כמו גם את המנגנון של ביואקטיבית ממברנה החדירות-פפטידים19. ליפוזומים בודדים יש גם בשימוש כמו nanofluiאידיקה של חומר רך עם פני השטח ליפוזומים יחיד לשמש לתאי התגובות אנזימטיות בכרכים של 10-19 L, הגדלת התפוקה והמורכבות של בחני ההקרנה הקרנת המוצר עם צריכת מוצר מינימלי20.
לאחרונה, ליפולי בודד מסוימים שימשו לאפיון ליפוזומים של משלוחי סמים ברמת פירוט בעבר לא מראש. החוקרים היו מסוגלים לכמת משמעותי המגון eities בכמות של פולימר מחובר למשטח של ליפוזומים בודדים21. ליפומים בודדים כמה בחני מותר גם מדידות של ליפוזומים משלוח סמים במדיה מורכבת, כגון פלזמה דם, חשיפת כיצד אלמנטים מעוגן ליפופי כמה משטח באמצעות עוגנים שומנים בדם יכול להיות פגיע לדיסוציאציה כאשר ליפוזומים חשופים לתנאים לחקות אותם מנוסים במהלך vivo מחזור22. בסך הכל, צדדיות והשימושיות של ליפופי בודד מתימוכין על ידי מגוון גדול של בעיות כיוונונים אלה המועסקים לכתובת, ואנו לדמיין כי המתודולוגיה תמשיך להתפתח ולמצוא שימוש בתחומים מדעיים חדשים.
כאן אנו מתארים ליפוכי מיקרוסקופ בודד מבוסס על בסיס אחד מסוים המאפשר ליפוזומים בודדים ללמוד באופן תפוקה גבוהה (איור 1). כדי להמחיש את השיטה, אנו משתמשים בו כדי לכמת את הגודל והסדר הפנימי בין ליפוזומים נפרדים בתוך הרכב. המנה מעסיקה הדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ליפוזומים בודדים מקיבוע על משטח זכוכית פסיבי. אנו מתארים תחילה את השלבים הקריטיים בליפומה תהליך הייצור המבטיח ליפובי פלורסנט מתאים לתיוג ולשתק. לאחר מכן, אנו מתארים את ההכנה לפני השטח הדרוש כדי להקל על היפוטיזציה לפני חלוקת ההליך להבטחת ליפומים מתאימים בצפיפות המשטח. אנו דנים בפרמטרי המיקרוסקופיה החשובים לרכישת תמונות באיכות גבוהה ולתיחום כיצד לבצע ניתוח נתונים פשוט, ולאפשר הוצאה של ליפופי גודל והומוגניות. פרוטוקול גנרי זה אמור לספק בסיס טוב לחוקר המעוניין לפתח את הבדיקה הנוספת לעניין המחקר הספציפי שלו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

רוב המחקרים המעסיקים ליפוזומים כמו מערכות מודל ממברנה או ספקיות משלוח התרופות מסתמך על שיטות קריאה-out בצובר ובכך מיסודה מניח את כל ליפוזומים של ההרכב להיות זהה. עם זאת, פלטפורמות ניסיוני חדש מסוגל להתבונן ליפוזומים ברמת החלקיק היחיד הפכו את האפשרות לבצע מחקרים מתוחכמים ביותר וכמותיים על אינטראקציות חלבונים-קרום או הספק הסמים מאפיינים על ליפוזומים בודדים, וכך הימנעות שגיאות מהרכב בממוצע. כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה, גילוי וניתוח של ליפוזומים בודדים באמצעות שיטת מיקרוסקופ מבוססת-פלואורסצנטית, הקלה על מדידות מסוג יחיד-חלקיק. ההתקנה מאפשרת הדמיה בודדים ליפוזומים בצורה מקבילה מסיבית והוא מועסק כדי לחשוף את הגודל הפנים לדוגמה ומלא הומופאות. בנוסף, הפרוטוקול מתאר את יתרונותיו של הלומדים ליפוזומים ברמה האחת, את מגבלות השיטת העבודה, ואת התכונות החשובות שיש לשקול בעת שינוי אותה כדי ללמוד שאלות מחקר אחרות.

בעקבות הפרוטוקול המתואר מאפשר לדמות ליפוזומים בודדים בצורה מקבילה מסיבית (איור 1). השטח המוצלח של ליפוזומים צריך להיות מיידי בבירור על התוספת של הפתרון ליפופי לחדר (שלב 3.6 בפרוטוקול) כנקודות עקיפה מוגבלת בעוצמה להופיע בתמונה (איור 1B</str...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ליפוזומים וכיצד ניתן להשתמש בקיבוע על פני השטח ולעבור באופן אינדיבידואלי בצורה מקבילה מסיבית תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדבר מאפשר לכמת את הגודל והאחידות בין ליפוזומים בודדים של האוכלוסייה.

