Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

Эта работа была профинансирована Датским советом независимых исследований (грант No 5054-00165B).

1. Липосомная подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Кратко, подготовка липосом обычно включает в себя три важнейших шага: 1) подготовка сухих липидных пленок желаемого липидного состава; 2) регидратация липидов для формирования липосом; и 3) контроль размера и ламелярности популяции липос...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+spots:+Complex+phase+behavior+in+simple+membranes.">Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+curved+membranes+recruit+amphipathic+helices+and+protein+anchoring+motifs.">How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs.</a> Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Elizondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+Preparation+Route+on+the+Supramolecular+Organization+of+Lipids+in+a+Vesicular+System.">Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).</li><li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Inhomogeneity+in+the+Lipid+Composition+of+Individual+Nanoscale+Liposomes.">Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li><li>Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+Efficiency+Measured+on+Single+Small+Unilamellar+Vesicles.">Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).</li><li>Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intermediates+in+SNARE-induced+membrane+fusion.">Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).</li><li>Fix, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+membrane+fusion+events+mediated+by+SNARE+proteins.">Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

Важно отметить, что в то время как мы подробно описываем, как один липосомы можно использовать для изучения композиционной неоднородности между отдельными липосомы, платформа очень универсальна. Как было показано ранее и обсуждается во введении, протокол может быть легко адаптирован ?...

Липосомы являются сферические фосфолипидные пузырьки, которые широко используются как в основных, так и в прикладных исследованиях. Они функционируют как отличные системы мембранной модели, потому что их физиохимические свойства можно легко манипулировать путем изменения липидных компонентов, составляющих липосому1,2. Кроме того, липосомы представляют собой наиболее часто используемую систему доставки лекарств, предлагая улучшенную фармакокинетику и фармакодинамику, а также высокую биосовместимость3.
На протяжении многих лет липосомы в основном изучались с использованием массовых методов, давая только доступ к среднему ансамблю считывание значений. Это привело большинство из этих исследований предположить, что все липосомы в ансамбле идентичны. Однако такие значения, усредненные по ансамблю, являются правильными только в том случае, если базовый набор данных равномерно распределен вокруг среднего значения, но может представлять собой ложное и предвзятое заключение, если набор данных включает, например, несколько независимых групп населения. Кроме того, предполагая, ансамбль означает представлять все население может игнорировать информацию, укрываемую в неоднородности между липосомы. Только недавно появились количественные анализы, которые способны зондировать одиночные липосомы, выявляя большие неоднородности между отдельными липосомы по отношению к важным физикохимическим свойствам, включая липосомы размер4, липидный состав5,6, и эффективность инкапсуляции7, подчеркивая важность изучения липосом на одном уровне липосомы.
Научно-исследовательская область, где ансамбль усреднения липосомсвойства было показано, что результаты смещения изучает липосома-зависимых белково-мембранных взаимодействий8,9. Традиционно, исследователи, изучающие такие процессы, были ограничены в подготовке липосом с различными средними диаметрами ансамбля экструзией через фильтры с различными размерами пор9. Тем не менее, извлечение диаметра отдельных липосом с помощью одной липосомы анализы выявили большие перекрытия населения, с липосомы экструдированные с помощью 100 нм и 200 нм фильтры отображения до 70% перекрытия в их размер распределения4. Это может серьезно смещения объемных измерений липосома размера-зависимых белково-мембранных взаимодействий10. Выполняя исследования взаимодействия мембраны и белка с использованием одного липосома анализ, исследователи вместо этого воспользовался размер-polydispersity в образце, что позволяет им изучать широкий спектр липосом диаметров в рамках каждого одного эксперимента, способствуя новым открытиям о том, как мембранная кривизна и состав может повлиять на набор белка в мембраны4,11,12. Еще одно поле, где применение одной липосомы анализы оказалось полезным в механистических исследованиях белка опосредованного мембранного слияния13,14. Для таких кинетических измерений, способность изучать индивидуальные события слияния смягчила необходимость экспериментальной синхронизации процесса синтеза, позволяя новые механистические идеи, которые в противном случае были бы потеряны в пространственно-временном усреднении сделано в объемных измерений ансамбля. Кроме того, одиночные липосомы были использованы в качестве мембраны эшафот, что позволяет измерения отдельных белков и предлагает новые знания о трансмембранных белков структурной динамики15,16. Кроме того, такие протеолипосомы на основе установок позволило изучить функции отдельных трансмемментов17 и порообразующих белковых комплексов18, а также механизм биоактивных мембранно-пермяковых пептидов19. Однолиповая липосома также использовалась в качестве нанофлюидики мягкой материи с поверхностно-обездвиженных одиночными липосомыми, выступающей в качестве камер для ферментативных реакций в объемах 10-19 л, увеличивая пропускную способность и сложность скрининговых анализов с минимальным потреблением продукта20.
В последнее время, один липосома анализы были использованы для характеристики доставки наркотиков липосомы на ранее unprecendented уровне детализации. Исследователям удалось количественно очислить значительные неоднородности в количестве полимера, прикрепленного к поверхности отдельных липосом21. Один липосомы анализы также позволили измерения доставки наркотиков липосомы в сложных средствах массовой информации, таких как плазма крови, показывая, как элементы, закрепленные на липосом поверхности через липидные якоря могут быть восприимчивы к диссоциации, когда липосомы подвергаются условиям, имитирующим тех, кто испытал во время циркуляции vivo22. В целом, универсальность и полезность одного липосома анализы обоснованы большое разнообразие проблем, эти установки были использованы для решения, и мы предусматриваем, что методология будет продолжать разрабатываться и найти применение в новых научных областях.
Здесь мы описываем флуоресценцию на основе одного липосомы анализ, который позволяет отдельных липосом, которые будут изучены в высокой пропускной форме (Рисунок 1). Чтобы проиллюстрировать метод, мы используем его для количественной оценки размера и композиционной неоднородности между отдельными липосонами в ансамбле. В анализе используется флуоресцентный микроскоп визуализации одной липосомы, обездвиженной на пассивной стеклянной поверхности. Сначала мы описываем критические шаги в процессе изготовления липосом, который обеспечивает надлежащую флуоресцентную маркировку липосом и иммобилизацию. Затем мы описываем поверхностный препарат, необходимый для облегчения липосомного иммобилизации, прежде чем с изложением процедуры обеспечения надлежащей плотности поверхности липосом. Мы обсуждаем параметры микроскопии, важные для получения высококачественных изображений, и разграничив, как выполнять простой анализ данных, позволяющий извить липосому и композиционную неоднородность. Этот общий протокол должен обеспечить хорошую основу для заинтересованного исследователя для дальнейшего развития ассседля для его или ее конкретных научных интересов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

