Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio danese per la ricerca indipendente [numero di sovvenzione 5054-00165B].

1. Preparazione del liposoma
NOTA: In breve, la preparazione dei liposomi di solito comprende tre passaggi cruciali: 1) la preparazione di pellicole lipidiche secche della composizione lipidica desiderata; 2) reidratazione dei lipidi per la formazione di liposomi; e 3) controllando le dimensioni e la lamellarità della popolazione lipososo.
<ol><li>Pesare i lipidi e scioglierli in tert-butanol:acqua (9:1) in fiale di vetro.<ol>
<li>Sciogliere POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholi...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+spots:+Complex+phase+behavior+in+simple+membranes.">Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+curved+membranes+recruit+amphipathic+helices+and+protein+anchoring+motifs.">How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs.</a> Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Elizondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+Preparation+Route+on+the+Supramolecular+Organization+of+Lipids+in+a+Vesicular+System.">Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).</li><li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Inhomogeneity+in+the+Lipid+Composition+of+Individual+Nanoscale+Liposomes.">Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li><li>Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+Efficiency+Measured+on+Single+Small+Unilamellar+Vesicles.">Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).</li><li>Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intermediates+in+SNARE-induced+membrane+fusion.">Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).</li><li>Fix, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+membrane+fusion+events+mediated+by+SNARE+proteins.">Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

È importante notare che mentre descriviamo in dettaglio come il singolo assaggio di liposomi può essere utilizzato per studiare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi, la piattaforma è molto versatile. Come precedentemente mostrato e discusso nell'introduzione, il protocollo può essere facilmente adattato per studiare gli aspetti della fusione membrana-membrana, delle interazioni proteina-membrana o della caratterizzazione del vettore di farmaci liposomici. Per qualsiasi problema scientifico affrontato, i...

