Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av det danske Rådet for uavhengig forskning [Grant Number 5054-00165B].

1. liposome forberedelse
Merk: kort, utarbeidelse av liposomer inneholder vanligvis tre viktige trinn: 1) utarbeidelse av tørre lipid filmer av ønsket lipid sammensetning; 2) rehydrering av lipider for dannelse av liposomer; og 3) kontrollere størrelsen og lamellarity av liposome befolkningen.
<ol><li>Veie ut lipider og oppløse dem i tert-butanol: vann (9:1) i hetteglass.<ol>
<li>Oppløse POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine; MW = 760 g/mol) til 50 mM.</li>
		<li>Oppløse ...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+spots:+Complex+phase+behavior+in+simple+membranes.">Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+curved+membranes+recruit+amphipathic+helices+and+protein+anchoring+motifs.">How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs.</a> Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Elizondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+Preparation+Route+on+the+Supramolecular+Organization+of+Lipids+in+a+Vesicular+System.">Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).</li><li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Inhomogeneity+in+the+Lipid+Composition+of+Individual+Nanoscale+Liposomes.">Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li><li>Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+Efficiency+Measured+on+Single+Small+Unilamellar+Vesicles.">Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).</li><li>Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intermediates+in+SNARE-induced+membrane+fusion.">Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).</li><li>Fix, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+membrane+fusion+events+mediated+by+SNARE+proteins.">Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

Det er viktig å merke seg at mens vi beskriver i detalj hvordan enkelt liposomer analysen kan brukes til å studere inhomogeneity mellom individuelle liposomer, er plattformen svært allsidig. Som tidligere vist og diskutert i innledningen, kan protokollen lett bli tilpasset for å studere aspekter ved membran-membran fusjon, protein-membran interaksjoner, eller liposomal stoffet carrier karakterisering. For noen vitenskapelige spørsmål blir adressert, kraften i singelen liposome analysen ligger i evnen til å oppdage...

