Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

Detta arbete finansierades av det danska rådet för självständig forskning [Grant Number 5054-00165B].

1. Liposom förberedelse
Anmärkning: kortfattat, beredning av liposomer innehåller vanligtvis tre viktiga steg: 1) beredning av torra lipidfilmer av önskad lipidsammansättning; 2) rehydrering av lipider för bildandet av liposomer; och 3) kontrollera storleken och lamellariteten hos Liposom populationen.
<ol><li>Väg ut lipiderna och lös upp dem i tert-butanol: vatten (9:1) i injektionsflaskor av glas.<ol>
<li>Lös POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin; MW = 760 g/mol) till 50...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+spots:+Complex+phase+behavior+in+simple+membranes.">Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+curved+membranes+recruit+amphipathic+helices+and+protein+anchoring+motifs.">How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs.</a> Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Elizondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+Preparation+Route+on+the+Supramolecular+Organization+of+Lipids+in+a+Vesicular+System.">Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).</li><li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Inhomogeneity+in+the+Lipid+Composition+of+Individual+Nanoscale+Liposomes.">Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li><li>Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+Efficiency+Measured+on+Single+Small+Unilamellar+Vesicles.">Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).</li><li>Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intermediates+in+SNARE-induced+membrane+fusion.">Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).</li><li>Fix, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+membrane+fusion+events+mediated+by+SNARE+proteins.">Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

Det är viktigt att notera att medan vi beskriver i detalj hur den enda liposomer analysen kan användas för att studera sammansättningen inhomogenitet mellan enskilda liposomer, plattformen är mycket mångsidig. Som tidigare visats och diskuterats i inledningen, kan protokollet lätt anpassas för att studera aspekter av membran-membran fusion, protein-membran interaktioner, eller liposomalt drog bärare karakterisering. För alla vetenskapliga frågor som tas upp, kraften i den enda Liposom analysen ligger i förmå...