I liposomi sono vescicole sferiche a base di fosforelipidi che sono fortemente utilizzati sia nella ricerca di base che in quella applicata. Funzionano come eccellenti sistemi di modelli di membrana, perché le loro proprietà fisiochimiche possono essere facilmente manipolate variando i componenti lipidici che compongono il liposoma1,2. Inoltre, i liposomi costituiscono il sistema di nanocarrier per la consegna di farmaci più utilizzato, offrendo una migliore farmacocinetica e farmacodinamica, nonché un'elevata biocompatibilità3.
Per molti anni, i liposomi sono stati studiati principalmente utilizzando tecniche sfuse, dando solo accesso ai valori medi di lettura dell'ensemble. Questo ha portato la maggior parte di questi studi ad assumere che tutti i liposomi nell'ensemble siano identici. Tuttavia, tali valori mediati nell'insieme sono corretti solo se il set di dati sottostante viene distribuito uniformemente intorno al valore medio, ma può rappresentare una conclusione falsa e distorta se il set di dati include più popolazioni indipendenti, ad esempio. Inoltre, supponendo che l'insieme significhi rappresentare l'intera popolazione può trascurare le informazioni contenute all'interno dell'omogeneità tra i liposomi. Solo di recente sono emersi saggi quantitativi che sono in grado di sondare singoli liposomi, rivelando grandi inomogeneità tra i singoli liposomi rispetto a importanti proprietà fisiologiche tra cui la dimensione liposomica4, la composizione dei lipidi5,6, e l'efficienza di incapsulamento7,evidenziando l'importanza di studiare i liposomi a livello singolo liposoma.
Un'area di ricerca in cui è stato dimostrato che l'insieme delle proprietà del liposoma è stato mostrato come bias sta studiando le interazioni liposomidi-proteina-membrana dipendenti dalle dimensioni8,9. Tradizionalmente, i ricercatori che studiano tali processi sono stati limitati alla preparazione di liposomi con diversi diametri medi di insieme per estrusione attraverso filtri con diverse dimensioni dei pori9. Tuttavia, l'estrazione del diametro dei singoli liposomi utilizzando singoli saggi liposomi ha rivelato grandi sovrapposizioni di popolazione, con liposomi estrusa utilizzando 100 nm e 200 nm che mostrano fino al 70% di sovrapposizione nella loro distribuzione di dimensioni4. Questo potrebbe pendizzare gravemente le misurazioni di massa delle interazioni liposomiche tra dimensioni e membranadipendenti da 10. Eseguendo gli studi di interazione membrana-proteina utilizzando il singolo saggio liposoma, i ricercatori hanno invece approfittato della dimensione-polidispersità all'interno del campione, permettendo loro di studiare una vasta gamma di diametri liposomici all'interno di ogni singolo esperimento, facilitando nuove scoperte di come la curvatura e la composizione possono influenzare il reclutamento di proteine alle membrane4,11,12. Un altro campo in cui l'applicazione di saggi a singolo liposomasi si è dimostrata strumentale è negli studi meccanicistici di fusione della membrana mediata da proteine13,14. Per tali misurazioni cinetiche, la capacità di studiare singoli eventi di fusione ha alleviato la necessità di sincronizzazione sperimentale del processo di fusione, consentendo nuove intuizioni meccanicistiche che altrimenti sarebbero andate perse nella media spaziotemporale effettuata nelle misurazioni di massa dell'ensemble. Inoltre, singoli liposomi sono stati utilizzati come scaffold a membrana, consentendo la misurazione di singole proteine e offrendo nuove conoscenze sulla dinamica strutturale delle proteine transmembrane15,16. Inoltre, tali configurazioni a base di proteoliposomi hanno permesso di studiare la funzione dei singoli trasportatori transmembrana17 e dei complessi proteici che formano i pori18, nonché il meccanismo dei peptidi bioattivi a membrana-permeabilizzante19. Liposomi singoli sono stati utilizzati anche come nanofluidica a materia morbida con liposomi singoli immobilizzati sulla superficie che servono come camere per reazioni enzimatiche in volumi di 10-19 L, aumentando la produttività e la complessità dei saggi di screening con un consumo minimo di prodotto20.
Recentemente, sono stati utilizzati saggi a singolo liposomale per caratterizzare i liposomi per la somministrazione di farmaci a un livello di dettaglio precedentemente senza precedenti. I ricercatori sono stati in grado di quantificare significative inomogeneità nella quantità di polimero attaccato alla superficie dei singoli liposomi21. I singoli saggi liposomi consentiti anche misure di liposomi di emissione di farmaci in supporti complessi, come il plasma sanguigno, rivelando come gli elementi ancorati alla superficie liposomica attraverso ancore lipidici possono essere suscettibili alla dissociazione quando i liposomi sono esposti a condizioni che imitano quelli sperimentati durante la circolazione in vivo22. Nel complesso, la versatilità e l'utilità dei saggi singoli liposomi sono corroborate dalla grande varietà di problemi che questi allestimenti sono stati impiegati per affrontare, e inviamo che la metodologia continuerà ad essere sviluppata e a fare uso in nuovi campi scientifici.
Qui descriviamo un saggio a singolo liposoma a base di microscopia a fluorescenza che consente di studiare i singoli liposomi in modo ad alto velocità effettiva (Figura 1). Per illustrare il metodo, lo usiamo per quantificare le dimensioni e l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi all'interno di un ensemble. Il saggio utilizza l'imaging al microscopio a fluorescenza di singoli liposomi immobilizzati su una superficie di vetro passiva. Descriviamo innanzitutto i passaggi critici del processo di fabbricazione del liposoma che garantisce una corretta etichettatura e immobilizzazione fluorescente. Quindi, descriviamo la preparazione della superficie necessaria per facilitare l'immobilizzazione liposomale prima di delineare la procedura per garantire densità di superficie liposomiche appropriate. Discutiamo i parametri di microscopia importanti per l'acquisizione di immagini di alta qualità e delineamo come eseguire semplici analisi dei dati, consentendo l'estrazione delle dimensioni liposomiche e l'inomogeneità compositiva. Questo protocollo generico dovrebbe fornire una buona base per il ricercatore interessato per sviluppare ulteriormente il saggio per il suo specifico interesse per la ricerca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

La maggior parte delle ricerche che impiegano liposomi come sistemi modello di membrana o portatori di somministrazione di farmaci si basa su tecniche di lettura alla rinfusa e quindi presuppone intrinsecamente che tutti i liposomi dell'ensemble siano identici. Tuttavia, nuove piattaforme sperimentali in grado di osservare i liposomi a livello di particelle singole hanno permesso di eseguire studi altamente sofisticati e quantitativi sulle interazioni proteina-membrana o sulle proprietà dei portatori di farmaci sui singoli liposomi, evitando così gli errori dalla media dell'insieme. Qui presentiamo un protocollo per la preparazione, il rilevamento e l'analisi di singoli liposomi usando un analisi di microscopia basata sulla fluorescenza, facilitando tali misurazioni di particelle singole. L'impostazione consente di imaging singoli liposomi in modo massiccio parallelo e viene impiegato per rivelare le dimensioni intra-campione e le inomogeneità compositive. Inoltre, il protocollo descrive i vantaggi dello studio dei liposomi a livello singolo di liposoma, i limiti del saggio e le caratteristiche importanti da considerare quando lo si modifica per studiare altre domande di ricerca.

