Name: in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et vedvarende IMPACT tilskud (IPAP201601422) og Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ anerkender også modtagelsen af en australsk postgraduate Award fra University of Sydney. Vi vil gerne takke Mr. pat piansarakit og MS Morgan Jones for hjælp med monocyt isolation og vævskultur.

HMDM blev isoleret fra Human Buffy coat præparater leveret af Blood bank med etik godkendelse fra Sydney Local Health District.
1. HMDM-kulturen
<ol><li>Isoler monocytterne fra Buffy coat præparater fremstillet af det perifere blod af raske humane donorer ved hjælp af en kommercielt tilgængelig forberedelse til at isolere lymfocytter, efterfulgt af modstrøms centrifugal elutriation19, 20.</li>
	<li>Bekræft tilstedeværelsen af...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation:+implication+for+the+inflammatory+disease+condition.">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).</li><li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypochlorous+acid+(HOCl)+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation.">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival.">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li><li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminase+inhibition+reduces+vascular+damage+and+modulates+innate+immune+responses+in+murine+models+of+atherosclerosis.">Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis.</a> Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).</li><li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis.">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).</li><li>Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Footprints+of+neutrophil+extracellular+traps+as+predictors+of+cardiovascular+risk.">Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).</li><li>Goldmann, O., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+world+of+extracellular+traps:+not+only+neutrophils+but+much+more.">The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more.</a> Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+derived+from+macrophages,+mast+cells,+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis.">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Extracellular+Traps:+A+Scoping+Review.">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+low-density+lipoprotein+results+in+the+time-dependent+accumulation+of+cholesteryl+esters+and+apolipoprotein+B-100+protein+in+primary+human+monocyte-derived+macrophages.">Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages.</a> FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).</li><li>Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production.">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li><li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+&#176;C+to+35+&#176;C.">The acid ionization constant of HOCl from 5 &#176;C to 35 &#176;C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li><li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid.">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li></ol>

Generering og visualisering af MARKEDSført dannelse ved hjælp af M1-differentierede Hmdm'er er en ny in vitro-model, der kan være nyttig til at undersøge den potentielle patologiske rolle for disse makrofagstrukturer, især under Kronisk inflammatorisk Betingelser. Det giver en robust protokol til stimulering af primære humane makrofager at frigive METs, som også kan udnyttes i relaterede undersøgelser med humane monocyt eller murine makrofag cellelinjer. Den vellykkede gennemførelse af denne protokol til stimule...

