Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
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이 작품은 독립적 인 연구를위한 덴마크위원회에 의해 투자되었다 [보조금 번호 5054-00165B].

1. 리포솜 준비
참고 : 간단히, 리포솜의 준비는 일반적으로 세 가지 중요한 단계를 포함 : 1) 원하는 지질 조성물의 건조 지질 필름의 준비; 2) 리포좀 형성을위한 지질의 재수화; 및 3) 리포좀 인구의 크기와 라멜라성을 조절한다.
<ol><li>지질을 측정하고 테르-부탄올:물(9:1)에 유리 병에 녹입니다.<ol>
<li>용해 POPC (1-팔미토일-2-올레오일 글리세로-3-포스포콜린; MW = 760 g/mol) ~ 50mM.<...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+spots:+Complex+phase+behavior+in+simple+membranes.">Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+curved+membranes+recruit+amphipathic+helices+and+protein+anchoring+motifs.">How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs.</a> Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Elizondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+Preparation+Route+on+the+Supramolecular+Organization+of+Lipids+in+a+Vesicular+System.">Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).</li><li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Inhomogeneity+in+the+Lipid+Composition+of+Individual+Nanoscale+Liposomes.">Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li><li>Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+Efficiency+Measured+on+Single+Small+Unilamellar+Vesicles.">Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).</li><li>Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intermediates+in+SNARE-induced+membrane+fusion.">Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).</li><li>Fix, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+membrane+fusion+events+mediated+by+SNARE+proteins.">Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

우리는 단일 리포솜 분석이 개별 리포좀 사이의 조성 불균질성을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 자세히 설명하지만 플랫폼은 매우 다재다능하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이전에 소개에서 도시되고 논의된 바와 같이, 프로토콜은 막-막 융합, 단백질 막 상호 작용, 또는 리포좀 약물 담체 특성화의 양상을 연구하기 위해 용이하게 적응될 수 있다. 해결되는 모든 과학적 질문에 대?...

