Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
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Este trabajo fue financiado por el Consejo Danés de Investigaciones Independientes [número de subvención 5054-00165B].

1. Preparación de liposomas
NOTA: Brevemente, la preparación de liposomas generalmente incluye tres pasos cruciales: 1) preparación de películas de lípidos secos de la composición lipídica deseada; 2) rehidratación de los lípidos para la formación de liposomas; y 3) controlar el tamaño y lamelaridad de la población de liposomas.
<ol><li>Pesar los lípidos y disolverlos en tert-butanol:agua (9:1) en viales de vidrio.<ol>
<li>Disolver POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosfocolin...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. 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B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

Es importante tener en cuenta que si bien describimos en detalle cómo el ensayo de liposomas individuales se puede utilizar para estudiar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales, la plataforma es muy versátil. Como se ha mostrado y discutido anteriormente en la introducción, el protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar aspectos de la fusión membrana-membrana, interacciones proteína-membrana o caracterización portadora de fármacos liposomal. Para cualquier pregunta científica que se a...

Los liposomas son vesículas esféricas a base de fosfolípidos que se utilizan en gran medida tanto en la investigación básica como en la aplicada. Funcionan como excelentes sistemas de modelos de membrana, ya que sus propiedades fisioquímicas se pueden manipular fácilmente variando los componentes lipídicos que componen el liposoma1,2. Además, los liposomas constituyen el sistema de nanoportadores de administración de fármacos más utilizado, ofreciendo una mejor farmacocinética y farmacodinámica, así como una alta biocompatibilidad3.
Durante muchos años, los liposomas se han estudiado principalmente utilizando técnicas a granel, dando sólo acceso a los valores de lectura promedio del conjunto. Esto ha llevado a la mayoría de estos estudios a suponer que todos los liposomas en el conjunto son idénticos. Sin embargo, estos valores promediados por conjunto solo son correctos si el conjunto de datos subyacente se distribuye uniformemente alrededor del valor medio, pero puede representar una conclusión falsa y sesgada si el conjunto de datos incluye varias poblaciones independientes, por ejemplo. Además, suponiendo que el conjunto signifique representar a toda la población puede pasar por alto la información contenida dentro de la inhomogeneidad entre liposomas. Sólo recientemente han surgido ensayos cuantitativos que son capaces de sondear liposomas individuales, revelando grandes inhomogeneidades entre liposomas individuales con respecto a propiedades fisicoquímicas importantes incluyendo liposomas tamaño4, composición de lípidos5,6,y encapsulación eficiencia7, destacando la importancia de estudiar liposomas en el nivel de liposomas individuales.
Un área de investigación donde el promediado de conjunto de propiedades de liposomas se ha demostrado para sesgar los resultados está estudiando las interacciones proteína-membrana dependientes del tamaño de liposomas8,9. Tradicionalmente, los investigadores que estudian estos procesos se han limitado a la preparación de liposomas con diferentes diámetros medios de conjunto por extrusión a través de filtros con diferentes tamaños de poros 9. Sin embargo, la extracción del diámetro de los liposomas individuales utilizando ensayos de liposomas individuales ha revelado grandes solapamientos de población, con liposomas extruidos utilizando filtros de 100 nm y 200 nm que muestran hasta un 70% de superposición en su distribución de tamaño4. Esto podría sesgar severamente las mediciones a granel de las interacciones proteína-membrana dependientes del tamaño liposoma10. Realizando los estudios de interacción membrana-proteína utilizando el ensayo de un solo liposomas, los investigadores en su lugar aprovecharon el tamaño-polidispersidad dentro de la muestra, lo que les permite estudiar una amplia gama de diámetros de liposoma dentro de cada experimento individual, facilitando nuevos descubrimientos de cómo la curvatura de la membrana y la composición pueden afectar el reclutamiento de proteínas a las membranas4,11,12. Otro campo donde la aplicación de ensayos de un solo liposoma ha demostrado ser instrumental es en estudios mecánicos de fusión de membrana mediada por proteínas13,14. Para tales mediciones cinéticas, la capacidad de estudiar eventos de fusión individuales alivió la necesidad de la sincronización experimental del proceso de fusión, permitiendo nuevas perspectivas mecanicistas que de otro modo se habrían perdido en el promedio espaciotemporal realizado en mediciones de conjuntos a granel. Además, se han utilizado liposomas individuales como andamio de membrana, permitiendo la medición de proteínas individuales y ofreciendo nuevos conocimientos sobre la dinámica estructural de proteínas transmembranas15,16. Además, tales configuraciones basadas en proteoliposomas hicieron posible estudiar la función de los transportadores transmembranas individuales17 y los complejos proteicos formados poros18, así como el mecanismo de los péptidos bioactivos permeabilizadores de membrana19. Los liposomas individuales también se han utilizado como nanofluídicos de materia blanda con liposomas individuales inmovilizados en superficie que sirven como cámaras para reacciones enzimáticas en volúmenes de 10-19 L, aumentando el rendimiento y la complejidad de los ensayos de cribado con un consumo mínimo de producto20.
Recientemente, ensayos de liposomas individuales se han utilizado para caracterizar liposomas de administración de medicamentos en un nivel de detalle previamente sin pre-enpreenented. Los investigadores fueron capaces de cuantificar inhomogeneidades significativas en la cantidad de polímero unido a la superficie de liposomas individuales21. Los ensayos de un solo liposomas también permitieron mediciones de liposomas de administración de fármacos en medios complejos, como plasma sanguíneo, revelando cómo los elementos anclados a la superficie liposoma a través de anclajes lipídicos pueden ser susceptibles a la disociación cuando los liposomas están expuestos a condiciones que imitan a los experimentados durante la circulación in vivo22. En general, la versatilidad y utilidad de los ensayos de un solo liposo se corroboran por la gran variedad de problemas que estas configuraciones se han empleado para abordar, y imaginamos que la metodología continuará desarrollándose y encontrando uso en nuevos campos científicos.
Aquí describimos un ensayo de liposomas único basado en microscopía de fluorescencia que permite estudiar liposomas individuales de una manera de alto rendimiento(Figura 1). Para ilustrar el método, lo usamos para cuantificar el tamaño y la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales dentro de un conjunto. El ensayo emplea imágenes de microscopio de fluorescencia de liposomas individuales inmovilizados en una superficie de vidrio pasivado. Primero describimos los pasos críticos en el proceso de fabricación de liposomas que asegura el etiquetado y la inmovilización adecuados de liposomas fluorescentes. A continuación, describimos la preparación de la superficie necesaria para facilitar la inmovilización de liposomas antes de esbozar el procedimiento para asegurar densidades superficiales de liposomas adecuadas. Discutimos los parámetros de microscopía importantes para adquirir imágenes de alta calidad y delinear cómo realizar un análisis de datos simple, permitiendo la extracción de tamaño de liposomas e inhomogeneidad compositiva. Este protocolo genérico debe proporcionar una buena base para que el investigador interesado desarrolle el ensayo para su interés específico de investigación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

