Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo Conselho Dinamarquês para a Investigação Independente [número de subvenção 5054-00165B].

1. Preparação para Lipossoma
NOTA: Brevemente, a preparação de lipossomas geralmente inclui três etapas cruciais: 1) preparação de filmes lipídicos secos da composição lipídica desejada; 2) reidratação dos lipídios para formação de lipossomas; e 3) controlar o tamanho e a lamellaridade da população de lipossomas.
<ol><li>Pesar os lipídios e dissolvê-los em tert-butanol:água (9:1) em frascos de vidro.<ol>
<li>Dissolva POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosfocolina; MW =...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+spots:+Complex+phase+behavior+in+simple+membranes.">Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+curved+membranes+recruit+amphipathic+helices+and+protein+anchoring+motifs.">How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs.</a> Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Elizondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+Preparation+Route+on+the+Supramolecular+Organization+of+Lipids+in+a+Vesicular+System.">Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).</li><li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Inhomogeneity+in+the+Lipid+Composition+of+Individual+Nanoscale+Liposomes.">Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li><li>Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+Efficiency+Measured+on+Single+Small+Unilamellar+Vesicles.">Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).</li><li>Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intermediates+in+SNARE-induced+membrane+fusion.">Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).</li><li>Fix, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+membrane+fusion+events+mediated+by+SNARE+proteins.">Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

É importante notar que, embora descrevamos em detalhes como o ensaio único dos lipossomas pode ser usado para estudar a inhomogeneidade composicional entre os lipossomas individuais, a plataforma é muito versátil. Como mostrado anteriormente e discutido na introdução, o protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar aspectos da fusão membrana-membrana, interações proteína-membrana ou caracterização lipossômica do portador de drogas. Para quaisquer questões científicas que estão sendo abordadas, o pod...