리포솜은 기초와 응용 연구 에서 둘 다 무겁게 이용되는 구형 인지질 기지를 둔 소포입니다. 이들은 우수한 멤브레인 모델 시스템으로 기능하며, 이들의 생리화학적 특성은 리포좀1,2를구성하는 지질 성분을 변화시킴으로써 쉽게 조작될 수 있기 때문이다. 또한, 리포솜은 향상된 약동학 및 약력학뿐만 아니라 높은 생체 적합성3을제공하는 가장 많이 사용되는 약물 전달 나노 캐리어 시스템을 구성합니다.
몇 년 동안, 리포솜은 주로 대량 기술을 사용하여 연구되어 앙상블 평균 판독 값에만 액세스 할 수 있습니다. 이것은 앙상블에 있는 모든 리포좀이 동일하다는 것을 가정하기 위하여 이 연구 결과의 대다수를 지도했습니다. 그러나 이러한 앙상블 평균 값은 기본 데이터 집합이 평균 값 주위에 균일하게 분포되어 있는 경우에만 정확하지만 데이터 집합에 여러 독립 모집단이 포함된 경우 거짓및 편향된 결론을 나타낼 수 있습니다. 또한, 전체 인구를 나타내는 앙상블 의미를 가정하면 리포솜 사이의 불균질성 내에 있는 정보를 간과할 수 있다. 최근에는 단일 리포좀을 조사할 수 있는 정량적 분석이 등장하여, 리포좀 크기4,지질조성5,6,및 캡슐화 효율7을포함한 중요한 물리화학적 특성에 대하여 개별 리포좀 들 사이의 큰 불균질성을 드러내며, 단일 리포좀 수준에서 리포좀을 연구하는 것의 중요성을 강조하고 있다.
리포솜 성질의 앙상블 평균화가 편향된 결과로 나타난 연구 영역은 리포솜 크기 의존성 단백질 막 상호작용을 연구하고있다8,9. 전통적으로, 이러한 과정을 연구하는 연구원은 다른 기공 크기9필터를통해 압출에 의해 다른 앙상블 평균 직경리포솜을 준비하는 것으로 제한되었습니다. 그러나, 단일 리포좀 어세스를 사용하여 개별 리포좀의 직경을 추출하는 것은 큰 인구 중복을 밝혀, 리포솜을 사용하여 압출 100 nm 및 200 nm 필터는 그들의 크기 분포에 70% 중첩까지 표시4. 이것은 리포솜 크기 의존성 단백질 막 상호작용10의대량 측정을 심각하게 편향시킬 수 있었다. 단일 리포솜 분석법을 사용하여 막 단백질 상호 작용 연구를 수행, 연구원은 대신 샘플 내에서 크기 다분산성을 활용, 각 단일 실험 내에서 리포좀 직경의 넓은 범위를 연구 할 수 있도록, 막 곡률과 조성이 막에 단백질 모집에 영향을 미칠 수있는 방법의 새로운 발견을 촉진4,11,12. 단일 리포솜 분석에 의한 또 다른 분야는 단백질 매개 막융합13,14의기계적 연구에 있다. 이러한 운동 측정의 경우 개별 융합 이벤트를 연구하는 능력은 융합 프로세스의 실험 적 동기화의 필요성을 완화하여 대량 앙상블 측정에서 수행되는 주공간 평균화에서 손실되었을 새로운 기계적 통찰력을 허용했습니다. 추가적으로, 단 하나 리포솜은 개별 적인 단백질의 측정을 허용하고 막 단백질 구조 역학15,16에새로운 지식을 제안하는 막 스캐폴드로 이용되었습니다. 더욱이, 이러한 프로테올리포좀 기반 설정은 개별 막 트랜스멤브레인수송기(17) 및 모공 형성 단백질복합체(18)의 기능뿐만 아니라 생리활성막-투과펩타이드(19)의 기전을 연구하는 것을 가능하게 하였다. 단일 리포솜은 또한10-19 L의 부피에서 효소 반응을 위한 챔버로서 사용되는 표면 고정된 단일 리포솜을 가진 연질 나노유체학으로서 사용되어 왔으며, 최소한의 제품소비로스크리닝 검거및 복잡성을 증가시키고 있다.
최근, 단일 리포솜 검사에서는 이전에 는 미리 정연하지 않은 수준의 세부 사항에서 약물 전달 리포좀을 특성화하는 데 사용되었습니다. 연구자들은 개별리포좀(21)의표면에 부착된 중합체의 양에서 유의한 불균질성을 정량화할 수 있었다. 단일 리포좀 검사는 또한 혈장과 같은 복합 매체에서 약물 전달 리포좀의 측정을 허용하고, 지질 앵커를 통해 리포좀 표면에 고정된 원소가 생체 내 순환 중에 경험한 조건을 모방하는 조건에 노출될 때 해리에 취약할 수 있는 방법을밝혀냅니다 22. 전반적으로, 단일 리포솜 assays의 다양성과 유용성은 이 설치가 해결하기 위하여 채택된 문제의 큰 다양성에 의해 입증되고, 우리는 방법론이 새로운 과학적인 필드에서 계속 개발되고 사용을 찾아내려고 구상합니다.
여기에서 우리는 개별 리포솜이 높은 처리량 방식으로 공부될 수 있도록 하는 형광 현미경 계 단 하나 리포좀 분석법을 기술합니다(그림 1). 이 방법을 설명하기 위해, 우리는 앙상블 내에서 개별 리포좀 사이의 크기와 조성 불균질성을 정량화하는 데 사용합니다. 이 분석은 통과 유리 표면에 고정된 단일 리포좀의 형광 현미경 이미징을 사용합니다. 우리는 먼저 적절한 형광 리포솜 라벨링 및 고정을 보장하는 리포솜 제조 공정의 중요한 단계를 설명합니다. 그런 다음, 적절한 리포솜 표면 밀도를 보장하기 위한 절차를 개략적으로 설명하기 전에 리포솜 고정을 용이하게 하는 데 필요한 표면 준비를 설명합니다. 우리는 고품질의 이미지를 획득하는 데 중요한 현미경 매개 변수에 대해 논의하고 간단한 데이터 분석을 수행하는 방법을 설명하여 리포솜 크기와 조성 불균질성을 추출 할 수 있습니다. 이 일반적인 프로토콜은 관심 있는 연구원이 그 또는 그녀의 특정 연구 관심사를 위한 분석학을 더 개발하기 위한 좋은 기초를 제공해야 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