Большинство исследований с использованием липосом в качестве мембранных систем модели или носителей доставки лекарств опирается на объемные методы чтения и, таким образом, внутренне предполагает, что все липосомы ансамбля будут идентичны. Тем не менее, новые экспериментальные платформы, способные наблюдать липосомы на уровне одной частицы, позволили провести высокосложные и количественные исследования по белково-мембрановым взаимодействиям или свойствам носителя наркотиков на отдельных липосомых, таким образом избегая ошибок из ансамбля усреднения. Здесь мы представляем протокол для подготовки, обнаружения и анализа отдельных липосом с помощью анализа микроскопии на основе флуоресценции, облегчая такие измерения одной частицы. Установка позволяет для визуализации отдельных липосом в массовом параллельном порядке и используется для выявления внутривыборных размеров и композиционных неоднородностей. Кроме того, протокол описывает преимущества изучения липосом на одном уровне липосомы, ограничения асссея, а также важные особенности, которые необходимо учитывать при его изменении для изучения других исследовательских вопросов.

Следуя описанному протоколу, можно изображение отдельных липосом в массовом параллельном порядке(рисунок 1). Успешная поверхностная иммобилизация липосом должна быть немедленно очевидна при добавлении липосомного раствора в камеру (шаг 3.6 в протокол?...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Этот протокол описывает изготовление липосом и как они могут быть обездвижены на поверхности и изображены индивидуально в массивной параллельной манере с помощью флуоресценции микроскопии. Это позволяет количественно определить размер и композиционную неоднородность между отдельными липосонами населения.

