Name: a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

Bu çalışma Danimarka Bağımsız Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmiştir [hibe numarası 5054-00165B].

1. Lipozom Hazırlığı
NOT: Kısaca, lipozomların hazırlanması genellikle üç önemli adımı içerir: 1) istenilen lipid bileşimikuru lipid filmlerin hazırlanması; 2) lipozom oluşumu için lipidlerin rehidrasyon; ve 3) lipozom popülasyonunun boyutunu ve lamellaritesini kontrol eder.
<ol><li>Lipidler tartmak ve tert-butanol onları eritin:su (9:1) cam şişelerde.<ol>
<li>Popc çözünme (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin; MW = 760 g/mol) ila 50 mM.</li>
		<li>Kolesterolü...

<ol>
	<li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Veatch, S. L., Keller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+spots:+Complex+phase+behavior+in+simple+membranes.">Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+curved+membranes+recruit+amphipathic+helices+and+protein+anchoring+motifs.">How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs.</a> Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Elizondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+Preparation+Route+on+the+Supramolecular+Organization+of+Lipids+in+a+Vesicular+System.">Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).</li><li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Inhomogeneity+in+the+Lipid+Composition+of+Individual+Nanoscale+Liposomes.">Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li><li>Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+Efficiency+Measured+on+Single+Small+Unilamellar+Vesicles.">Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).</li><li>Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+bends+the+laws+of+physics+and+chemistry.">Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry.</a> Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).</li><li>Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+mechanism+accounts+for+sensing+of+membrane+curvature+by+BAR+domains,+amphipathic+helices+and+membrane-anchored+proteins.">A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).</li><li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing.">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases.">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).</li><li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment.">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li><li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intermediates+in+SNARE-induced+membrane+fusion.">Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).</li><li>Fix, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+membrane+fusion+events+mediated+by+SNARE+proteins.">Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+"Selected"+upon+Allosteric+Regulation.">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li><li>Mathiasen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+high-content+analysis+using+compositional+heterogeneities+of+single+proteoliposomes.">Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes.</a> Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).</li><li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase.">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li><li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function.">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li><li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization.">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li><li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics.">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li><li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level.">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).</li><li>M&#252;nter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies.">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li><li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles:+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance.">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li><li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Formulation+Method,+Lipid+Composition,+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity:+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study.">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li><li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements:+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles.">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li><li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Label+Wisely:+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers.">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).</li></ol>

Tek lipozom ların tek lipozomlar arasındaki bileşimsel homojenliği incelemek için nasıl kullanılabileceğini ayrıntılı olarak açıklarken, platformun çok yönlü olduğunu belirtmek önemlidir. Daha önce gösterildiği ve giriş tartışılan gibi, protokol kolayca membran-membran füzyon yönlerini incelemek için adapte edilebilir, protein-membran etkileşimleri, veya lipozomal ilaç taşıyıcı karakterizasyonu. Ele alınması gereken herhangi bir bilimsel soru için, tek lipozom test gücü topluluğun ...