막 모형 시스템 또는 약 납품 운반대로 리포솜을 채택하는 대부분의 연구는 대량 판독 기술에 의존하고 따라서 본질적으로 앙상블의 모든 리포솜이 동일하다고 가정합니다. 그러나 단일 입자 수준에서 리포솜을 관찰할 수 있는 새로운 실험 플랫폼은 개별 리포좀에 대한 단백질 막 상호 작용 또는 약물 담체 특성에 대한 매우 정교하고 정량적인 연구를 수행할 수 있게 해 주었으며, 따라서 앙상블 평균에서 오류를 방지. 여기에서 우리는 형광 기지를 둔 현미경 분석법을 사용하여 단 하나 리포좀을 준비, 검출 및 분석하기 위한 프로토콜을 제시하고, 그 같은 단 하나 입자 측정을 촉진하. 이 설정은 개별 리포솜을 대규모 병렬 방식으로 이미징할 수 있게 하며 샘플 내 크기와 조성 불균질성을 드러내기 위해 사용됩니다. 추가적으로, 프로토콜은 단 하나 리포솜 수준에서 리포솜 공부의 이점, 분석결과의 한계 및 그밖 연구 질문을 공부하기 위하여 그것을 수정할 때 고려될 중요한 특징을 기술합니다.

기재된 프로토콜에 따라 단일 리포솜을 대규모 병렬 방식으로 이미지화할 수 있게한다(도 1). 리포좀의 성공적인 표면 고정은 회절 제한된 강도 반점이 이미지에 나타나야함에 따라 챔버(프로토콜에서 3.6단계)에 리포좀 용액을 첨가한 즉시 명백해야한다(도 1B 및 도 1C).
<p class=...

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A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