Количественная флуоресценция на основе однолипосомы анализ для обнаружения композиционной неоднородности между отдельными липосомы

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Большинство исследований с липосомы полагаться на смелые методы внутренне предполагая, что все липосомы, чтобы быть идентичными. Изучая одиночные липосомы, можно наблюдать значительные неоднородности. Один липосомный метод, представленный здесь, позволяет нам изучать сотни липосом одновременно и обнаруживать неоднородность по их размеру и составу.Метод можно легко настроить для изучения других систем на одном липосомном уровне, таких как взаимодействие белковой мембраны. Все, что вам нужно, это соединение вы изучаете, чтобы быть флуоресцентно помечены. С помощью этого видео, мы предоставляем исследователям с инструментом о том, как они могут выполнять одиночные исследования липосомы.Мы надеемся, что ясно, что анализ может быть легко изменен для изучения целого ряда других научных тем. Для начала смешайте подготовленные липидные запасы 138 микролитров POPC и 120 микролитров холестерина в свежем стеклянном флаконе. Затем добавьте 500 микролитров каждый из двух флуоресцентно помеченных липидов и 50 микролитров DSPE-PEG-биотина.Ослабить крышку стеклянного флакона и оснастки заморозить флакон в жидком азоте в течение одной-двух минут. Лиофилизовать замороженную липидную смесь на ночь в заморозить сушилку. Утром добавьте один миллилитр 200 миллимолярный буфер D-сорбитола в сухие липиды.Нагрейте смесь до 45 градусов по Цельсию и подвергните ее магнитному перемешиванию в течение по крайней мере одного часа. Затем заморозить липидную суспензию, окунув флакон в жидкий азот и ждать, пока подвеска полностью заморожена. Затем окуните замороженную подвеску в нагревательной ванне при 55 градусах Цельсия до тех пор, пока смесь не будет полностью разморожена.Выставить смесь в общей сложности 11 циклов замораживания-оттепели. После этого, используя комплект мини экструзии, экструдировать липосомную подвеску один раз через 800 нанометровый поликарбонатный фильтр. Смешайте 1 200 микролитров BSA и 120 микролитров биотина BSA.Добавьте 300 микролитров смеси к каждому хорошо в восемь хорошо слайд и инкубировать слайд в течение 20 минут при комнатной температуре. Слегка наклоните слайд и от края каждого хорошо аспирировать среды. Немедленно добавьте 300 микролитров буфера HEPES в каждый колодец для мытья.Вымойте каждый хорошо восемь раз в общей сложности. Добавьте 250 микролитров стрептавидина и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторите восемь моет, как описано ранее.Поместите слайд на микроскоп и отрегулируйте микроскоп джойстик, чтобы сосредоточиться на поверхности камеры. Это можно легко сделать с помощью увеличенного сигнала лазерного отражения от интерфейса стеклянного буфера в качестве руководства. В микроцентрифуговую трубку добавьте 10 микролитров разбавленного липосомного бульона, содержащего 20 микромолеевых липидов.Перенесите 100 микролитров буфера из камеры в трубку микроцентрифуга, смешайте правильно и перенесите 110 микролитров обратно в камеру. Поместите камеру под микроскоп и используйте рудиментальный микроскоп, способный обнаруживать сигнал от липосомных флюорофоров, чтобы наблюдать, как липосомы обездвижены на поверхности. Настройка микроскопа, как описано в рукописи.Для изображения как DOPE ATTO488 и DOPE ATTO655 флюорофоры в липосомах, изображение нескольких каналов. Убедитесь, что каждый канал изображен последовательно, чтобы избежать перекрестного возбуждения. Например, сначала сделайте одно изображение, захватывающее на 488 нанометров и эмиссию показаний на 495-590 нанометров.После этого измените настройки и сделайте еще одно изображение на 633 нанометров, но считыв выбросы только на 660-710 нанометров. Анализировать. В меню изображения выберите цвет и используйте функцию канала слияния для создания композита из двух каналов. Обратите время на то, чтобы липосомы, изображенные в двух разных каналах, отображали хорошую коа локализацию или произошел видимый дрейф.Для обнаружения частиц откройте меню плагинов, выберите ComDet и нажмите кнопку обнаружения частиц. В ComDet убедитесь, что настройки верны, и нажмите OK. После запуска анализа два всплывающих окна с результатами и резюме показывают. Таблица результатов содержит соотношение интенсивности между двумя каналами.Экспорт результатов таблицы данных, содержащих данные о совместной локализации. Пригоните гистограмму соотношения интенсивности с гауссийской функцией и извлекайте среднее и стандартное отклонение. Среднее и стандартное отклонение может быть использовано для расчета степени неоднородности.Подготовьте липосомную формулу, которая была выдавнана несколько раз через 50 нанометровый фильтр. Калибруйте размер липосом, сравнивая интенсивность флуоресценции с данными о размерах DLS. С теми же экспериментальными настройками микроскопа, что и ранее, изображение липосом калибровки.