Liposomer är sfäriska fosfolipidbaserade vesikler som används tungt både i grundläggande och tillämpad forskning. De fungerar som utmärkta membran modellsystem, eftersom deras fysiokemiska egenskaper lätt kan manipuleras genom att variera lipidkomponenterna som utgör Liposom1,2. Också, liposomer utgör den mest använda drogen leverans nanocarrier system, erbjuder förbättrad farmakokinetik och farmakodynamik samt hög biokompatibilitet3.
Under många år har liposomer främst studerats med hjälp av bulktekniker, vilket ger endast tillgång till ensemblernas genomsnittliga Läs-och skrivvärden. Detta har lett till att majoriteten av dessa studier förutsätter att alla liposomer i ensemblen är identiska. Sådana värden i ensemblen är dock bara korrekta om den underliggande datauppsättningen är jämnt fördelad runt medelvärdet, men kan representera en falsk och partisk slutsats om datauppsättningen innehåller flera oberoende populationer, till exempel. Dessutom, förutsatt att ensemblen betyder att representera hela befolkningen kan bortse från den information som hyste inom inhomogeniteten mellan liposomer. Först nyligen har kvantitativa analyser framkommit som kan sond enstaka liposomer, avslöjar stora inhomogenitetsmätningar mellan enskilda liposomer med avseende på viktiga fysikalisk-kemiska egenskaper inklusive Liposom storlek4, lipid sammansättning5,6, och inkapsling effektivitet7, belyser vikten av att studera liposomer på den enda Liposom nivå.
Ett forskningsområde där Ensemble medelvärde av Liposom egenskaper har visat sig bias resultat studerar Liposom storlek beroende protein-membran interaktioner8,9. Traditionellt, forskare som studerar sådana processer har begränsats till att förbereda liposomer med olika Ensemble genomsnittliga diametrar genom extrudering genom filter med olika porstorlek9. Emellertid, extrahera diametern av enskilda liposomer med enda Liposom analyser har avslöjat stora befolknings överlappningar, med liposomer extruderad med 100 nm och 200 nm filter visar upp till 70% överlappning i deras storleksfördelning4. Detta kan allvarligt bias bulk mätningar av Liposom storlek beroende protein-membran interaktioner10. Utföra membran-protein interaktionsstudier med den enda Liposom analysen, forskarna i stället drog fördel av storleken-polydispersitet i provet, så att de kan studera ett brett spektrum av Liposom diametrar inom varje enskilt experiment, att underlätta nya upptäckter av hur membran krökning och sammansättning kan påverka protein rekrytering till membran4,11,12. Ett annat område där tillämpningen av enstaka Liposom analyser har visat sig instrumentella är i mekanistiska studier av protein-medierad membran fusion13,14. För sådana kinetiska mätningar, förmågan att studera enskilda fusions händelser lindras behovet av experimentell synkronisering av fusionsprocessen, vilket möjliggör nya mekanistiska insikter som annars skulle ha försvunnit i den spatiotemporal medelvärdes mätningar som gjorts i bulk ensemble. Dessutom har enstaka liposomer använts som en membran ställning, vilket gör det möjligt att mäta enskilda proteiner och erbjuda ny kunskap om transmembranproteinstrukturdynamik15,16. Dessutom har sådana proteoliposome-baserade uppställningar gjort det möjligt att studera funktionen hos enskilda transmembrantransportörer17 och Porbildande proteinkomplex18 samt mekanismen för bioaktiva membran-permeabiliserande peptider19. Enstaka liposomer har också använts som mjuk materia nanofluidik med utanpåliggande singelliposomer som fungerar som kammare för enzymatiska reaktioner i volymer på 10-19 L, vilket ökar genomflödet och komplexiteten hos screening analyserna med minimal produkt åtgång20.
Nyligen, enstaka Liposom analyser har använts för att karakterisera drogen leverans liposomer på en tidigare unprecenbucklig detaljnivå. Forskarna kunde kvantifiera betydande inhomogenitetsmätningar i mängden polymer fäst vid ytan av enskilda liposomer21. Den enda Liposom analyser tillät också mätningar av läkemedelsleverans liposomer i komplexa medier, såsom blodplasma, avslöjar hur element förankrade till Liposom ytan genom lipid ankare kan vara mottagliga för dissociation när liposomer utsätts för förhållanden imitera de upplevt under in vivo cirkulation22. Sammantaget är mångsidigheten och nyttan av den enda Liposom analyser bekräftas av den stora variation av problem dessa inställningar har använts för att ta itu med, och vi föreställa att metoden kommer att fortsätta att utvecklas och hitta användning i nya vetenskapliga områden.
Här beskriver vi en fluorescensmikroskopi-baserad enda Liposom analys som gör att enskilda liposomer kan studeras i en hög genomströmning sätt (figur 1). För att illustrera metoden använder vi den för att kvantifiera storleken och sammansättningen av inhomogeniteten mellan enskilda liposomer inom en ensemble. Analysen sysselsätter fluorescens Mikroskop avbildning av enskilda liposomer immobiliserade på en passive rad glasyta. Vi beskriver först de kritiska stegen i Liposom tillverkningsprocessen som säkerställer korrekt fluorescerande Liposom märkning och immobilisering. Sedan, vi beskriver den ytbehandling som behövs för att underlätta Liposom immobilisering innan beskriver förfarandet för att säkerställa lämpliga Liposom ytdensiteter. Vi diskuterar mikroskopi parametrar viktigt för att förvärva högkvalitativa bilder och avgränsa hur man utför enkel dataanalys, vilket gör utvinning av Liposom storlek och kompositionella inhomogenitet. Detta generiska protokoll bör ge en god grund för den intresserade forskaren att utveckla analysen ytterligare för hans eller hennes specifika forskningsintresse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

De flesta forskning som sysselsätter liposomer som membran modellsystem eller läkemedel leverans bärare förlitar sig på bulk Läs-ut tekniker och därmed i sig förutsätter att alla liposomer i ensemblen vara identiska. Nya experimentella plattformar som kan observera liposomer på enpartikelnivå har dock gjort det möjligt att utföra mycket sofistikerade och kvantitativa studier av protein-membraninteraktioner eller läkemedelsbärar egenskaper på enskilda liposomer, därmed undvika fel från Ensemble medelvärdes. Här presenterar vi ett protokoll för beredning, detektering och analys av enstaka liposomer med hjälp av en fluorescensbaserad mikroskopi-analys som underlättar sådana enpartikelmätningar. Installationen möjliggör avbildning enskilda liposomer i ett massivt parallellt sätt och används för att avslöja intra-Sample storlek och sammansättning inhomogeneities. Dessutom, protokollet beskriver fördelarna med att studera liposomer på den enda Liposom nivå, begränsningarna av analysen, och de viktiga funktioner som ska beaktas när du ändrar den för att studera andra forskningsfrågor.

Efter det beskrivna protokollet gör det möjligt att avbilda enstaka liposomer på ett massivt parallellt sätt (figur 1). Den framgångsrika ytan immobilisering av liposomer bör omedelbart framgå vid tillsats av Liposom lösning till kammaren (steg 3,6 i protokollet) som diffraktion begränsad intensitet fläckar bör visas i bilden (figur 1B och figur 1C).
<...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Detta protokoll beskriver tillverkningen av liposomer och hur dessa kan immobiliseras på en yta och avbildas individuellt i ett massivt parallellt sätt med fluorescens mikroskopi. Detta gör det möjligt att kvantifiera storleken och sammansättningen ohomogenitet mellan enskilda liposomer av befolkningen.