리포솜을 가진 대부분의 연구는 모든 리포솜이 동일하다고 본질적으로 가정하는 대담한 기술에 의존합니다. 단일 리포솜을 연구함으로써, 중요한 불동성을 관찰할 수 있습니다. 여기에 제시된 단 하나 liposome 기술은 우리가 동시에 리포솜의 수백을 공부하고 그들의 규모 및 조성에 있는 불균일성을 검출하는 것을 허용합니다.이 방법은 단백질 막 상호 작용과 같은 단일 리포솜 수준에서 다른 시스템을 연구하도록 쉽게 조정할 수 있다. 당신이 필요로하는 것은 형광으로 표시될 연구 화합물입니다. 이 비디오를 통해 연구원들에게 단일 리포솜 연구를 수행하는 방법에 대한 도구를 제공합니다.우리는 분석이 다른 과학적 주제의 범위를 연구하기 위해 쉽게 수정 할 수 있다는 것이 분명하기를 바랍니다. 시작하려면 준비된 지질 주 138마이크로리터의 POPC와 120마이크로리터의 콜레스테롤을 신선한 유리 유리 바이알에 섞는다. 그런 다음 형광으로 표시된 지질 2개와 DSPE-PEG-비오틴 50마이크로리터 각각 500마이크로리터를 추가합니다.유리 유리 병의 뚜껑을 느슨하게하고 1 ~ 2 분 동안 액체 질소에서 유리병을 고정 스냅. 냉동 건조기에서 하룻밤 동안 냉동 지질 혼합물을 lyophilize합니다. 아침에는 200 밀리미터 D-소르비톨 버퍼를 마른 지질에 1밀리리터를 넣습니다.혼합물을 섭씨 45도로 가열하고 적어도 한 시간 동안 자기 교반에 노출시십시오. 그런 다음 유리병을 액체 질소에 담그고 현탁액이 완전히 얼어 붙을 때까지 기다립니다. 다음으로, 혼합물이 완전히 해동 될 때까지 냉동 서스펜션을 섭씨 55도에서 가열 욕조에 담급니다.혼합물을 총 11개의 동결 해동 사이클에 노출시다. 그 후, 미니 압출 키트를 사용하여, 800 나노 미터 폴리 카보네이트 필터를 통해 한 번 리포솜 현탁액을 돌출. BSA의 1, 200 마이크로리터와 120 마이크로리터의 BSA 비오틴을 혼합합니다.8웰 슬라이드에 혼합물 300 마이크로리터를 각 웰에 넣고 실온에서 20분 동안 슬라이드를 배양합니다. 슬라이드를 약간 기울이고 각 가장자리에서 배지를 흡인합니다. 즉시 세척각 웰에 HEPES 버퍼 300 마이크로리터를 추가합니다.총 8회 잘 씻으시면 됩니다. 250 마이크로리터의 스트렙타비딘을 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 이전에 설명한 대로 8개의 세서히를 반복합니다.현미경에 슬라이드를 놓고 현미경 조이스틱을 조정하여 챔버 표면에 집중합니다. 이는 유리 버퍼 인터페이스에서 증가된 레이저 반사 신호를 가이드로서 사용하여 쉽게 수행할 수 있다. 마이크로센심분리기 튜브에 20 마이크로몰라 총 지질을 함유한 희석 된 리포솜 육수의 마이크로리터 10 마이크로리터를 추가합니다.챔버에서 마이크로센심분리기 튜브로 완충제 100마이크로리터를 옮기고 제대로 섞어 110마이크로리터를 챔버로 다시 옮킨다. 현미경의 밑에 챔버를 놓고 표면에 고정되는 리포솜을 관찰하기 위하여 리포솜 형광에서 신호를 검출할 수 있는 기본적인 현미경 설정을 이용합니다. 원고에 설명된 대로 현미경을 설정합니다.리포솜에서 DOPE ATTO488 및 DOPE ATTO655 형광을 모두 이미지화하려면 여러 채널을 이미지합니다. 교차 흥분을 피하기 위해 각 채널이 순차적으로 이미지화되었는지 확인합니다. 예를 들어, 먼저 488 나노미터에서 흥미 진진하고 495 ~ 590 나노미터에서 방출을 읽는 것으로 하나의 이미지를 취하십시오.그 후, 설정을 변경하고 633 나노 미터에서 흥미 진진한에 의해 또 다른 이미지를 가지고 있지만 660 ~ 710 나노미터에서 만 배출을 읽는다. 분석. 이미지 메뉴에서 색상을 선택하고 병합 채널 함수를 사용하여 두 채널의 복합체를 만듭니다. 두 개의 서로 다른 채널에서 이미지된 리포솜이 양호한 공동 지역화를 표시하는지 또는 보이는 드리프트가 발생했는지 관찰한다.입자를 감지하려면 플러그인 메뉴를 열고 ComDet을 선택하고 파티클 을 클릭합니다. ComDet에서 설정이 올바른지 확인하고 확인을 누릅니다. 