Frigivelsen af ETs fra neutrofiler blev først identificeret som en medfødte immunrespons udløst af bakteriel infektion1. De består af en DNA-rygrad, som forskellige granulat proteiner med antibakterielle egenskaber er bundet til, herunder neutrofilelastase og myeloperoxidase2. Den primære rolle for neutrofileter (NETs) er at fange patogener og lette deres eliminering3. Men ud over den beskyttende rolle af ETs i immunforsvaret, et stigende antal undersøgelser har også opdaget en rolle i sygdoms patogenese, især under udviklingen af betændelse-drevne sygdomme (dvs. reumatoid arthritis og åreforkalkning4). Frigivelsen af ETS kan udløses af forskellige pro-inflammatoriske cytokiner, herunder interleukin 8 (Il-8) og tumor nekrose faktor Alpha (tnfα)5,6, og den lokaliserede ophobning af ETS kan øge vævsskader og fremkalde en Pro-inflammatorisk respons7. For eksempel, ETs har været impliceret som spiller en kausal rolle i udviklingen af åreforkalkning8, fremme trombose9, og forudsige hjerte-kar-risiko10.
Det er nu anerkendt, at ud over neutrofiler, andre immunceller (dvs., mastceller, eosinofile, og makrofager) kan også frigive ETS på udsættelse for den mikrobielle eller pro-inflammatoriske stimulation11,12. Dette kan være særlig vigtigt i tilfælde af makrofager, i betragtning af deres centrale rolle i udviklingen, reguleringen, og løsning af kroniske inflammatoriske sygdomme. Derfor er det vigtigt at få en større forståelse af det potentielle forhold mellem ET udslip fra makrofager og betændelse-relaterede sygdomsudvikling. Nylige undersøgelser har vist tilstedeværelsen af METs og NETs i intakt menneskelige aterosklerotiske plaques og organiseret trombi13. På samme måde har METs været impliceret i at køre nyreskade gennem reguleringen af inflammatoriske responser14. Men i modsætning til neutrofiler er der begrænsede data om mekanismerne for MARKEDSført dannelse fra makrofager. Nylige undersøgelser med humane in vitro-modeller af MARKEDSført dannelse viser nogle forskelle i de veje, der er involveret i hver celletype (dvs. med hensyn til fraværet af Histon citrulklination med makrofager)6. Men, nogle har vist, at netto frigivelse kan også forekomme i fravær af Histon citrulination15.
Det overordnede mål med denne protokol er at tilvejebringe en enkel og direkte metode til vurdering af frigivelse af markedsøkonomisk behandling i en klinisk relevant makrofag-model. Der er en række forskellige in vitro-makrofag cellemodeller, der er blevet brugt til at studere METs (dvs. den humane monocyt cellelinje i THP-1 og forskellige murine makrofag cellelinjer)16. Der er nogle begrænsninger forbundet med disse modeller. For eksempel, differentieringen af THP-1 monocytter til makrofager normalt kræver en priming trin, såsom tilsætning af phorbols myristate acetat (PMA), som selv aktiverer protein kinase C (PKC)-afhængige veje. Denne proces er kendt for at udløse ET Release4 og resulterer i en lav basal met frigivelse fra THP-1 celler. Andre undersøgelser har fremhævet nogle forskelle i Bioaktivitet og inflammatoriske reaktioner, som er monteret af makrofager in vivo sammenlignet med PMA-behandlede THP-1-celler17.
Tilsvarende, adfærd og inflammatoriske reaktioner af forskellige murine makrofag-lignende cellelinjer ikke helt repræsentere respons spektrum af primære humane makrofager18. Med henblik på at undersøge makrofag ET dannelse i kliniske omgivelser menes primære humane monocyte-afledte makrofager (Hmdm'er) at være en mere relevant model snarere end monocytiske eller murine makrofag-lignende cellelinjer.
ET udslip fra M1 polariserede Hmdm'er er blevet påvist efter eksponering af disse celler for en række forskellige inflammatoriske stimuli, herunder den myeloperoxidaseafledte oxidant hypochlorøse syre (HOCl), PMA, TNFα og IL-86. Beskrevet her er en protokol til polarisere HMDMs til M1 fænotype og visualisere efterfølgende MØDTE frigivelse ved udsættelse for disse inflammatoriske stimuli. PMA anvendes som et incitament for markedsført frigivelse til at lette sammenligninger med tidligere undersøgelser, der har brugt neutrofiler. Vigtigere, HOCl, IL-8, og TNFα bruges også til at stimulere MET frigivelse, som menes at være bedre modeller af det inflammatoriske miljø in vivo. Den mikroskopiske metode til visualisering af ET-udslip indebærer farvning af det ekstracellulære DNA i levende cellekulturer ved hjælp af SYTOX grøn, en uigennemtrængelig fluorescerende grøn nukleinsyre bejdsning, der er blevet anvendt med succes i tidligere neutrofilundersøgelser. Denne metode giver mulighed for hurtig og kvalitativ vurdering af ET udslip, men det er ikke hensigtsmæssigt som en stand-alone metode til kvantificering af ET Release omfang. Der bør anvendes alternative metoder, hvis der kræves kvantificering for at sammenligne omfanget af ET udslip, der skyldes forskellige behandlingsforhold eller indgreb.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120Q broad spectrum fluorescent light source</td>
			<td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>24606</td>
			<td>Characterisation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14025050</td>
			<td>For washing steps and HOCl treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorous acid (HOCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>PMC4031</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>rhil-4</td>
			<td>For M2 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 8</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-943</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59202C</td>
			<td>Added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td>1114544</td>
			<td>For isolation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>For washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For MET visulaization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-200 brightfield light source</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>300-01A-50</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages

Frigivelsen af ekstracellulære fælder (ETs) med neutrofiler er blevet identificeret som en medvirkende faktor til udviklingen af sygdomme relateret til kronisk inflammation. Neutrofileter (NETs) består af et net af DNA, Histon proteiner og forskellige granulater (dvs. myeloperoxidase, elastase og cathepsina G). Andre immunceller, herunder makrofager, kan også producere ETs; men i hvilket omfang dette sker in vivo, og om makrofag ekstracellulære fælder (METs) spiller en rolle i patologiske mekanismer er ikke blevet undersøgt i detaljer. For bedre at forstå rollen af METs i inflammatoriske patologier blev der udviklet en protokol til visualisering af markedsført frigivelse fra primære humane makrofager in vitro, som også kan udnyttes i immunofluorescens eksperimenter. Dette giver mulighed for yderligere karakterisering af disse strukturer og deres sammenligning med ETs frigivet fra neutrofiler. Humane monocyte-afledte makrofager (HMDM) producerer METs ved udsættelse for forskellige inflammatoriske stimuli efter differentiering til M1 Pro-inflammatorisk fænotype. Frigivelsen af METs kan visualiseres ved mikroskopi ved hjælp af en grøn fluorescerende nukleinsyre pletter, der er imperment til levende celler (f. eks SYTOX grøn). Brug af frisk isolerede primære makrofager, såsom HMDM, er fordelagtigt i modellering in vivo inflammatoriske hændelser, der er relevante for potentielle kliniske anvendelser. Denne protokol kan også anvendes til at studere mødte frigivelse fra humane monocyt cellelinjer (f. eks, THP-1) efter differentiering i makrofager med phorbols myristate acetat eller andre makrofag cellelinjer (f. eks murine makrofag-lignende J774A. 1 celler).