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

רוב המחקרים עם ליפוזומים מסתמכים על טכניקות נועזות באופן מהותי בהנחה שכל ליפוזומים זהים. על ידי לימוד ליפוזומים בודדים, ניתן לצפות בהומוגניות משמעותיות. טכניקת ליפוזום יחיד המוצג כאן מאפשרים לנו ללמוד מאות ליפוזומים בו זמנית ולזהות inhomogeneities בגודלם והרכבם.השיטה יכולה בקלות להיות מותאמת ללמוד מערכות אחרות ברמה אחת liposome כגון אינטראקציות קרום חלבון. כל מה שאתה צריך זה את התרכובת שאתה לומד כדי להיות מתויג באופן פלואורסצנטי. עם וידאו זה, אנו מספקים לחוקרים את הכלי על איך הם יכולים לבצע מחקרים ליפוזום יחיד.אנו מקווים כי ברור כי ניתן לשנות בקלות את ההתמדה כדי ללמוד מגוון נושאים מדעיים אחרים. כדי להתחיל, לערבב את מניות השומנים מוכן 138 microliters של POPC ו 120 microliters של כולסטרול בקבוקון זכוכית טרי. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים כל אחד משני שומנים עם תווית פלואורסצנטית ו-50 מיקרוליטרים של DSPE-PEG-ביוטין.משחררים את המכסה של בקבוקון הזכוכית ומקפיאים את הבקבוקון בחנקן נוזלי למשך שעה עד שתי דקות. ליופיליזציה של תערובת השומנים הקפואה לילה במייבש הקפאה. בבוקר, מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ D-סורביטול 200 מילימולר לשומנים היבשים.מחממים את התערובת ל-45 מעלות וחושפים אותה לבחוש מגנטי למשך שעה לפחות. ואז להקפיא את ההשעיה השומנים על ידי טבילת הבקבוקון בחנקן נוזלי ולחכות עד ההשעיה קפואה לחלוטין. לאחר מכן, טובלים את ההשעיה הקפואה באמבט חימום ב 55 מעלות צלזיוס עד התערובת מופשרת לחלוטין.חשוף את התערובת לסך של 11 מחזורי הפשרת הקפאה. לאחר מכן, באמצעות ערכת שולט מיני, להדר את ההשעיה ליפוזום פעם אחת באמצעות מסנן פוליקרבונט 800 ננומטר. יש לערבב 1, 200 מיקרוליטר של BSA ו-120 מיקרוליטר של ביוטין BSA.מוסיפים 300 מיקרוליטרים של התערובת לכל באר במגלשה של שמונה בארות ומדרגים את המגלשה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. להטות מעט את השקופית ומהקצה של כל גם לתומם את המדיום. מיד להוסיף 300 microliters של מאגר HEPES לתוך כל באר לשטוף.לשטוף כל באר שמונה פעמים בסך הכל. מוסיפים 250 מיקרוליטרים של סטרפטבידין ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שמונה שטיפות כפי שתואר קודם לכן.מניחים את השקופית על המיקרוסקופ ומתאימים את מוט ההיגוי של המיקרוסקופ כדי להתמקד על פני השטח של התא. זה יכול להיעשות בקלות באמצעות אות השתקפות לייזר מוגברת מממשק מאגר זכוכית כמדריך. בצינור מיקרוצנטריפוגה, להוסיף 10 microliters של מלאי ליפוזום מדולל המכיל 20 שומנים סך micromolar.מעבירים 100 מיקרוליטרים של חיץ מהתא לצינור המיקרוצנטריפוגה, מערבבים כראוי ומעבירים את 110 המיקרוליטרים בחזרה לתא. שים את התא מתחת למיקרוסקופ ולהשתמש בהגדרת מיקרוסקופ בסיסי המסוגלת לזהות אות מהפלואורופורים של ליפוזום כדי לצפות בליפוזומים משותקים על פני השטח. הגדר את המיקרוסקופ כמתואר בכתב היד.כדי דימוי הן DOPE ATTO488 ו DOPE ATTO655 פלואורופורים בליפוזומים, תמונה ערוצים מרובים. ודא שכל ערוץ תדמיתו בתמונה ברצף כדי למנוע גירוי צולב. לדוגמה, לצלם תחילה תמונה אחת על ידי מרגש ב 488 ננומטר וקריאת פליטה ב 495 כדי 590 ננומטר.לאחר מכן, לשנות את ההגדרות ולקחת תמונה אחרת על ידי מרגש ב 633 ננומטר אבל קריאת פליטה רק ב 660 כדי 710 ננומטר. לנתח. בתפריט תמונה, בחרו צבע ולהשתמש בפונקציית ערוץ המיזוג ליצירת שילוב של שני הערוצים. שים לב אם ליפוזומים בתמונה בשני ערוצים שונים להציג שיתוף לוקליזציה טובה או אם סחף גלוי התרחש.כדי לזהות חלקיקים, פתח את תפריט התוספים, בחר ComDet ולחץ על לזהות חלקיקים. ב- ComDet, ודא שההגדרות נכונות ולחץ על אישור. לאחר הפעלת הניתוח, שני חלונות מוקפצים עם תוצאות ומופע סיכום. טבלת התוצאות מכילה את יחס העוצמה בין שני הערוצים.