Участок квадратный корень интенсивности гистограммы флуоресценции интенсивности липосомы калибровки. Fit гистограммы с журналом нормального распределения и извлечь среднюю интенсивность флуоресценции липосомы калибровки, как геометрическое среднее. Чтобы определить связь между интенсивностью квадратного корня и липосомой размера, вычислить фактор коррекции, разделив средний диаметр липосомы, полученный от динамических измерений рассеяния света с геометрическим средним интенсивности квадратного корня.Рассчитайте квадратные значения интенсивности корней для липосом в эксперименте композиционной неоднородности и преобразуйте эти два диаметра путем умножения с фактором коррекции. Участок значение соотношения интенсивности, как функция диаметра для композиционных липосом неоднородности, таким образом, достижение неоднородности в качестве функции липосомного размера для популяции липосом, охватывающих от примерно 50 нанометров до 800 нанометров. В этом протоколе, успешная иммобилизация поверхности липосомы была немедленно очевидна после добавления липосомного раствора в камеру, указанную дифракцией ограниченных пятен интенсивности.Рекомендуется обездвижить достаточно липосомы для достижения плотности от 300 до 400 липосом на кадр. Более низкая плотность делает анализ данных более трудоемким, в то время как более высокая плотность затрудняет различие одиночных липосом. Если все поле зрения находится не в должном фокусе, образец пластины может быть наклона.Кроме того, если липосомы кажутся большими и размытыми, это указывает на то, что буфер в камере мог испариться и поверхность высохла. Гистограммы соотношения интенсивности обычно показывают гауссийское распределение вокруг среднего значения соотношения. Если наблюдаются сильные отклонения от гауссийского распределения, это указывает на проблему чувствительности обнаружения, предполагая, что подмножество липосом, показывающих более слабый сигнал, было исключено.После установки гистограммы соотношения интенсивности с гауссийской функцией, степень значения неоднородности 0,23 была переведена на 32% населения, отличающегося более чем на 23% от среднего соотношения молара ансамбля. Было установлено, что количественная оценка экспериментальной неопределенности составляет 0,1. Анализ никогда не будет лучше, чем материалы, которые вы используете так высокое качество неиламинарных липосом имеют важное значение.Поэтому, когда вы готовите их, не срезать любые углы, такие как оставляя замораживания оттепели циклов. Плохие изображения приведут к высокой экспериментальной неопределенности и заставить вас переоценить неоднородность, так что найтмите время, чтобы приобрести хорошие в фокусе изображения. Что анализ в основном сделать, это изучить плотность поверхности флуоресцентной этикетки.Если этот флуоресцентный ярлык находится на перк изолированных липидов, то этот анализ может быть использован для качества тест липосомы для доставки наркотиков. Установка была применена для изучения того, как пептиды связываются с мембранами и чувствуют кривизну. Это дало исследователям уникальные идеи молекулярных сигналов, которые регулируют, как пептиды сортируются внутри клеток.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Количественный и временной контроль кислорода микроокружения в Единой Иле уровня

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Медикаментозная сенсибилизация АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ: Анализ Рационализация и Миниатюризация для малого молекул и миРНК отбора заявок

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Орбитальная слежения в модифицированной двухфотонного микроскопа: Приложение к отслеживая внутриклеточного везикулы

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Анализируя смешивания неоднородности в микрожидкостных устройств по Микромасштабные шлирен техники

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Флуоресценции зонда биомембрана Сила: Параллельное Количественное рецептор-лиганд кинетики и привязка вызванной внутриклеточной сигнализации на одну ячейку

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Одной молекулы флуоресцентной микроскопии на Planar Поддерживаемые Бислои

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Многоцветная флуоресценция обнаружения для дроплета Microfluidics Использование оптических волокон

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Инжиниринг Признание Молекулярный с Био-мимических Полимеры на одностенных углеродных нанотрубках

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Microfluidic платформа сверхвысокой пропускной способности для одной ячейки генома

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...