Liposomer er sfæriske fosfolipid-baserte blemmer som er mye brukt både i grunnleggende og anvendt forskning. De fungerer som utmerket membran modellsystemer, fordi deres fysiokjemiske egenskaper lett kan manipuleres ved å variere lipid komponentene gjør opp liposome1,2. Liposomer utgjør også det mest brukte legemiddel leverings nanocarrier systemet, som tilbyr forbedrede farmakokinetikken og farmakodynamikk, i tillegg til høy biokompatibilitet3.
I mange år har liposomer først og fremst blitt studert ved hjelp av bulk teknikker, noe som gir kun tilgang til gjennomsnittlige lese-ut-verdier for Ensemble. Dette har ført de fleste av disse studiene til å anta at alle liposomer i ensemblet er identiske. Slike ensemble-gjennomsnitt verdier er imidlertid bare riktige Hvis det underliggende datasettet er jevnt fordelt rundt middelverdien, men kan representere en USANN og partisk konklusjon Hvis datasettet omfatter flere uavhengige populasjoner, for eksempel. I tillegg, forutsatt at ensemblet mener å representere hele befolkningen kan overse informasjonen næret innenfor inhomogeneity mellom liposomer. Bare nylig har kvantitative analyser dukket opp som er i stand til å granske enkelt liposomer, avslører store inhomogeneities mellom individuelle liposomer med hensyn til viktige fysikalsk egenskaper, inkludert liposome størrelse4, lipid sammensetning5,6, og innkapsling effektivitet7, fremhever viktigheten av å studere liposomer på single liposome nivå.
Et forskningsområde der ensemble snitt av liposome egenskaper har vist til bias resultatene studerer liposome størrelse avhengig protein-membran interaksjoner8,9. Tradisjonelt har forskere som studerer slike prosesser vært begrenset til å forberede liposomer med ulike ensemble gjennomsnittlig diameter ved ekstrudering gjennom filtre med ulike pore størrelser9. Men å utvinne diameteren til individuelle liposomer ved hjelp av enkelt liposome analyser har avdekket store befolknings overlappinger, med liposomer ekstrudert ved hjelp av 100 NM og 200 NM filtre viser opp til 70% overlapper hverandre i størrelsesfordelingen4. Dette kan sterkt bias bulk målinger av liposome størrelse-avhengige protein-membran interaksjoner10. Utføre membran-protein interaksjon studier ved hjelp av single liposome analysen, forskere i stedet tok fordel av størrelsen-polydispersitet innenfor prøven, slik at de kan studere et bredt spekter av liposome diametere innenfor hvert enkelt eksperiment, tilrettelegging nye funn av hvordan membran krumning og sammensetning kan påvirke protein rekruttering til membraner4,11,12. Et annet felt der anvendelsen av single liposome analysene har vist seg instrumental er i mekanistisk studier av protein-mediert membran Fusion13,14. For slike kinetisk målinger, evnen til å studere individuelle fusjon hendelser lindres behovet for eksperimentell synkronisering av Fusion prosessen, slik at nye mekanistisk innsikter som ellers ville ha gått tapt i spatiotemporal i snitt gjort i bulk ensemble målinger. I tillegg har enkelt liposomer blitt brukt som et membran stillas, slik at måling av individuelle proteiner og gir ny kunnskap om transmembrane protein strukturelle dynamikk15,16. Videre, slik proteoliposome-baserte oppsett gjort det mulig å studere funksjon av individuelle transmembrane transportører17 og pore-forming protein komplekser18 samt mekanismen av bioaktive membran-permeabilizing peptider19. Enkelt liposomer har også blitt brukt som myke materie-nanofluidics med overflate-immobilisert enkelt liposomer som fungerer som kamre for enzymatisk reaksjoner i volumer på 10-19 L, noe som øker gjennomstrømningen og kompleksiteten i screening-analysene med minimalt produkt forbruk20.
Nylig har enkelt liposome analyser blitt brukt for karakteriserer stoffet levering liposomer på et tidligere unprecendented detaljnivå. Forskerne var i stand til å kvantifisere signifikant inhomogeneities i mengden av polymer festet til overflaten av individuelle liposomer21. Singelen liposome analysene også tillatt målinger av stoffet levering liposomer i komplekse medier, slik som blodplasma, avslørende hvordan elementer forankret til liposome overflaten gjennom lipid ankere kan være utsatt for dissosiasjon når liposomer er utsatt for forhold etterligne de opplevde under in vivo sirkulasjon22. Samlet sett er allsidigheten og nytten av enkelt liposome analysene begrunnes med den store variasjonen av problemer disse oppsettene har vært ansatt for å henvende seg, og vi ser for oss at metodikken vil fortsette å bli utviklet og finne bruk i nye vitenskapelige felt.
Her beskriver vi en fluorescens mikroskopi enkelt liposome-analyse som gjør at individuelle liposomer kan bli studert på en høy gjennomstrømming måte (figur 1). For å illustrere metoden bruker vi den til å kvantifisere størrelsen og inhomogeneity mellom individuelle liposomer i et ensemble. Analysen sysselsetter fluorescens mikroskop Imaging av enkelt liposomer immobilisert på en paddivert glass overflate. Vi først beskrive de kritiske trinnene i liposome fabrikasjon prosessen som sikrer riktig fluorescerende liposome merking og immobilisering. Deretter beskriver vi forbehandling som trengs for å lette liposome immobilisering før skisserte prosedyren for å sikre riktig liposome overflate tetthet. Vi diskuterer mikroskopi parametrene viktig for å anskaffe bilder av høy kvalitet og avgrense hvordan du utfører enkle dataanalyse, slik at utvinning av liposome størrelse og inhomogeneity. Denne generiske protokollen skal gi et godt grunnlag for interesserte forsker til å utvikle analysen videre for hans eller hennes spesifikke forskning interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

De fleste forskning ansette liposomer som membran modellsystemer eller narkotika levering bærere er avhengig av bulk lese-ut teknikker og dermed egentlig forutsetter alle liposomer av ensemblet å være identiske. Men nye eksperimentelle plattformer i stand til å observere liposomer på enkelt-partikkel-nivå har gjort det mulig å utføre svært sofistikerte og kvantitative studier på protein-membran interaksjoner eller stoffet carrier egenskaper på individuelle liposomer, Dermed unngår feil fra ensemble snitt. Her presenterer vi en protokoll for å forberede, oppdage og analysere enkelt liposomer ved hjelp av en fluorescens-basert mikroskopi-analyse, noe som letter slike enkelt partikkel målinger. Oppsettet gjør det mulig å avbilde individuelle liposomer på en massiv parallell måte og brukes til å avsløre intra-sample størrelse og inhomogeneities. I tillegg beskriver protokollen fordelene ved å studere liposomer på enkelt liposome nivå, begrensningene til analysen, og de viktige funksjonene som skal vurderes når du endrer den til å studere andre forskningsspørsmål.

Etter protokollen beskrevet gjør det mulig å image enkelt liposomer i en massiv parallell måte (figur 1). Den vellykkede overflate immobilisering av liposomer bør umiddelbart åpenbare ved tilsetning av liposome løsningen til kammeret (trinn 3,6 i protokollen) som Diffraksjon begrenset intensitet flekker skal vises i bildet (figur 1B og figur 1C).
<p class="...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Denne protokollen beskriver fabrikasjon av liposomer og hvordan disse kan immobilisert på en overflate og avbildet individuelt i en massiv parallell måte ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Dette gjør det mulig for kvantifisering av størrelsen og inhomogeneity mellom enkelt liposomer i populasjonen.