יצא את תוצאות טבלת הנתונים המכילות את נתוני ההתאמה שלוקליזציה שותף. התאימו את היסטוגרמת יחס העוצמה עם פונקציה גאוסיאנית וחלץ את הממוצע וסטיית התקן. ניתן להשתמש בסטיית הממוצע והסטנדרט כדי לחשב את מידת האנוהוגניות.הכינו ניסוח ליפוזום שהובלט מספר פעמים באמצעות מסנן 50 ננומטר. כייל את גודל ליפוזומים על ידי השוואת עוצמת הפלואורסצנטיות לנתונים בגודל מ- DLS. עם אותן הגדרות מיקרוסקופ ניסיוניות כמו בעבר, תדמיין את ליפוזומי הכיול.התווה היסטוגרמה של עוצמת השורש הריבועי של עוצמת הפלואורסצנטיות של ליפוזומי הכיול. התאם את ההיסטוגרמה עם התפלגות תקינה ביומן וחלץ את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של ליפוזומי הכיול כממוצע הגיאומטרי. כדי לקבוע את הקשר בין עוצמת השורש הריבועי לגודל ליפוזום, חשב את גורם התיקון על-ידי חלוקת קוטר ליפוזום הממוצע המתקבל ממדידות פיזור האור הדינמיות עם הממוצע הגיאומטרי של עוצמת השורש הריבועי.לחשב ערכי עוצמת שורש ריבועי עבור ליפוזומים בניסוי inhomogeneity הרכב ולהמיר שני קטרים אלה על ידי הכפלה עם גורם התיקון. התווה את ערך יחס האינטנסיביות כפונקציה של קוטר עבור ליפוזומים inhomogeneity הרכבה, ובכך להשיג את inhomogeneity כפונקציה של גודל ליפוזום עבור אוכלוסייה של ליפוזומים המשתרעים על כ 50 ננומטר ל 800 ננומטר. בפרוטוקול זה, קיבוע משטח מוצלח של ליפוזומים היה ברור מיד עם תוספת של פתרון ליפוזום לתא שצוין על ידי כתמים בעוצמה מוגבלת דיפוזיה.מומלץ לשתק מספיק ליפוזומים כדי להשיג צפיפות של 300 עד 400 ליפוזומים לכל מסגרת. צפיפות נמוכה יותר הופכת את ניתוח הנתונים לאורך זמן רב יותר בעוד שצפיפות גבוהה יותר הופכת את ההבחנה בין ליפוזומים בודדים למאתגרת יותר. אם כל שדה התצוגה אינו נמצא במוקד הנכון, ייתכן שצלחת הדגימה מוטה.כמו כן, אם ליפוזומים נראים גדולים ומטושטשים, זה מצביע על החיץ בתא אולי התאדה ואת פני השטח התייבש. היסטוגרמות יחס האינטנסיביות חושפות בדרך כלל התפלגות גאוסיאנית סביב ערך יחס ממוצע. אם נצפו סטיות חזקות מהתפלגות גאוסיאנית, הדבר מצביע על בעיית רגישות בזיהוי המצביעה על כך שתת-קבוצה של ליפוזומים המראים אות חלש יותר לא נכללה.לאחר התאמת היסטוגרמה יחס אינטנסיביות עם פונקציה גאוסיאנית, מידה של ערך inhomogeneity של 0.23 תורגם 32% מהאוכלוסייה שונה על ידי יותר מ 23% מן היחס הטוחן הממוצע של ההרכב. כימות אי הוודאות הניסיונית נמצא 0.1. ההתרגם לעולם לא ישתפר יותר מאשר החומרים שאתה משתמש כל כך ליפוזומים יונילמינאריים באיכות גבוהה הם חיוניים.לכן, כאשר אתה מכין את אלה, לא לעגל כל פינות כגון השארת מחזורי הפשרה הקפאה. תמונות גרועות יובילו לאי ודאות ניסיונית גבוהה ו לגרום לך להפיג את inhomogeneity אז לקחת את הזמן כדי לרכוש תמונות טובות בפוקוס. מה שההתמדה בעצם עושה הוא לחקור את צפיפות פני השטח של התווית הפלואורסצנטי.אם תווית פלואורסצנטי זה הוא על שומנים מחורטפים, אז בדיקה זו יכולה לשמש ליפוזומים בדיקת איכות למשלוח סמים. ההתקנה הוחלה כדי ללמוד כיצד פפטידים נקשרים לממברנות ולחוש את העקמומיות. זה נתן לחוקרים תובנות ייחודיות לרמזים המולקולריים השולטים באופן שבו פפטידים ממוינים בתוך תאים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

בקרה כמותי וזמנית של Microenvironment חמצן ברמה יחיד Islet

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

ניתוח inhomogeneity ערבוב במכשיר microfluidic על ידי טכניקת microscale Schlieren

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

הכרה מולקולרית הנדסה עם פולימרים ביו-מימטיים על פחמן Walled יחיד

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...