Os lipossomas são vesículas à base de fosfolípido esféricas que são fortemente utilizadas tanto na pesquisa básica quanto aplicada. Funcionam como sistemas excelentes do modelo da membrana, porque suas propriedades physiochemical podem facilmente ser manipuladas variando os componentes lipídicos que compõem o liposome1,2. Além disso, os lipossomas constituem o sistema de nanocarrier de entrega de medicamentos mais utilizado, oferecendo farmacocinética melhorada e farmacodinâmica, bem como alta biocompatibilidade3.
Por muitos anos, os lipossomas têm sido estudados principalmente usando técnicas a granel, dando apenas acesso a valores médios de leitura do conjunto. Isso levou a maioria desses estudos a assumir que todos os lipossomas do conjunto são idênticos. No entanto, esses valores medianos pelo conjunto só estão corretos se o conjunto de dados subjacente for distribuído uniformemente em torno do valor médio, mas pode representar uma conclusão falsa e tendenciosa se o conjunto de dados incluir várias populações independentes, por exemplo. Além disso, assumindo que o conjunto significa representar toda a população pode ignorar as informações abrigadas dentro da inhomogeneidade entre os lipossomas. Só recentemente surgiram ensaios quantitativos que são capazes de sondar lipossomos individuais, revelando grandes inhomogeneidades entre os lipossomos individuais no que diz respeito a importantes propriedades fisicoquímicas, incluindo o tamanho lipossoma4,composição lipídica5,6, e eficiência de encapsulamento7, destacando a importância de estudar liosomos no nível lipossoma único.
Uma área de pesquisa onde a média do conjunto de propriedades lipossoma tem sido mostrado para os resultados viés está estudando lipossoma tamanho dependente de interações de membrana de proteína8,9. Tradicionalmente, os pesquisadores que estudam tais processos têm sido restritos a preparar lipossomas com diferentes diâmetros médios conjunto por extrusão através de filtros com diferentes tamanhos de poros9. No entanto, extrair o diâmetro dos lipossomos individuais usando ensaios lipososos únicos revelou grandes sobreposições populacionais, com lipossomos extrudados usando filtros de 100 nm e 200 nm exibindo até 70% de sobreposição em sua distribuição de tamanho4. Isso poderia influenciar severamente as medições em massa de interações de membrana de proteína dependentes do tamanho dos lipososos10. Realizando os estudos de interação membrana-proteína usando o único ensaio lipossoma, os pesquisadores aproveitaram a polidispersão de tamanho dentro da amostra, permitindo-lhes estudar uma ampla gama de diâmetros lilíticos dentro de cada experimento, facilitando novas descobertas de como a curvatura e a composição da membrana podem afetar o recrutamento de proteínas nas membranas4,11,12. Outro campo onde a aplicação de ensaios lipososos únicos tem provado instrumental está em estudos mecanicistas de fusão de membrana mediada porproteínas 13,14. Para tais medições cinéticas, a capacidade de estudar eventos de fusão individuais aliviou a necessidade de sincronização experimental do processo de fusão, permitindo novos insights mecanicistas que de outra forma teriam sido perdidos na média spatiotemporal feita em medições de conjuntos a granel. Além disso, os lipossomos individuais têm sido utilizados como andaime de membrana, permitindo a medição de proteínas individuais e oferecendo novos conhecimentos sobre a dinâmica estrutural da proteína transmembrana15,16. Além disso, tais configurações à base de proteolipossoma tornaram possível estudar a função dos transportadores transmembranaindividuais17 e complexos proteicos formadores de poros18, bem como o mecanismo de peptídeos bioativos de membrana permeabilizante19. Os únicos lipossomos também têm sido usados como nanofluídicos de matéria macia com lipossomos únicos imobilizados pela superfície servindo como câmaras para reações enzimáticas em volumes de10-19 L, aumentando a fonte e a complexidade dos ensaios de triagem com consumo mínimo de produtos20.
Recentemente, os únicos ensaios lipossoma foram usados caracterizando lipossomos da entrega da droga em um nível previamente unprecendented de detalhe. Os pesquisadores foram capazes de quantificar inhomogeneidades significativas na quantidade de polímero ligado à superfície dos lipossomos individuais21. Os únicos ensaios lipossoma também permitiram medições de lipossomos de entrega de drogas em mídias complexas, como plasma sanguíneo, revelando como elementos ancorados à superfície lipossoma através de âncoras lipídicas podem ser suscetíveis à dissociação quando os lipossomas são expostos a condições que imitam aqueles experimentados durante a circulação vivo22. No geral, a versatilidade e utilidade dos únicos ensaios liúlio são fundamentados pela grande variedade de problemas que essas configurações foram empregadas para resolver, e prevemos que a metodologia continuará a ser desenvolvida e encontrará uso em novos campos científicos.
Aqui descrevemos um ensaio liposcoso único baseado em microscopia de fluorescência que permite que os lipossomas individuais sejam estudados de forma de alta despersistência (Figura 1). Para ilustrar o método, nós o usamos para quantificar o tamanho e a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais dentro de um conjunto. O ensaio emprega imagens de microscópio de fluorescência de lipossomos únicos imobilizados em uma superfície de vidro passivado. Primeiro descrevemos os passos críticos no processo de fabricação de lipossoma que garante rotulagem e imobilização de liposos fluorescentes adequadas. Em seguida, descrevemos a preparação superficial necessária para facilitar a imobilização dos lipossoma antes de delinear o procedimento para garantir densidades de superfície lipossoma apropriadas. Discutimos os parâmetros de microscopia importantes para a aquisição de imagens de alta qualidade e delineamos como realizar análises de dados simples, permitindo a extração de tamanho lilímico e inhomogeneidade composicional. Este protocolo genérico deve fornecer uma boa base para o pesquisador interessado para desenvolver o ensaio ainda mais para o seu interesse de pesquisa específico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

A maioria das pesquisas que empregam lipossomas como sistemas de modelo de membrana ou portadores de entrega de drogas depende de técnicas de leitura em massa e, portanto, assume intrinsecamente todos os lipossomas do conjunto para ser idêntico. No entanto, novas plataformas experimentais capazes de observar lipossomos no nível de partículaúnica tornaram possível realizar estudos altamente sofisticados e quantitativos sobre interações de membrana proteica ou propriedades de portadores de drogas em lipossomos individuais, evitando assim erros da média do ensemble. Aqui apresentamos um protocolo para preparar, detectar e analisar lipossomos individuais usando um ensaio microscopia à base de fluorescência, facilitando tais medições de partículas únicas. A configuração permite a imagem de lipossomos individuais de forma paralela maciça e é empregada para revelar o tamanho intra-amostral e inhomogeneidades composicionais. Além disso, o protocolo descreve as vantagens de estudar lipossomas no nível único de lipossoma, as limitações do ensaio e as características importantes a serem consideradas ao modificá-lo para estudar outras questões de pesquisa.