La mayoría de las investigaciones que emplean liposomas como sistemas de modelos de membrana o portadores de administración de fármacos se basa en técnicas de lectura a granel y por lo tanto intrínsecamente asume que todos los liposomas del conjunto son idénticos. Sin embargo, las nuevas plataformas experimentales capaces de observar liposomas a nivel de una sola partícula han hecho posible realizar estudios altamente sofisticados y cuantitativos sobre interacciones proteína-membrana o propiedades portadoras de fármacos en liposomas individuales, evitando así errores derivados del promedio del conjunto. Aquí presentamos un protocolo para preparar, detectar y analizar liposomas individuales mediante un ensayo de microscopía basado en fluorescencia, facilitando tales mediciones de una sola partícula. La configuración permite tomar imágenes de liposomas individuales de forma paralela masiva y se emplea para revelar el tamaño intramuestra y las inhomogeneidades compositivas. Además, el protocolo describe las ventajas de estudiar liposomas a nivel de liposomas individuales, las limitaciones del ensayo y las características importantes a tener en cuenta al modificarlo para estudiar otras preguntas de investigación.

Siguiendo el protocolo descrito permite crear imágenes de liposomas individuales de forma paralela masiva(Figura 1). La inmovilización superficial exitosa de liposomas debe ser inmediatamente evidente tras la adición de la solución de liposomas a la cámara (paso 3.6 en el protocolo) ya que las manchas de intensidad limitada de difracción deben aparecer en la imagen(Figura 1B y Figura 1<...