Seguendo il protocollo descritto è possibile l'immagine di singoli liposomi in modo parallelo massiccio (Figura 1). Il successo dell'immobilizzazione superficiale dei liposomi dovrebbe essere immediatamente evidente dopo l'aggiunta della soluzione liposomica alla camera (passaggio 3.6 nel protocollo) come diffrazione punti di intensità limitata dovrebbero apparire nell'immagine (Figura 1B e <strong class="xfig"...

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A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Questo protocollo descrive la fabbricazione di liposomi e come questi possono essere immobilizzati su una superficie e immagine individualmente in modo parallelo massiccio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciò consente la quantificazione delle dimensioni e dell'inomogeneità compositiva tra singoli liposomi della popolazione.

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

La maggior parte delle ricerche con liposomi si basa su tecniche audaci che assumono intrinsecamente tutti i liposomi come identici. Studiando singoli liposomi, si possono osservare disomogeneità significative. La singola tecnica liposoma qui presentata ci consente di studiare centinaia di liposomi contemporaneamente e rilevare le disomogeneità nelle loro dimensioni e composizione.Il metodo può essere facilmente regolato per studiare altri sistemi a un singolo livello liposoma come le interazioni con le membrane proteiche. Tutto ciò di cui hai bisogno è il composto che studi per essere etichettato fluorescentmente. Con questo video, forniamo ai ricercatori lo strumento su come possono eseguire singoli studi liposomi.Speriamo che sia chiaro che il saggio può essere facilmente modificato per studiare una serie di altri argomenti scientifici. Per iniziare, mescolare le scorte lipidiche preparate 138 microlitri di POPC e 120 microlitri di colesterolo in una fiala di vetro fresco. Quindi aggiungere 500 microlitri ciascuno dei due lipidi etichettati fluorescentmente e 50 microlitri di DSPE-PEG-biotina.Allentare il coperchio del flaconcino di vetro e congelare il flaconcino in azoto liquido per uno o due minuti. Liofilizzare la miscela lipidica congelata durante la notte in un essiccatore di congelamento. Al mattino, aggiungere un millilitro di tampone D-sorbitolo da 200 millimolare ai lipidi secchi.Riscaldare la miscela a 45 gradi Celsius ed esporla all'agitazione magnetica per almeno un'ora. Quindi congelare la sospensione lipidica immergere il flaconcino in azoto liquido e attendere che la sospensione sia completamente congelata. Successivamente, immergere la sospensione congelata in un bagno di riscaldamento a 55 gradi Celsius fino a quando la miscela non viene completamente scongelata.Esporre la miscela a un totale di 11 cicli di congelamento-scongelamento. Successivamente, utilizzando un mini kit di estrusione, estrudere la sospensione liposoma una volta attraverso un filtro in policarbonato da 800 nanometri. Mescolare 1.200 microlitri di BSA e 120 microlitri di biotina BSA.Aggiungere 300 microlitri della miscela ad ogni pozzo in uno scivolo da otto porri e incubare lo scivolo per 20 minuti a temperatura ambiente. Inclinare leggermente lo scivolo e dal bordo di ogni pozzo aspirare il mezzo. Aggiungere immediatamente 300 microlitri di tampone HEPES in ogni pozzo da lavare.Lavare ogni bene otto volte in totale. Aggiungere 250 microlitri di streptavidina e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Ripetere gli otto lavaggi come descritto in precedenza.Posizionare la diapositiva al microscopio e regolare il joystick del microscopio per concentrarsi sulla superficie della camera. Questo può essere facilmente fatto utilizzando l'aumento del segnale di riflessione laser dall'interfaccia del buffer di vetro come guida. In un tubo di microcentrifugo, aggiungere 10 microlitri del materiale liposoma diluito contenente 20 lipidi totali micromolari.Trasferire 100 microlitri di tampone dalla camera al tubo di microcentrifugo, mescolare correttamente e trasferire i 110 microlitri nella camera. Mettere la camera al microscopio e utilizzare un microscopio rudimentale in grado di rilevare il segnale dai fluorofori liposomi per osservare i liposomi immobilizzati sulla superficie. Impostare il microscopio come descritto nel manoscritto.Per l'immagine dei fluorofori DOPE ATTO488 e DOPE ATTO655 nei liposomi, immagini più canali. Assicurarsi che ogni canale sia stato immaginato in sequenza per evitare l'eccitazione incrociata. Ad esempio, prima scatta un'immagine eccitanti a 488 nanometri e leggendo l'emissione a 495-590 nanometri.Successivamente, cambia le impostazioni e scatta un'altra immagine eccitanti a 633 nanometri ma leggendo l'emissione solo a 660-710 nanometri. Analizzare. Nel menu immagine, scegliete il colore e usate la funzione del canale unione per creare un composito dei due canali. Osservare se i liposomi visualizzati in due canali diversi mostrano una buona