Seguir o protocolo descrito torna possível a imagem de lipossomos únicos de uma forma paralela maciça (Figura 1). A bem-sucedida imobilização superficial dos lipossomas deve ser imediatamente aparente após a adição da solução lipossoma à câmara (passo 3.6 no protocolo), já que as manchas de intensidade limitada de difração devem aparecer na imagem (Figura 1B e Figura 1...

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A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Este protocolo descreve a fabricação de lipossomas e como estes podem ser imobilizados em uma superfície e imagemindividualmente de uma forma paralela maciça usando microscopia de fluorescência. Isso permite a quantificação do tamanho e inhomogeneidade composicional entre os lipossomos únicos da população.

Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

A maioria das pesquisas com lipossomos dependem de técnicas ousadas intrinsecamente assumindo que todos os lipossomos sejam idênticos. Ao estudar lipossomos únicos, podem ser observadas inhomogenidades significativas. A única técnica liposonea apresentada aqui nos permite estudar centenas de lipossomos simultaneamente e detectar inhomogeneidades em seu tamanho e composição.O método pode ser facilmente ajustado para estudar outros sistemas em um único nível lipossomo, como interações de membrana proteica. Tudo que você precisa é do composto que você estuda para ser rotulado fluorescentemente. Com este vídeo, fornecemos aos pesquisadores a ferramenta sobre como eles podem realizar estudos lipossomos únicos.Esperamos que fique claro que o ensaio pode ser facilmente modificado para estudar uma série de outros tópicos científicos. Para começar, misture os estoques lipídicos preparados 138 microliters de POPC e 120 microliters de colesterol em um frasco de vidro fresco. Em seguida, adicione 500 microliters cada um de dois lipídios fluorescentes rotulados e 50 microliters de DSPE-PEG-biotina.Solte a tampa do frasco de vidro e estote o frasco em nitrogênio líquido por um a dois minutos. Lyophilize a mistura lipídica congelada durante a noite em uma secadora congelante. Pela manhã, adicione um mililitro de 200 mililitros de tampão D-sorbitol aos lipídios secos.Aqueça a mistura a 45 graus Celsius e exponha-a à agitação magnética por pelo menos uma hora. Em seguida, congele a suspensão lipídica mergulhando o frasco em nitrogênio líquido e espere até que a suspensão esteja completamente congelada. Em seguida, mergulhe a suspensão congelada em um banho de aquecimento a 55 graus Celsius até que a mistura esteja completamente descongelada.Exponha a mistura a um total de 11 ciclos de congelamento. Depois disso, usando um mini kit de extrusão, extrude a suspensão lipossa uma vez através de um filtro de policarbonato de 800 nanômetros. Mix 1.200 microliters de BSA e 120 microliters de biotina BSA.Adicione 300 microliters da mistura a cada poço em um slide de oito poços e incubar o slide por 20 minutos em temperatura ambiente. Incline ligeiramente o slide e a partir da borda de cada poço aspirar o meio. Adicione imediatamente 300 microliters de tampão HEPES em cada poço para lavar.Lave cada poço oito vezes no total. Adicione 250 microliters de streptavidina e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. Repita as oito lavagens descritas anteriormente.Coloque o slide no microscópio e ajuste o joystick do microscópio para se concentrar na superfície da câmara. Isso pode ser facilmente feito usando o sinal de reflexo a laser aumentado da interface tampão de vidro como um guia. Em um tubo de microcentrifuge, adicione 10 microliters do estoque lipossomo diluído contendo 20 lipídios totais de micromolar.Transfira 100 microliters de tampão da câmara para o tubo de microcentrífuga, misture corretamente e transfira os 110 microliters de volta para a câmara. Coloque a câmara sob o microscópio e use uma configuração de microscópio rudimental capaz de detectar sinal a partir dos fluoroforos lipossos para observar os lipossomos sendo imobilizados na superfície. Configure o microscópio como descrito no manuscrito.Para imagem tanto do DOPE ATTO488 quanto do DOPE ATTO655 fluoroforos nos lipossomos, imagem múltiplos canais. Certifique-se de que cada canal seja imageado sequencialmente para evitar a excitação cruzada. Por exemplo, primeiro tire uma imagem por emocionante em 488 nanômetros e emissão de leitura em 495 a 590 nanômetros.Depois disso, mude as configurações e tire outra imagem empolgante em 633 nanômetros, mas a emissão de leitura apenas em 660 a 710 nanômetros. Analisar. No menu de imagem, escolha a cor e use a função de canal de mesclagem para criar um composto dos dois canais. Observe se os lipossomos