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A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Este protocolo describe la fabricación de liposomas y cómo estos pueden ser inmovilizados en una superficie e imágenes individualmente de una manera paralela masiva utilizando microscopía de fluorescencia. Esto permite la cuantificación del tamaño y la inhomogeneidad compositiva entre los liposomas individuales de la población.

Un ensayo de liposomio único basado en microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

La mayoría de las investigaciones con liposomas se basan en técnicas audaces que intrínsecamente asumen que todos los liposomas son idénticos. Mediante el estudio de liposomas individuales, se pueden observar inhomogeneidades significativas. La única técnica de liposomas presentada aquí nos permite estudiar cientos de liposomas simultáneamente y detectar inhomogeneidades en su tamaño y composición.El método se puede ajustar fácilmente para estudiar otros sistemas en un solo nivel de liposomas como interacciones de membrana proteica. Todo lo que necesitas es que el compuesto que estudias sea etiquetado fluorescentemente. Con este video, proporcionamos a los investigadores la herramienta sobre cómo pueden realizar estudios de liposomas individuales.Esperamos que esté claro que el ensayo se puede modificar fácilmente para estudiar una serie de otros temas científicos. Para empezar, mezclar las reservas de lípidos preparadas 138 microlitros de POPC y 120 microlitros de colesterol en un vial de vidrio fresco. A continuación, añada 500 microlitros cada uno de los dos lípidos con etiqueta fluorescente y 50 microlitros de DSPE-PEG-biotina.Afloje la tapa del vial de vidrio y congele el vial en nitrógeno líquido durante uno o dos minutos. Liofilizar la mezcla de lípidos congelados durante la noche en un secador de congelación. Por la mañana, añadir un mililitro de 200 militros D-sorbitol tampón a los lípidos secos.Calienta la mezcla a 45 grados Centígrados y exponga a la agitación magnética durante al menos una hora. A continuación, congele la suspensión de lípidos sumergiendo el vial en nitrógeno líquido y espere hasta que la suspensión esté completamente congelada. A continuación, sumerja la suspensión congelada en un baño de calefacción a 55 grados centígrados hasta que la mezcla esté completamente descongelada.Exponer la mezcla a un total de 11 ciclos de congelación y descongelación. Después de eso, usando un mini kit de extrusión, extruya la suspensión liposoma una vez a través de un filtro de policarbonato de 800 nanómetros. Mezclar 1.200 microlitros de BSA y 120 microlitros de biotina BSA.Añadir 300 microlitros de la mezcla a cada pozo en un portaobjetos de ocho pozos e incubar el portaobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Incline ligeramente la corredera y desde el borde de cada pozo aspirar el medio. Agregue inmediatamente 300 microlitros de tampón HEPES en cada pozo para lavar.Lavar cada pozo ocho veces en total. Añadir 250 microlitros de estreptavidina e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Repita los ocho lavados como se describió anteriormente.Coloque la diapositiva en el microscopio y ajuste el joystick del microscopio para centrarse en la superficie de la cámara. Esto se puede hacer fácilmente usando la señal de reflexión láser aumentada de la interfaz del búfer de vidrio como guía. En un tubo de microcentrífuga, añadir 10 microlitros del caldo de liposoma diluido que contenga 20 lípidos totales micromolares.Transfiera 100 microlitros de tampón desde la cámara al tubo de microcentrífuga, mezcle correctamente y transfiera los 110 microlitros de nuevo a la cámara. Poner la cámara bajo el microscopio y utilizar un ajuste de microscopio rudimental capaz de detectar la señal de los fluoróforos liposomas para observar los liposomas que se inmovilizan en la superficie. Configure el microscopio como se describe en el manuscrito.Para imaginar los fluoróforos DOPE ATTO488 y DOPE ATTO655 en los liposomas, imagine varios canales. Asegúrese de que cada canal se toma una imagen secuencial para evitar la excitación cruzada. Por ejemplo, primero tome una imagen apasionante a 488 nanómetros y la emisión de lectura a 495 a 590 nanómetros.A partir de entonces, cambie la configuración y tome otra imagen a partir de 633 nanómetros, pero la emisión de lectura sólo a 660 a 710 nanómetros. Analizar. En el menú de imágenes, elija color y utilice la función de canal de fusión para crear un compuesto de los dos canales. Observe si los liposomas en dos canales diferentes muestran una buena co-localización o si se produjo una deriva visible.Para detectar partículas, abra el menú de plugins, elija ComDet y haga clic en detectar partículas. En ComDet, compruebe que la configuración es correcta