co-localizzazione o se si è verificata una deriva visibile.Per rilevare le particelle, aprite il menu plugin, scegliete ComDet e fate clic su rileva particelle. In ComDet verificare che le impostazioni siano corrette e premere OK. Dopo aver eseguono l'analisi, vengono visualizzate due finestre popup con risultati e riepilogo. La tabella dei risultati contiene il rapporto di intensità tra i due canali.Esportare i risultati della tabella dati contenente i dati di co-localizzazione. Adattare l'istogramma del rapporto di intensità con una funzione gaussiana ed estrarre la deviazione media e standard. La deviazione media e standard può essere utilizzata per calcolare il grado di disomogeneità.Preparare una formulazione liposoma che è stata estrusa più volte attraverso un filtro da 50 nanometri. Calibrare le dimensioni dei liposomi confrontando l'intensità della fluorescenza con i dati sulle dimensioni di DLS. Con le stesse impostazioni sperimentali del microscopio di prima, immagini i liposomi di calibrazione.Tracciare un istogramma a intensità della radice quadrata dell'intensità di fluorescenza dei liposomi di calibrazione. Montare l'istogramma con una distribuzione normale del log ed estrarre l'intensità media di fluorescenza dei liposomi di calibrazione come media geometrica. Per determinare la relazione tra l'intensità della radice quadrata e la dimensione liposoma, calcolare il fattore di correzione dividendo il diametro liposoma medio ottenuto dalle misure dinamiche di scattering della luce con la media geometrica dell'intensità della radice quadrata.Calcolare i valori di intensità della radice quadrata per i liposomi nell'esperimento di disomogeneità compositiva e convertire questi due diametri moltiplicandosi con il fattore di correzione. Tracciare il valore del rapporto di intensità in funzione del diametro per i liposomi di disomogeneità compositiva, ottenendo così l'inomogenezza in funzione delle dimensioni liposomiche per una popolazione di liposomi che vanno da circa 50 nanometri a 800 nanometri. In questo protocollo, il successo dell'immobilizzazione superficiale dei liposomi è stato immediatamente evidente dopo l'aggiunta della soluzione liposoma alla camera indicata dalle macchie di intensità limitata di diffrazione.Si consiglia di immobilizzare abbastanza liposomi per ottenere una densità da 300 a 400 liposomi per fotogramma. Una densità inferiore rende l'analisi dei dati più dispendiosa in termini di tempo, mentre una densità più elevata rende difficile distinguere singoli liposomi. Se l'intero campo visivo non è a fuoco corretto, la piastra campione potrebbe inclinarsi.Inoltre, se i liposomi sembrano grandi e sfocati, questo indica che il tampone nella camera potrebbe essere evaporato e la superficie asciugata. Gli istogrammi del rapporto di intensità in genere rivelano una distribuzione gaussiana attorno a un valore del rapporto medio. Se si osservano forti deviazioni da una distribuzione gaussiana, indica un problema di sensibilità di rilevamento che suggerisce che un sottoinsieme di liposomi che mostrano un segnale più debole sono stati esclusi.Dopo aver adeguato l'istogramma del rapporto di intensità con una funzione gaussiana, un grado di disomogeneità di 0,23 è stato tradotto al 32% della popolazione che differisco di oltre il 23% dal rapporto molare medio dell'insieme. La quantificazione dell'incertezza sperimentale è stata 0.1. Il test non migliorerà mai dei materiali che usi, quindi i liposomi unilaminari di alta qualità sono essenziali.Quindi, quando li prepari, non tagliare angoli come lasciare fuori i cicli di congelamento-scongelamento. Immagini scadenti porteranno a un'elevata incertezza sperimentale e ti faranno sopravvalutare l'disomogeneità, quindi prenditi il tempo per acquisire buone immagini in-focus. Quello che il saggio fondamentalmente fa è studiare la densità superficiale dell'etichetta fluorescente.Se questa etichetta fluorescente è su un lipide percolato, questo test può essere utilizzato per testare di qualità i liposomi per la somministrazione di farmaci. La configurazione è stata applicata per studiare come i peptidi si legano alle membrane e percepiscano la curvatura. Questo ha dato ai ricercatori intuizioni uniche sui segnali molecolari che governano come i peptidi sono ordinati all'interno delle cellule.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Controllo quantitativo e temporale di ossigeno Microenvironment al Islet Single Level

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Ricerca

Bioingegneria

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: L&#39;ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analizzando disomogeneità Mescolando in un dispositivo a microfluidi da Tecnica microscala Schlieren

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Ingegneria riconoscimento molecolare con polimeri bio-mimetici sui singoli Walled nanotubi di carbonio

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...