Brightfield-billeder, der viser de morfologiske ændringer af HMDM som reaktion på stimuli for Celledifferentiering, vises i figur 1. M1 polariserede makrofager fra eksperimenter med HMDM eksponeret for IFNγ og LPS viste en aflang og spindel-lignende celle form, som indikeret af de sorte pile i figur 1 (midterste panel). Til sammenligning var morfologien af m2 polariserede makrofager efter eksponering af HMDM til IL-4 for 48 h typisk rund og flad, som indikere...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Præsenteret her er en protokol til påvisning af makrofag ekstrellulær fælde (MET) produktion i levende cellekultur ved hjælp af mikroskopi og fluorescens farvning. Denne protokol kan udvides yderligere til at undersøge specifikke MARKEDSført protein markører ved immunofluorescens farvning.

In vitro stimulation og visualisering af ekstracellulær fælde frigivelse i differentierede humane monocytter-afledte makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Frigivelsen af ekstracellulære fælder af neutrofiler og andre immunceller er vigtig i medfæstet immunitet, men også stærkt forbundet med inflammatoriske patologier. Meget lidt er kendt om denne proces i makrofager, selv om disse celler spiller en afgørende rolle i inflammatorisk respons. Denne protokol giver en primær menneskelig in vitro model af makrofager ekstracellulære fælde eller mast frigivelse.Det giver en model for os at studere en potentiel fysiologisk vækst af denne struktur in vivo. Den største fordel ved denne teknik er, at cellerne fra denne protokol er primære celler isoleret fra menneskelige buffy pels præparater. Der kræves ingen primingtrin for at differentiere monocytet i makrofager, hvilket står i kontrast til andre monocytcellelinje som THP-1 cellelinje.Denne protokol er let tilpasset til andre immunceller, herunder isolerede neutrofil og mikroglia. Ekstracellulær fælde produceret af makrofager er meget skrøbelige, så der skal tages hensyn mellem skridt til at bevare integriteten af de farvede fælder. Under sterile forhold forberedes M1 priming medium ved at tilføje til den komplette RPMI-1640 kulturmedier, interferon gamma til koncentrationen af 20 nanogram per milliliter og lipopolysaccharid til koncentrationen af et mikrogram pr. milliliter.Forbered M2 priming media ved at tilføje interleukin 4 til den komplette RPMI-1640 kultur medier til koncentrationen af 20 nanogram per milliliter. Under sterile forhold, aspirere medier fra den seedede og dyrkede væv kultur plade brønde, der indeholder HMDM. Tilføj forsigtigt i hver brønd, en milliliter steril PBS forvarmt til 37 grader Celsius.Fjern PBS-bufferen, og vask to ekstra gange. Tilføj en milliliter af enten M1 eller M2 priming medier til hver brønd, der indeholder HMDM. Inkuber cellerne i 48 timer ved 37 grader Celsius i overværelse af 5% kuldioxid i en celleinkubator.Under sterile forhold skal du forberede kulturmediet, der indeholder forskellige stimulatorer af MET-frigivelse til hele RPMI-1640-mediet. Til forsøg med hypochlorsyrestimulation forberedes 200 mikromolar hypochlored syre i et Falcon-rør med HBSS, der er blevet forvarmtet til 37 grader Celsius. Efter polariseringsbehandlingen skal cellemediet aspirere fra hver brønd og omhyggeligt vaske cellerne tre gange med en milliliter aliquots af enten steril PBS for PMA, TNF alpha og interleukin 8 stimulation eller HBSS for hypochlorøsyrestimulation.Når PBS er fjernet i det sidste vasketrin, skal der tilføjes en milliliter komplette medier, der indeholder PMA, TNF alpha eller interleukin 8. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i en celle inkubator i seks timer for TNF alpha stimulation og 24 timer for PMA eller interleukin 8 stimulation. Til forsøg med hypochlorsyre tilsættes en milliliter frisklavet hypochlorsyre efter fjernelse af HBSS i det sidste vasketrin.Derefter inkuberes cellerne i 15 minutter ved 37 grader Celsius i overværelse af 5% kuldioxid i en celle inkubator. Derefter aspirere cellernes supernatant omhyggeligt og cellerne tre gange med en milliliter aliquots af HBSS. Når HBSS er fjernet fra det sidste vasketrin, skal du tilføje en milliliter komplette RPMI-1640-kulturmedier.Derefter