Lipozomlar hem temel hem de uygulamalı araştırmalarda yoğun olarak kullanılan küresel fosfolipid bazlı veziküllerdir. Onlar mükemmel membran model sistemleri olarak işlev, onların fizyokimyasal özellikleri kolayca lipozom oluşturan lipid bileşenleri değiştirerek manipüle edilebilir çünkü1,2. Ayrıca, lipozomlar gelişmiş farmakokinetiği ve farmakodinamik yanı sıra yüksek biyouyumluluksunan,en çok kullanılan ilaç dağıtım nanocarrier sistemi oluşturmaktadır 3 .
Uzun yıllar boyunca, lipozomlar öncelikle toplu teknikler kullanılarak incelenmiştir, sadece topluluk ortalama okuma değerlerine erişim veren. Bu topluluk taki tüm lipozomlar aynı olduğunu varsaymak için bu çalışmaların çoğunluğu yol açmıştır. Ancak, bu tür topluluk ortalaması değerleri yalnızca temel veri kümesi ortalama değer etrafında eşit olarak dağıtılırsa doğrudur, ancak veri kümesi örneğin birden çok bağımsız popülasyon içeriyorsa yanlış ve önyargılı bir sonucu temsil edebilir. Ayrıca, topluluk tüm nüfusu temsil etmek anlamına geldiğini varsayarak lipozomlar arasında inhomogeneity içinde barındırılan bilgileri göz ardı edebilirsiniz. Sadece son zamanlarda tek lipozomlar araştırmak mümkün kantitatif tahliller ortaya çıktı, lipozom boyutu da dahil olmak üzere önemli fizyochemical özellikleri ile ilgili bireysel lipozomlar arasında büyük inhomojeniteler ortaya ortaya çıktı4, lipid bileşimi5,6, ve kapsülleme verimliliği 7 , tek lipozom lar çalışma önemini vurgulayan7.
Lipozom özellikleri topluluk ortalama önyargı sonuçları gösterilmiştir bir araştırma alanı lipozom boyutuna bağlı protein-membranetkileşimleri8 ,9çalışıyor . Geleneksel olarak, bu tür süreçleri inceleyen araştırmacılar farklı gözenek boyutları9filtreler aracılığıyla ekstrüzyon tarafından farklı topluluk ortalama çapları ile lipozomlar hazırlanması için sınırlı olmuştur. Ancak, tek lipozom ların çapıtek lipozomların tek lipozom larının çıkarılması büyük popülasyon örtüşmelerini ortaya çıkarmıştır, lipozomlar 100 nm ve 200 nm filtreleri kullanarak ekstrüzyon ile% 70'e kadar kendi boyut dağılımı4çakışma gösteren . Bu ciddi lipozom boyutuna bağlı protein-membran etkileşimleri10toplu ölçümler önyargı olabilir. Tek lipozom testini kullanarak membran-protein etkileşim imasını gerçekleştiren araştırmacılar, bunun yerine numunenin içindeki boyut-polidispersitlikten yararlanarak, her bir deneyde çok çeşitli lipozom çaplarını incelemelerine olanak sağlayarak, membran eğriliği ve bileşiminin membranlara protein alımını nasıl etkileyebileceğine dair yeni keşifler kolaylaştırıyorlar4,11,12. Tek lipozom tahlilleri uygulama enstrümantal kanıtlamıştır başka bir alan protein aracılı membran füzyon mekanistik çalışmalarda13,14. Bu tür kinetik ölçümler için, bireysel füzyon olaylarını inceleme yeteneği, füzyon sürecinin deneysel senkronizasyonuna olan ihtiyacı hafifleterek, toplu topluluk ölçümlerinde yapılan spatiotemporal ortalamada kaybolacak yeni mekanistik anlayışlara olanak sağladı. Ayrıca, tek lipozomlar bir membran iskele olarak kullanılmıştır, bireysel proteinlerin ölçümü sağlayan ve transmembran protein yapısal dinamiği yeni bilgi sunan15,16. Ayrıca, bu tür proteolipozom tabanlı kurulumlar mümkün bireysel transmembran taşıyıcılar17 ve gözenek oluşturan protein kompleksleri18 fonksiyonu yanı sıra biyoaktif membran geçirimli peptidlermekanizmasının incelenmesi mümkün kı. Tek lipozomlar da 10-19 L hacimlerinde enzimatik reaksiyonlar için oda olarak hizmet veren yüzey immobilize tek lipozomlar ile yumuşak madde nanofluidics olarak kullanılmıştır, en az ürün tüketimi ile tarama tahlillerinin hacmi ve karmaşıklığını artırarak20.
Son zamanlarda, tek lipozom tahlilleri daha önce önceden haber verilmemiş bir ayrıntı düzeyinde ilaç dağıtım lipozomları karakterize etmek için kullanılmıştır. Araştırmacılar bireysel lipozomların yüzeyine bağlı polimer miktarı önemli inhomogeneities ölçmek başardık21. Tek lipozom tahlilleri de karmaşık ortamda ilaç teslim lipozomölçümleri izin, kan plazması gibi, lipozomlar ile lipozom lar aracılığıyla lipozom yüzeyine demirlemiş elemanların dissosiyasasyona duyarlı olabilir ortaya22. Genel olarak, tek lipozom tahlillerinin çok yönlülüğü ve kullanışlılığı, bu kurulumların ele alınması için kullanılan çok çeşitli sorunlarla kanıtlanmıştır ve metodolojinin geliştirilmeye ve yeni bilimsel alanlarda kullanılmaya devam edeceğini öngörüyoruz.
Burada, tek tek lipozomların yüksek iş lenme şeklinde incelenmesini sağlayan floresan mikroskopesi bazlı tek lipozom testini tanımlıyoruz (Şekil 1). Yöntemi göstermek için, bir topluluk içinde bireysel lipozomlar arasındaki boyut ve kompozisyon yamajenliğini ölçmek için kullanırız. Titre, pasif cam yüzeyüzerinde hareketsiz hale getirilen tek lipozomların floresan mikroskop görüntülemesini kullanır. Biz ilk uygun floresan lipozom etiketleme ve immobilizasyon sağlayan lipozom üretim sürecinde kritik adımları açıklar. Daha sonra, uygun lipozom yüzey yoğunluklarını sağlamak için prosedürü ana hatlarıyla özetlemeden önce lipozom immobilizasyonkolaylaştırmak için gerekli yüzey hazırlığı açıklar. Yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için önemli olan mikroskopi parametrelerini tartışıyoruz ve basit veri analizinin nasıl yapılacağını, lipozom boyutunun ve bileşimsel homojenliğin çıkarılmasına izin verilebildiğini anlatıyoruz. Bu genel protokol, ilgilenen araştırmacının kendi özel araştırma ilgi alanı için daha fazla araştırma yapmak için daha fazla araştırma yapması için iyi bir temel oluşturmalıdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well microscopy slides (&#181; slides)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Microscopy slides with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini Extrusion kit</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto488</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD488-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-Atto655</td>
			<td>Atto-Tech</td>
			<td>AD655-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPE-PEG-Biotin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Brown Chromatography</td>
			<td>150903</td>
			<td>Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate w. Magnet stirring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of heating to minimum 65C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Including container for storage, e.g. Rubber-bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring bars</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442-4520 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086 (EU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>71686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td>Traded trough Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td>
			<td>Honeywell Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>24127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. MilliQ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative fluorescence microscopy-based single liposome assay for detecting the compositional inhomogeneity between individual liposomes