En kvantitativ fluorescens mikroskopi-basert enkelt liposome-analyse for registrering av Inhomogeneity mellom individuelle liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

De fleste undersøkelser med liposomer er avhengige av dristige teknikker i seg selv forutsatt at alle liposomer er identiske. Ved å studere enkelt liposomer kan signifikante inhomogeniteter observeres. Den enkle liposomet teknikken som presenteres her tillater oss å studere hundrevis av liposomer samtidig og oppdage inhomogeniteter i deres størrelse og sammensetning.Metoden kan enkelt justeres for å studere andre systemer på et enkelt liposomnivå som proteinmembraninteraksjoner. Alt du trenger er forbindelsen du studerer for å bli fluorescerende merket. Med denne videoen gir vi forskerne verktøyet om hvordan de kan utføre enkelt liposomerstudier.Vi håper at det er klart at analysen lett kan endres for å studere en rekke andre vitenskapelige emner. Til å begynne med blander du de tilberedte lipidlagrene 138 mikroliter POPC og 120 mikroliter kolesterol i et friskt hetteglass med glass. Tilsett deretter 500 mikroliter hver av to fluorescerende merkede lipider og 50 mikroliter DSPE-PEG-biotin.Løsne lokket på hetteglasset med glass og klikk fryse hetteglasset i flytende nitrogen i ett til to minutter. Lyofilisere den frosne lipidblandingen over natten i en frysetørker. Om morgenen, tilsett en milliliter på 200 millimolar D-sorbitol buffer til de tørre lipider.Varm blandingen til 45 grader Celsius og utsett den for magnetisk omrøring i minst en time. Frys deretter lipidsuspensjonen ved å dyppe hetteglasset i flytende nitrogen og vent til suspensjonen er helt frosset. Deretter dypper du den frosne suspensjonen i et varmebad ved 55 grader Celsius til blandingen er helt tint.Utsett blandingen til totalt 11 fryse-tine sykluser. Deretter ekstruderer du liposomets suspensjon én gang gjennom et 800 nanometer polykarbonatfilter ved hjelp av et miniprofileringssett. Bland 1, 200 mikroliter BSA og 120 mikroliter BSA biotin.Tilsett 300 mikroliter av blandingen til hver brønn i en åtte-brønns sklie og inkuber lysbildet i 20 minutter ved romtemperatur. Litt vippe lysbildet og fra kanten av hver godt aspirere mediet. Tilsett umiddelbart 300 mikroliter HEPES-buffer i hver brønn for å vaske.Vask hver brønn åtte ganger totalt. Tilsett 250 mikroliter streptavidin og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Gjenta de åtte vaskene som tidligere beskrevet.Plasser lysbildet på mikroskopet og juster mikroskopets joystick for å fokusere på overflaten av kammeret. Dette kan enkelt gjøres ved hjelp av økt laser refleksjon signal fra glass buffer grensesnitt som en guide. I et mikrocentrifugerør legger du til 10 mikroliter av den fortynnede liposomet som inneholder 20 mikromose total lipid.Overfør 100 mikroliter buffer fra kammeret til mikrocentrifugerøret, bland riktig og overfør de 110 mikroliterene tilbake til kammeret. Sett kammeret under mikroskopet og bruk en rudimental mikroskopinnstilling som er i stand til å oppdage signal fra liposomet fluoroforer for å observere liposomer som er immobilisert på overflaten. Sett opp mikroskopet som beskrevet i manuskriptet.For å bilde både DOPE ATTO488 og DOPE ATTO655 fluoroforer i liposomer, bilde flere kanaler. Kontroller at hver kanal er avbildet sekvensielt for å unngå kryss-eksitasjon. For eksempel, først ta ett bilde ved spennende på 488 nanometer og lese utslipp på 495 til 590 nanometer.Deretter endrer du innstillingene og tar et annet bilde ved å spenne på 633 nanometer, men leser utslipp bare på 660 til 710 nanometer. Analysere. Velg farge i bildemenyen og bruk flettekanalfunksjonen til å opprette en sammensetning av de to kanalene. Vær oppmerksom på om liposomer avbildet i to forskjellige kanaler viser god sam lokalisering eller om synlig drift oppstod.For å oppdage partikler, åpne plugins-menyen, velg ComDet og klikk på detect partikler. Kontroller at innstillingene er riktige i ComDet, og trykk på OK. Etter å ha kjørt analysen, viser to popup-vinduer med resultater og sammendrag. Resultattabellen inneholder intensitetsforholdet mellom de to kanalene.Eksporter datatabellresultatene som inneholder sam lokaliseringsdataene. Monter intensitetsforholdet histogrammet med en gaussisk funksjon og trekk ut gjennomsnittet og standardavviket. Gjennomsnittet og standardavviket kan brukes til å beregne graden av inhomogenitet.Forbered en liposomformulering som har blitt ekstrudert flere ganger gjennom et 50 nanometer filter. Kalibrer størrelsen på liposomer ved å sammenligne fluorescensintensiteten med størrelsesdata