En kvantitativ fluorescensmikroskopi-baserad Singelliposomanalys för att detektera sammansättningen av Inhomogeniteten mellan enskilda Lipoer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

De flesta forskning med liposomer förlita sig på djärva tekniker i sig antar alla liposomer vara identiska. Genom att studera enstaka liposomer kan signifikanta inhomogeniteter observeras. Den enda liposom teknik som presenteras här tillåter oss att studera hundratals liposomer samtidigt och upptäcka inhomogeniteter i deras storlek och sammansättning.Metoden kan enkelt justeras för att studera andra system på en enda liposomnivå såsom proteinmembraninteraktioner. Allt du behöver är föreningen du studerar för att vara fluorescerande märkt. Med denna video ger vi forskare med verktyget om hur de kan utföra enstaka liposomstudier.Vi hoppas att det är tydligt att analysen lätt kan modifieras för att studera en rad andra vetenskapliga ämnen. Till att börja, blanda de beredda lipidbestånden 138 mikroliter av POPC och 120 mikroliter av kolesterol i en färsk glasflaska. Tillsätt sedan 500 mikroliter vardera av två fluorescerande märkta lipider och 50 mikroliter DSPE-PEG-biotin.Lossa locket på glasflaskan och snäpp frysa injektionsflaskan i flytande kväve i en till två minuter. Lyofilisera den frusna lipidblandningen över natten i en frystork. På morgonen, tillsätt en milliliter av 200 millimolar D-sorbitol buffert till de torra lipider.Värm blandningen till 45 grader Celsius och utsätt den för magnetisk omrörning i minst en timme. Frys sedan ned lipidupphängningen genom att doppa injektionsflaskan i flytande kväve och vänta tills suspensionen är helt frusen. Därefter doppa den frusna suspensionen i ett värmebad vid 55 grader Celsius tills blandningen är helt tinad.Exponera blandningen för totalt 11 frys-töcykler. Efter det, med hjälp av en mini extrudering kit, extrudera liposom fjädringen en gång genom en 800 nanometer polykarbonat filter. Blanda 1, 200 mikroliter av BSA och 120 mikroliter av BSA biotin.Tillsätt 300 mikroliter av blandningen till varje brunn i en åtta-brunns slide och inkubera bilden i 20 minuter vid rumstemperatur. Något luta bilden och från kanten av varje brunn aspirera mediet. Tillsätt omedelbart 300 mikroliter av HEPES buffert i varje brunn att tvätta.Tvätta varje brunn åtta gånger totalt. Tillsätt 250 mikroliter streptavidin och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Upprepa de åtta tvättar som tidigare beskrivits.Placera objektglaset på mikroskopet och justera mikroskop joysticken för att fokusera på kammarens yta. Detta kan enkelt göras med hjälp av den ökade laserreflektionssignalen från glasbuffertgränssnittet som guide. I ett mikrocentrifugrör, tillsätt 10 mikroliter av det utspädda liposomstocken innehållande 20 mikromolar total lipid.Överför 100 mikroliter av buffert från kammaren till mikrocentrifugröret, blanda ordentligt, och överför 110 mikroliter tillbaka till kammaren. Sätt kammaren under mikroskopet och använd en rudimental mikroskop inställning som kan upptäcka signal från liposom fluoroforer att observera liposomer som immobiliseras på ytan. Sätt upp mikroskopet som beskrivs i manuskriptet.Att avbilda både DOPE ATTO488 och DOPE ATTO655 fluoroforer i liposomer, bild flera kanaler. Kontrollera att varje kanal avbildas sekventiellt för att undvika korsutformning. Till exempel, först ta en bild genom spännande på 488 nanometer och avläsning utsläpp på 495 till 590 nanometer.Därefter ändrar du inställningarna och tar en annan bild genom att spännande vid 633 nanometer men avläsningsemission endast vid 660 till 710 nanometer. Analysera. I bildmenyn väljer du färg och använd funktionen för kopplingskanal för att skapa en sammansatt av de två kanalerna. Observera om liposomerna som avbildas i två olika kanaler visar god samlokalisering eller om synlig avdrift inträffade.För att upptäcka partiklar, öppna plugins menyn, välj ComDet och klicka på upptäcka partiklar. Kontrollera i ComDet att inställningarna är korrekta och tryck på OK. Efter att ha kört analysen, två popup fönster med resultat och sammanfattning show. Resultattabellen innehåller intensitetsförhållandet mellan de två kanalerna.Exportera datatabellresultaten som innehåller samlokaliseringsdata. Montera intensitetsförhållandet histogram med en Gaussisk funktion och extrahera medelvärdet och standardavvikelsen. Medelvärdet och standardavvikelsen kan användas för att beräkna graden av inhomogenitet.Förbered en liposomformulering som har extruderats flera gånger genom ett 50 nanometerfilter. Kalibrera storleken på liposomerna genom att jämföra fluorescensintensiteten