Membran model sistemleri veya ilaç dağıtım taşıyıcıları olarak lipozomların çoğunun toplu okuma tekniklerine dayandığını ve böylece özünde topluluğun tüm lipozomlarının aynı olduğunu varsayar. Ancak, tek parçacık düzeyinde lipozomları gözlemleyebilen yeni deneysel platformlar, bireysel lipozomlarda protein-membran etkileşimleri veya ilaç taşıyıcı özellikleri üzerinde son derece gelişmiş ve kantitatif çalışmalar yapılmasını mümkün kılabilir, böylece topluluk ortalama gelen hataları kaçınarak. Burada floresan bazlı mikroskopi testini kullanarak tek lipozomların hazırlanması, saptandırılmasını ve analiz ini sağlayan ve bu tür tek parçacık ölçümlerini kolaylaştıran bir protokol sıyoruz. Kurulum büyük bir paralel şekilde bireysel lipozomların görüntülenmesi için izin verir ve intra-örnek boyutu ve bileşimsel inhomojenlikleri ortaya çıkarmak için kullanılır. Ayrıca, protokol tek lipozom düzeyinde lipozomlar çalışma avantajları açıklar, test sınırlamaları, ve diğer araştırma soruları çalışmak için değiştirerek dikkat edilmesi gereken önemli özellikleri.

Açıklanan protokolü n ardından, tek lipozomların büyük bir paralel şekilde görüntülenebilmektedir (Şekil 1). Lipozomların başarılı yüzey immobilizasyonu, lipozom çözeltisinin hazneye eklenmesiyle hemen belirgin olmalıdır (protokolde 3.6 adım) çünkü görüntüde kırınım sınırlı yoğunluk noktaları görünmelidir(Şekil 1B ve Şekil 1C)....

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes at JoVE.com

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Bu protokol lipozomların imalatını ve bunların bir yüzeyüzerinde nasıl hareketsiz hale getirilebildiğini ve floresan mikroskopi kullanılarak büyük bir paralel şekilde tek tek nasıl görüntülenebileceğini açıklar. Bu, popülasyonun tek lipozomları arasındaki boyutun ve bileşimsel homojenliğin nicelikselleştirilmesine olanak sağlar.

Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Lipozomlar ile en araştırma cesur teknikler özünde tüm lipozomlar aynı olduğunu varsayarak güveniyor. Tek lipozomlar incelenerek önemli inhomojeniteler görülebilir. Burada sunulan tek lipozom tekniği, yüzlerce lipozom'u aynı anda incelememize ve boyut ve kompozisyonlarındaki homojenlikleri tespit etmemize olanak sağlar.Yöntem kolayca protein membran etkileşimleri gibi tek bir lipozom düzeyinde diğer sistemleri incelemek için ayarlanabilir. İhtiyacınız olan tek şey floresan etiketli olmak için çalışma bileşiktir. Bu video ile, araştırmacılara tek lipozom çalışmalarını nasıl yapabilecekleri konusunda bir araç salıyoruz.Biz bu tsay kolayca diğer bilimsel konularda bir dizi çalışma için değiştirilebilir açık olduğunu umuyoruz. Başlamak için, taze bir cam şişe de POPC 138 mikrolitre ve kolesterol 120 mikrolitre hazırlanan lipid stokları karıştırın. Daha sonra her biri floresan olarak etiketlenmiş iki lipid ve 50 mikrolitre DSPE-PEG-biotin 50 mikrolitre ekleyin.Cam şişenin kapağını gevşetin ve şişeyi sıvı nitrojen içinde 1-2 dakika dondurun. Bir dondurma kurutucu bir gecede dondurulmuş lipid karışımı lyophilize. Sabah, kuru lipidler için 200 milimolar D-sorbitol tampon bir mililitre ekleyin.Karışımı 45 dereceye ısıtın ve en az bir saat boyunca manyetik karıştırmaya maruz bırakın. Daha sonra sıvı nitrojen şişe daldırma ve süspansiyon tamamen dondurulana kadar bekleyin lipid süspansiyon dondurun. Daha sonra, karışım tamamen çözülene kadar 55 santigrat derece bir ısıtma banyosunda dondurulmuş süspansiyon daldırma.Karışımı toplam 11 donma-çözülme döngüsüne maruz bırakın. Bundan sonra, bir mini ekstrüzyon kiti kullanarak, bir kez 800 nanometre polikarbonat filtre ile lipozom süspansiyon ekstrüzyon. 1, 200 mikrolitre BSA ve 120 mikrolitre BSA biotin'i karıştırın.Sekiz kuyulu bir slaytta her kuyuya 300 mikrolitre karışım ekleyin ve kaydırağı oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Slama hafifçe yatırın ve her birinin kenarından ortamı yerleştirin. Hemen her kuyuya 300 mikrolitre HEPES tampon ekleyin.Her kuyuda toplam sekiz kez yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca streptavidin 250 mikrolitre ekleyin ve kuluçka. Daha önce açıklandığı gibi sekiz yıkıntıtekrarlayın.Skalı mikroskoba yerleştirin ve mikroskop joystick'ini odanın yüzeyine odaklanacak şekilde ayarlayın. Bu kolayca bir kılavuz olarak cam tampon arayüzü artan lazer yansıma sinyali kullanılarak yapılabilir. Bir mikrosantrifüj tüp, 20 mikromolar toplam lipid içeren seyreltilmiş lipozom stok 10 mikrolitre ekleyin.100 mikrolitre tamponu hazneden mikrosantrifüj tüpüne aktarın, düzgün cerenle ve 110 mikrolitreyi hazneye geri aktarın. Mikroskop altında oda koymak ve lipozom lar yüzeyde hareketsiz olan lipozomlar gözlemlemek için lipozom floropores gelen sinyal tespit yeteneğine sahip bir rudimental mikroskop ayarı kullanın. El yazmasında açıklandığı gibi mikroskobu ayarlayın.Lipozomlarda hem DOPE ATTO488 hem de DOPE ATTO655 floroporları görüntülemek için birden fazla kanalı görüntüleyin. Çapraz uyarmayı önlemek için her kanalın sırayla görüntülediğinden emin olun. Örneğin, ilk 488 nanometre heyecan verici ve 495-590 nanometre emisyon okuma tarafından bir görüntü almak.Bundan sonra, ayarları değiştirmek ve 633 nanometre heyecan verici ama sadece 660-710 nanometre emisyon okuma başka bir görüntü almak. Analiz. Görüntü menüsünde, renk seçin ve iki kanal bir bileşik oluşturmak için birleştirme kanalı işlevini kullanın. İki farklı kanalda görüntülenen lipozomların iyi bir eş yerelleştirme gösterip göstermediğini veya görünür sürüklenme olup olmadığını gözlemleyin.Parçacıkları algılamak için eklentiler menüsünü açın, ComDet'i seçin ve parçacıkları algıla'yı tıklatın. ComDet'te ayarların doğru olup olmadığını kontrol edin ve Tamam'a basın. Analizi çalıştırdıktan sonra, sonuçları