fra DLS. Med de samme eksperimentelle mikroskopinnstillingene som tidligere, kan du bilde kalibreringsleosomet.Plott en firkantet rotintensitet histogrammet av fluorescensintensiteten av kalibrering liposomer. Monter histogrammet med en normal loggfordeling og trekk ut den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten til kalibreringsleosomene som det geometriske gjennomsnittet. For å bestemme forholdet mellom kvadratrotintensiteten og liposometstørrelsen, beregn korreksjonsfaktoren ved å dele den gjennomsnittlige liposometdiameteren hentet fra de dynamiske lysspømemålingsmålingene med det geometriske gjennomsnittet av kvadratrotintensiteten.Beregn kvadratrotintensitetsverdier for liposomer i det kompositoriske inhomogenitetseksperimentet og konverter disse to diameterne ved å multiplisere med korreksjonsfaktoren. Plott intensitetsforholdsverdien som en funksjon av diameter for kompositoriske inhomogenitet liposomer, og dermed oppnå inhomogenitet som en funksjon av liposomet størrelse for en populasjon av liposomer som strekker seg fra ca 50 nanometer til 800 nanometer. I denne protokollen var den vellykkede overflateimmobiliseringen av liposomer umiddelbart tydelig ved tilsetning av liposometløsningen til kammeret indikert av diffraksjonsbegrensede intensitetspunkter.Det anbefales å immobilisere nok liposomer for å oppnå en tetthet på 300 til 400 liposomer per ramme. En lavere tetthet gjør dataanalysen mer tidkrevende, mens en høyere tetthet gjør det utfordrende å skille mellom enkeltleppeosomer. Hvis hele synsfeltet ikke er i riktig fokus, kan prøveplaten vippe.Også, hvis liposomer synes store og uklare, indikerer dette bufferen i kammeret kan ha fordampet og overflaten tørket ut. Intensitetsforholdet histogrammer avslører vanligvis en gaussisk fordeling rundt en gjennomsnittlig ratioverdi. Hvis det observeres sterke avvik fra en gaussisk fordeling, indikerer det et deteksjonsfølsomhetsproblem som tyder på at en undergruppe av liposomer som viser et svakere signal er utelukket.Etter å ha tilpasset intensitetsforholdet histogrammet med en gaussisk funksjon, ble en grad av inhomogenitetsverdi på 0,23 oversatt til 32% av befolkningen forskjellig med mer enn 23%fra gjennomsnittlig molar forholdet mellom ensemblet. Kvantifiseringen av den eksperimentelle usikkerheten ble funnet å være 0,1. Analysen vil aldri bli bedre enn materialene du bruker så høy kvalitet unilaminar liposomer er avgjørende.Så når du forbereder disse, ikke kutte noen hjørner som å forlate fryse-tine sykluser. Dårlige bilder vil føre til høy eksperimentell usikkerhet og få deg til å overvurdere inhomogeniteten, så ta deg tid til å skaffe seg gode fokusbilder. Hva analysen i utgangspunktet gjør er å studere overflatetettheten til fluorescerende etikett.Hvis denne fluorescerende etiketten er på en percolated lipid, kan denne analysen brukes til å kvalitetsteste liposomer for legemiddellevering. Oppsettet har blitt brukt til å studere hvordan peptider binder seg til membraner og føler krumningen. Dette har gitt forskerne unik innsikt i molekylære signaler som styrer hvordan peptider sorteres inne i cellene.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Kvantitativ og Temporal Kontroll av Oxygen mikromiljøet på Single Holme nivå

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Drug-induced Sensibilisering av adenylyl cyclase: Analyse Effektivisering og miniatyrisering for lite molekyl og siRNA screening programmer

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifisert to-foton Microscope: en søknad til sporing av intracellulær Blemmer

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Fast Fluorescens Imaging til Molecular Diffusion Lov om Aktive cellemembraner i et kommersielt mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analysere Blanding inhomogeneity i et mikrofluid Device av mikro Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Fluorescens Biomembrane Force Probe: Samtidig Kvantifisering av Receptor-ligand Kinetics og Binding-indusert intracellulære signal på en enkelt celle

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enkelt Molecule Fluorescensmikroskopi på Planar Støttet bilagene

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Bruke optiske fibre

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Engineering Molecular Recognition med Bio-mimetiske Polymers på enkelt Walled karbonnanorør

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En av beryllium gjennomstrømming Microfluidic plattform for enkeltceller genomet sekvensering

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...