visualizados em dois canais diferentes exibem boa co-localização ou se ocorreu deriva visível.Para detectar partículas, abra o menu plugins, escolha cometa e clique em detectar partículas. No Cometa, verifique se as configurações estão corretas e pressione OK. Após a execução da análise, duas janelas pop-up com resultados e resumo show. A tabela de resultados contém a razão de intensidade entre os dois canais.Exportar os resultados da tabela de dados contendo os dados de co-localização. Encaixe a razão de intensidade histograma com uma função gaussiana e extraia o desvio médio e padrão. O desvio médio e padrão pode ser usado para calcular o grau de inhomogeneidade.Prepare uma formulação liposa que foi extrudada várias vezes através de um filtro de 50 nanômetros. Calibrar o tamanho dos lipossomos comparando a intensidade da fluorescência com os dados de tamanho do DLS. Com as mesmas configurações experimentais de microscópio anteriormente, imagem os lipossomos de calibração.Trace um histograma de intensidade de raiz quadrada da intensidade da fluorescência dos lipossomos de calibração. Encaixe o histograma com uma distribuição normal de troncos e extraia a intensidade média de fluorescência dos lipossomos de calibração como a média geométrica. Para determinar a relação entre a intensidade da raiz quadrada e o tamanho lipossomo, calcule o fator de correção dividindo o diâmetro lipossomo médio obtido a partir das medidas dinâmicas de dispersão de luz com a média geométrica da intensidade da raiz quadrada.Calcule os valores de intensidade da raiz quadrada para os lipossomos no experimento de inhomogeneidade composicional e converta esses dois diâmetros multiplicando-se com o fator de correção. Traçar o valor da razão de intensidade em função do diâmetro para os lipossomos composicionais da inhomogeneidade, alcançando assim a inhomogeneidade em função do tamanho lipossomo para uma população de lipossomos que abrange de aproximadamente 50 nanômetros a 800 nanômetros. Neste protocolo, a imobilização superficial bem sucedida dos lipossomos foi imediatamente aparente após a adição da solução lipossa à câmara indicada pelos pontos de intensidade limitada da difração.Recomenda-se imobilizar lipossomos suficientes para atingir uma densidade de 300 a 400 lipossomos por quadro. Uma densidade menor torna a análise de dados mais demorada, enquanto uma densidade maior torna desafiador distinguir lipossomos únicos. Se todo o campo de visão não estiver em foco adequado, a placa de amostra pode estar inclinando.Além disso, se os lipossomos parecerem grandes e embaçados, isso indica que o tampão na câmara pode ter evaporado e a superfície secada. A proporção de intensidade histogramas tipicamente revelam uma distribuição gaussiana em torno de um valor médio de razão. Se forem observados fortes desvios de uma distribuição gaussiana, indica um problema de sensibilidade de detecção sugerindo que um subconjunto de lipossomos mostrando um sinal mais fraco foi excluído.Após a montagem da razão de intensidade histograma com função gaussiana, um grau de valor de inhomogeneidade de 0,23 foi traduzido para 32% da população diferindo em mais de 23% da razão molar média do conjunto. A quantificação da incerteza experimental foi encontrada em 0,1. O ensaio nunca vai ficar melhor do que os materiais que você usa tão liposomos unilaminar de alta qualidade são essenciais.Então, quando você prepará-los, não corte nenhum canto, como deixar de fora ciclos de congelamento. Imagens ruins levarão a uma alta incerteza experimental e farão você superestimar a inhomogeneidade, então aproveite o tempo para adquirir boas imagens em foco. O que o ensaio basicamente faz é estudar a densidade superficial do rótulo fluorescente.Se este rótulo fluorescente estiver em um lipídio percolado, este ensaio pode ser usado para testar lipossomos de qualidade para a entrega de medicamentos. A configuração foi aplicada para estudar como os peptídeos se ligam às membranas e sentem a curvatura. Isso deu aos pesquisadores insights únicos sobre as pistas moleculares que regem como os peptídeos são classificados dentro das células.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Controle quantitativo e temporal de oxigênio Microenvironment no Ilhéu Individual

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Bioengenharia

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analisando falta de homogeneidade de mistura em um dispositivo micro, pela técnica Microscale Schlieren

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Reconhecimento Molecular de engenharia com Polymers Bio-mimético em únicos Walled nanotubos de carbono

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...