ve özet göstermek ile iki açılır pencere. Sonuç tablosu, iki kanal arasındaki yoğunluk oranını içerir.Ortak yerelleştirme verilerini içeren veri tablosu sonuçlarını dışa aktarın. Gaussfonksiyonu ile yoğunluk oranı histogram uygun ve ortalama ve standart sapma ayıklayın. Ortalama ve standart sapma, homojenlik derecesini hesaplamak için kullanılabilir.50 nanometrelik bir filtre ile birkaç kez ekstrüzyon edilmiş bir lipozom formülasyonu hazırlayın. Floresan yoğunluğunu DLS'den alınan boyut verileriyle karşılaştırarak lipozomların boyutunu kalibre edin. Daha önce olduğu gibi aynı deneysel mikroskop ayarları ile kalibrasyon lipozomları görüntü.Kalibrasyon lipozomlarının floresan yoğunluğunun kare kök yoğunluğu histogramını çizin. Bir günlük normal dağılımı ile histogram sığdırın ve geometrik ortalama olarak kalibrasyon lipozomların ortalama floresan yoğunluğu ayıklayın. Kare kök yoğunluğu ile lipozom boyutu arasındaki ilişkiyi belirlemek için, dinamik ışık saçılma ölçümlerinden elde edilen ortalama lipozom çapını kare kök yoğunluğunun geometrik ortalamasıyla bölerek düzeltme faktörünü hesaplayın.Bileşimsel homojenlik deneyindeki lipozomlar için kare kök yoğunluğu değerlerini hesaplayın ve düzeltme faktörüile çarparak bu iki çapı dönüştürün. Bileşimsel homojenlik lipozomlar için çapın bir fonksiyonu olarak yoğunluk oranı değerini çizin, böylece yaklaşık 50 nanometreden 800 nanometreye kadar uzanan lipozom popülasyonu için lipozom boyutunun bir fonksiyonu olarak homojenliği elde edin. Bu protokolde, lipozomların başarılı yüzey immobilizasyonu, lipozom çözeltisinin kırınım sınırlı yoğunluk noktaları ile belirtilen odaya eklenmesiyle hemen ortaya çıkmıştır.Bu çerçeve başına 300 ila 400 lipozom yoğunluğu elde etmek için yeterli lipozomlar immobilize önerilir. Daha düşük bir yoğunluk veri analizini daha fazla zaman alıcı hale getirirken, daha yüksek bir yoğunluk tek lipozomları ayırt etmeyi zorlaştırır. Tüm görüş alanı düzgün odaklanmıyorsa, örnek plaka eğimli olabilir.Ayrıca, lipozomlar büyük ve bulanık görünüyorsa, bu odadaki tamponun buharlaştığını ve yüzeyin kuruduğunu gösterir. Yoğunluk oranı histogramlar genellikle ortalama oran değeri etrafında bir Gauss dağılımı ortaya koymaktadır. Gaussdağılımından güçlü sapmalar gözlenirse, daha zayıf bir sinyal gösteren bir lipozom alt kümesinin dışlandığını düşündüren bir algılama duyarlılığı sorunu gösterir.Gauss fonksiyonu ile yoğunluk oranı histogram ı tutturduktan sonra, 0.23'lük bir homojenlik değeri, topluluğun ortalama azı azı oranının %23'ünden fazla sınanarak nüfusun %32'sine çevrildi. Deneysel belirsizliğin nicelikselliği 0.1 olarak bulunmuştur. Tsay çok yüksek kaliteli unilaminar lipozomlar esastır kullandığınız malzemelerden daha iyi asla.Bu nedenle bunları hazırlarken, donma-çözülme döngülerini dışarıda bırakmak gibi köşeleri kesmeyin. Kötü görüntüler yüksek deneysel belirsizliğe yol açacak ve homojenliği abartmanızı sağlayacak, bu yüzden iyi odaklama görüntüleri elde etmek için zaman ayırın. Titrenin temel olarak yaptığı şey floresan etiketin yüzey yoğunluğunu incelemektir.Bu floresan etiket percolated lipid üzerinde ise, o zaman bu test ilaç teslimi için kaliteli test lipozomlar için kullanılabilir. Kurulum peptidler membranlar bağlamak ve eğrilik duygusu nasıl çalışma için uygulanmıştır. Bu, araştırmacılara peptidlerin hücrelerin içinde nasıl sıralandığını yöneten moleküler ipuçlarına benzersiz bilgiler vermiştir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Tek Adacık Düzeyde Oksijen mikroçevresinin Nicel ve Geçici Kontrol

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Mikro Schlieren Tekniği ile bir mikroakışkan Aygıt karıştırma homojen Analizi

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Tek Karbon Nanotüp Bio-mimetik Polimerler ile Mühendislik Moleküler Tanıma

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...