분석을 실행한 후 결과와 요약이 있는 두 개의 팝업 창이 표시됩니다. 결과 테이블에는 두 채널 간의 강도 비율이 포함되어 있습니다.공동 지역화 데이터가 포함된 데이터 테이블 결과를 내보냅니다. 강도 비율 히스토그램에 가우시안 기능을 장착하고 평균 및 표준 편차를 추출합니다. 평균 및 표준 편차는 불균일성의 정도를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.50 나노미터 필터를 통해 여러 번 압출된 리포솜 제형을 준비한다. 형광 강도를 DLS의 크기 데이터와 비교하여 리포솜의 크기를 보정합니다. 이전과 동일한 실험 현미경 설정을 통해 교정 리포솜을 이미지화합니다.교정 리포솜의 형광 강도의 제곱근 강도 히스토그램을 플롯한다. 히스토그램에 로그 노멀 분포를 맞추고 교정 리포솜의 평균 형광 강도를 기하학적 의미로 추출합니다. 제곱 근강도와 리포솜 크기 사이의 관계를 결정하기 위해 동적 광 산란 측정에서 얻은 평균 리포솜 직경을 제곱 근강도의 기하학적 평균으로 나누어 보정 계수를 계산한다.조성 불균일성 실험에서 리포솜에 대한 제곱 근강도 값을 계산하고 보정 계수와 곱하여 이 두 직경을 변환합니다. 조성 불균일성 리포좀에 대한 직경의 함수로서 강도 비율 값을 플롯하여 약 50 나노미터에서 800 나노미터에 이르는 리포솜 의 집단에 대한 리포솜 크기의 함수로서 불균일성을 달성한다. 이 프로토콜에서, 리포솜의 성공적인 표면 고정은 회절 한강도 반점에 의해 표시된 챔버에 리포솜 용액을 첨가한 즉시 명백했다.프레임당 300~400개의 리포솜의 밀도를 달성하기에 충분한 리포솜을 고정하는 것이 좋습니다. 밀도가 낮으면 데이터 분석시간이 더 많이 소요되는 반면 밀도가 높을수록 단일 리포솜을 구별하기가 어렵습니다. 전체 시야가 적절한 초점에 있지 않으면 샘플 플레이트가 기울어질 수 있습니다.또한 리포솜이 크고 흐릿해 보이는 경우 챔버의 버퍼가 증발하고 표면이 건조되었을 수 있음을 나타냅니다. 강도 비율 히스토그램은 일반적으로 평균 비율 값 주위에 가우시안 분포를 드러낸다. 가우시안 분포에서 강한 편차가 관찰되는 경우, 약한 신호를 나타내는 리포솜의 하위 집합이 제외되었음을 시사하는 검출 감도 문제를 나타낸다.강도 비율 히스토그램을 가우시안 기능으로 피팅한 후, 0.23의 불균일성 값의 정도는 앙상블의 평균 어금니 비율과 23% 이상 다른 인구의 32%로 변환되었다. 실험적 불확실성의 정량화는 0.1로 나타났다. 분석은 당신이 사용하는 재료보다 더 나은 되지 않습니다 그래서 높은 품질의 unilaminar 리포솜은 필수적이다.따라서 이 것들을 준비할 때 동결 해동 주기를 떠나는 것과 같은 모서리를 자르지 마십시오. 이미지가 좋지 않으면 실험적인 불확실성이 높고 불균일성을 과대 평가하므로 집중력이 좋은 이미지를 얻는 데 시간이 걸릴 수 있습니다. 분석이 기본적으로 하는 일은 형광 라벨의 표면 밀도를 연구하는 것입니다.이 형광 라벨이 회귀 된 지질에 있는 경우에, 이 분석은 약 납품을 위한 질 테스트 liposomes에 이용될 수 있습니다. 이 설정은 펩티드가 멤브레인에 결합하고 곡률을 감지하는 방법을 연구하기 위해 적용되었습니다. 이것은 펩티드가 세포 안쪽에 분류되는 방법을 통제하는 분자 단서에 연구원에게 유일한 통찰력을 주었습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

단일 베이 수준에서 산소 미시의 양 및 시간 제어

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

연구

생체공학

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

마이크로 스케일 슐 리렌 기술에 의해 미세 유체 소자 믹싱 비균질성 분석

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

단일 벽 탄소 나노 튜브에 바이오 모방 고분자와 공학 분자 인식

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...