y pulse OK. Después de ejecutar el análisis, se muestran dos ventanas emergentes con resultados y resumen. La tabla de resultados contiene la relación de intensidad entre los dos canales.Exporte los resultados de la tabla de datos que contienen los datos de co-localización. Ajuste el histograma de la relación de intensidad con una función gaussiana y extraiga la media y la desviación estándar. La media y la desviación estándar se pueden utilizar para calcular el grado de inhomogeneidad.Preparar una formulación liposoma que ha sido extruida varias veces a través de un filtro de 50 nanómetros. Calibre el tamaño de los liposomas comparando la intensidad de la fluorescencia con los datos de tamaño de DLS. Con los mismos ajustes experimentales del microscopio que anteriormente, imagine los liposomas de calibración.Trazar un histograma de intensidad de raíz cuadrada de la intensidad de fluorescencia de los liposomas de calibración. Ajuste el histograma con una distribución normal del registro y extraiga la intensidad media de fluorescencia de los liposomas de calibración como la media geométrica. Para determinar la relación entre la intensidad de la raíz cuadrada y el tamaño del liposoma, calcule el factor de corrección dividiendo el diámetro liposoma promedio obtenido de las mediciones dinámicas de dispersión de luz con la media geométrica de la intensidad de la raíz cuadrada.Calcular valores de intensidad de raíz cuadrada para los liposomas en el experimento de inhomogeneidad compositiva y convertir estos dos diámetros multiplicando con el factor de corrección. Trazar el valor de la relación de intensidad en función del diámetro de los liposomas de inhomogeneidad compositiva, logrando así la inhomogeneidad en función del tamaño del liposoma para una población de liposomas que abarcan desde aproximadamente 50 nanómetros hasta 800 nanómetros. En este protocolo, la inmovilización superficial exitosa de liposomas fue inmediatamente evidente tras la adición de la solución de liposoma a la cámara indicada por las manchas de intensidad limitada de difracción.Se recomienda inmovilizar suficientes liposomas para lograr una densidad de 300 a 400 liposomas por fotograma. Una densidad más baja hace que el análisis de datos consuma más tiempo, mientras que una mayor densidad hace que sea difícil distinguir liposomas individuales. Si todo el campo de visión no está en el foco adecuado, la placa de muestra podría estar inclinada.Además, si los liposomas parecen grandes y borrosos, esto indica que el tampón en la cámara podría haberse evaporado y la superficie seca. Los histogramas de la relación de intensidad suelen revelar una distribución gaussiana alrededor de un valor de relación media. Si se observan fuertes desviaciones de una distribución gaussiana, indica un problema de sensibilidad de detección que sugiere que se ha excluido un subconjunto de liposomas que muestran una señal más débil.Después de ajustar el histograma de la relación de intensidad con una función gaussiana, se tradujo un grado de valor de inhomogeneidad de 0,23 al 32% de la población que diferenció en más del 23% de la relación molar media del conjunto. Se encontró que la cuantificación de la incertidumbre experimental era 0,1. El ensayo nunca será mejor que los materiales que usas, por lo que los liposomas unilaminar de alta calidad son esenciales.Por lo tanto, cuando los prepare, no corte ninguna esquina, como dejar fuera los ciclos de congelación y descongelación. Las imágenes deficientes conducirán a una gran incertidumbre experimental y te harán sobreestimar la inhomogeneidad, así que tómate el tiempo para adquirir buenas imágenes enfocadas. Lo que el ensayo básicamente hace es estudiar la densidad superficial de la etiqueta fluorescente.Si esta etiqueta fluorescente está en un lípido percolado, entonces este ensayo se puede utilizar para probar liposomas de prueba de calidad para la administración de medicamentos. La configuración se ha aplicado para estudiar cómo los péptidos se unen a las membranas y detectar la curvatura. Esto ha dado a los investigadores una visión única de las señales moleculares que gobiernan cómo se clasifican los péptidos dentro de las células.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Control cuantitativo y temporal del Microambiente oxígeno en el Islote de un solo nivel

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Investigación

Bioingeniería

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analizando Mezcla falta de homogeneidad en un dispositivo de microfluidos por Microscale Schlieren Técnica

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

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Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

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