med storleksdata från DLS. Med samma experimentella mikroskopinställningar som tidigare, bild kalibreringen liposomer.Rita en kvadratisk rot intensitet histogram av fluorescens intensitet kalibreringen liposomer. Montera histogrammet med en log normalfördelning och extrahera den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos kalibreringsliposomerna som det geometriska medelvärdet. För att bestämma förhållandet mellan kvadratrotens intensitet och liposomstorlek, beräkna korrigeringsfaktorn genom att dividera den genomsnittliga liposomdiametern som erhålls från de dynamiska ljusspridningsmätningarna med kvadratrotintensitetens geometriska medelvärde.Beräkna kvadratiska rotintensitetsvärden för liposomerna i kompositionsinhomogenitetsexperimentet och omvandla dessa två diametrar genom att multiplicera med korrektionsfaktorn. Plotta intensitetsförhållandets värde som en funktion av diameter för den kompositionella inhomogeniteten liposomer, och uppnår på så sätt inhomogeniteten som en funktion av liposomstorlek för en population av liposomer som spänner från cirka 50 nanometer till 800 nanometer. I detta protokoll var den framgångsrika ytan immobilisering av liposomer omedelbart framgår vid tillägg av liposom lösning till kammaren anges av diffraction begränsad intensitet fläckar.Det rekommenderas att immobilisera tillräckligt liposomer för att uppnå en densitet på 300 till 400 liposomer per ram. En lägre densitet gör dataanalysen mer tidskrävande medan en högre densitet gör det utmanande att skilja enstaka liposomer. Om hela synfältet inte är i rätt fokus kanske provplattan lutar.Dessutom, om liposomerna verkar stora och suddiga, indikerar detta bufferten i kammaren kan ha avdunstat och ytan torkat ut. Intensiteten förhållandet histogram avslöjar vanligtvis en Gaussisk fördelning runt ett medelvärde förhållandet värde. Om starka avvikelser från en Gaussisk fördelning observeras, indikerar det en detektionskänslighetsfråga som tyder på att en delmängd av liposomer som visar en svagare signal har uteslutits.Efter montering intensitet förhållandet histogram med en Gaussisk funktion, en grad av inhomogenitet värde av 0,23 översattes till 32%av befolkningen skiljer sig med mer än 23%från medelvärdet molar förhållandet av ensemblen. Kvantifieringen av den experimentella osäkerheten konstaterades vara 0,1. Analysen kommer aldrig att bli bättre än de material du använder så hög kvalitet unilaminar liposomer är viktiga.Så när du förbereder dessa, inte klippa några hörn såsom att lämna ut frys-tö cykler. Dåliga bilder kommer att leda till hög experimentell osäkerhet och gör att du överskattar inhomogeniteten så ta dig tid att skaffa bra i fokus bilder. Vad analysen i grunden gör är att studera ytdensiteten hos den fluorescerande etiketten.Om denna fluorescerande etikett är på en percolated lipid, då denna analys kan användas för att kvalitetstesta liposomer för drug delivery. Upplägget har applicerats för att studera hur peptider binder till membran och känner av krökningen. Detta har gett forskarna unika insikter i de molekylära ledtrådar som styr hur peptider sorteras inuti celler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Kvantitativ och Temporal Kontroll av syremikromiljö vid den inre Islet nivå

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Läkemedelsinducerad Sensibilisering av adenylylcyklas: Assay Renodling och miniatyrisering för småmolekylära och siRNA Screening Program

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifierad Två-foton Mikroskop: En ansökan till spårning av intracellulära vesiklar

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Från Snabb fluorescens avbildning till molekylär diffusion lagen om Live cellmembran i en kommersiell mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analysera Blandning homogen i en mikroflödessystem enhet med Micro Schlieren Teknik

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Samtidig kvantifiering av receptor-ligand Kinetics och bindning-inducerad intracellulär signalering på en enda cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enda molekyl fluorescensmikroskopi på Planar bilayers stöds

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multifluorescensdetektion för dropp Mikrofluidik Använda optiska fibrer

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Engineering Molekylär igenkänning med Bio-mimetiska Polymers på Single vägg kolnanorör

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En ultrahög kapacitet mikroflödessystem plattform för Single-cell Genomsekvensering

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...