inkuberes cellerne i 24 timer ved 37 grader Celsius i overværelse af 5% kuldioxid i en celle inkubator. SYTOX grøn farvestof i HBSS klargør sig ved en koncentration på 40 mikromolar. Tilføj direkte 25 mikroliter af farvestoffet til hver brønd, der indeholder HMDM.Inkuber celler ved stuetemperatur i 5 minutter i mørke. Derefter placere HMDM i væv kultur brønde på mikroskop fase af en omvendt fluorescerende mikroskop til billeddannelse. Tænd for en bredspektret lyskilde, lyskilde med skarpt felt og omvendt mikroskop, der er installeret med et farve digitalt kamera med høj opløsning.Filterhjulet drejes til den to største position for grøn fluorescens med excitation ved 504 nanometer og dimension ved 523 nanometer. Brug 5X objektivet, fokusere billedet med det grove fokus derefter fine fokus knapper på mikroskopet, indtil billedet ser skarpe, klare og fokuserede. Skift mikroskopet til kameratilstand.Start den tilknyttede software. Klik på knappen Afspil for at få vist billedet og justere den fine fokusknap på mikroskopet, indtil billedet ser skarpt, klart og fokuseret ud i softwareeksempelvinduet. Klik på knappen Hent.Klik på Filer i softwaren. Gem som den nødvendige billedfiltype. På mikroskopet skal du dreje filterhjulet til nummer fem-positionen for billeddannelse med lyse felt, og gentag hentningsprocedurerne for at få det tilsvarende lysfeltbillede.Bright-field billeder, der viser de morfologiske ændringer af HMDM som reaktion på stimuli er vist her. M1-polariserede makrofager fra eksperimenter med HMDM udsat for interferon gamma og lipopolysaccharid viste en aflang og spindel-lignende celleform. Til sammenligning var morfologien af de M2-polariserede makrofager efter eksponering af HMDM for interleukin 4 i 48 timer typisk runde og flade.Muligheden for differentierede HMDM fænotyper til at frigive METs blev visualiseret ved live-celle fluorescens imaging med SYTOX grøn. Kontrollen fra hver HMDM fænotype inkuberet i 24 timer i mangel af nogen pro-inflammatoriske stimuli viste meget begrænset grøn farvning. Positiv farvning for METs, vist som grønne striber, blev opnået ved eksponering af M1-HMDMs for hypochlorsyre, PMA, interleukin 8 eller TNF alpha.Tilstedeværelsen af nogle grønne farvning synlige i cellerne afspejler tab af membran integritet, som kan skyldes celledød, der er uafhængig af ekstracellulære fælde frigivelse. De forsøg, der blev udført med M2-HMDMs, der blev eksponeret for interleukin 4, viste ingen frigivelse af DNA fra cellerne, som det fremgår af fraværet af strengene eller striberne af ekstracellulært DNA. Men, der var nogle cellulære optagelse af grønne fluorescerende farvestof med hypochlorsyre og TNF alpha.Det er vigtigt at undgå det direkte klare lys, som kan overeksponere farvning før billeddannelse. Ekstracellulært DNA kan kvantificeres ved qPCR-analyse af nuklear og mitokondrielt DNA, der er til stede i cellesupernatant. Yderligere karakterisering af mast struktur og dens roller i kronisk inflammation ved hjælp af HMDM kan være mere klinisk relevant i forhold til andre udødeliggjorte cellelinje makrofager butikker.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Samtidig infektion model for at studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions i humane primære Monocytafledte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Måling af ekstracellulær DNA udledning og kvantitativ NET Formation i humane neutrofiler<em&gt; In vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Dyrkning af makrofag kolonistimulerende faktor differentierede humane monocytafledte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

A Simple Fluorescens Assay for Kvantificering af Canine Neutrofil Ekstracellulær Trap Frigivelse

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation of Human monocytafledte dendritiske celler fra fuldblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse af Microglia og Monocyt-afledte Makrofager fra Centralnervesystemet ved Flowcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine neutrofile ekstracellulære fælde dannelse: Dynamisk og kvantitativ analyse af Fluorescens mikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...