Name: in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) en Novo Nordisk Foundation Biomedical project Grant (NNF17OC0028990). YZ erkent ook de ontvangst van een Australische postdoctorale onderscheiding aan de Universiteit van Sydney. We willen de heer Pat en mevrouw Morgan Jones bedanken voor de hulp bij de monocyt-isolatie en weefselkweek.

De HMDM waren geïsoleerd van menselijke Buffy vacht preparaten geleverd door de bloedbank met ethische goedkeuring van de Sydney Local Health district.
1. HMDM-cultuur
<ol><li>Isoleer de monocyten van Buffy coat preparaten bereid uit het perifere bloed van gezonde menselijke donoren met behulp van een in de handel verkrijgbare bereiding om lymfocyten te isoleren, gevolgd door tegenstroom centrifugale elutriation19, 20.</li>
	<li>Be...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation:+implication+for+the+inflammatory+disease+condition.">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).</li><li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypochlorous+acid+(HOCl)+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation.">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival.">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li><li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminase+inhibition+reduces+vascular+damage+and+modulates+innate+immune+responses+in+murine+models+of+atherosclerosis.">Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis.</a> Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).</li><li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis.">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).</li><li>Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Footprints+of+neutrophil+extracellular+traps+as+predictors+of+cardiovascular+risk.">Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).</li><li>Goldmann, O., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+world+of+extracellular+traps:+not+only+neutrophils+but+much+more.">The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more.</a> Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+derived+from+macrophages,+mast+cells,+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis.">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Extracellular+Traps:+A+Scoping+Review.">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+low-density+lipoprotein+results+in+the+time-dependent+accumulation+of+cholesteryl+esters+and+apolipoprotein+B-100+protein+in+primary+human+monocyte-derived+macrophages.">Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages.</a> FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).</li><li>Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production.">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li><li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+&#176;C+to+35+&#176;C.">The acid ionization constant of HOCl from 5 &#176;C to 35 &#176;C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li><li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid.">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li></ol>

De generatie en visualisatie van met vorming met M1 gedifferentieerde Hmdm's vertegenwoordigt een nieuw in vitro model dat nuttig kan zijn voor het onderzoeken van de potentiële pathologische rol van deze macrofaag structuren, met name onder chronische inflammatoire Voorwaarden. Het biedt een robuust protocol voor het stimuleren van primaire menselijke macrofagen om METs vrij te geven, die ook kunnen worden gebruikt in gerelateerde studies met humane monocyt of muriene macrofaag cellijnen. De succesvolle implementatie v...

De afgifte van ETs uit neutrofielen werd voor het eerst geïdentificeerd als een aangeboren immuunrespons veroorzaakt door bacteriële infectie1. Ze bestaan uit een DNA-ruggengraat waaraan verschillende korrel eiwitten met antibacteriële eigenschappen gebonden zijn, waaronder neutrofiele elastase en myeloperoxidase2. De primaire rol van neutrofiele ETs (netten) is het opvangen van pathogenen en het vergemakkelijken van hun eliminatie3. Echter, naast de beschermende rol van ETs in immuun verdediging, een toenemend aantal studies hebben ook een rol in de ziekte-pathogenese ontdekt, vooral tijdens de ontwikkeling van ontsteking-gedreven ziekten (dat wil zeggen, reumatoïde artritis en atherosclerose4). De afgifte van ETS kan worden geactiveerd door verschillende pro-inflammatoire cytokines, met inbegrip van Interleukine 8 (Il-8) en tumor necrose factor alpha (tnfα)5,6, en de gelokaliseerde accumulatie van ETS kan weefselschade te verhogen en roepen een pro-inflammatoire respons7. Bijvoorbeeld, ETs zijn betrokken als het spelen van een causale rol in de ontwikkeling van atherosclerose8, bevordering van trombose9, en het voorspellen van cardiovasculaire risico10.
Het wordt nu erkend dat naast neutrofielen ook andere immuuncellen (d.w.z. mestcellen, eosinofielen en macrofagen) ETS kunnen vrijgeven voor blootstelling aan de microbiële of pro-inflammatoire stimulatie11,12. Dit kan bijzonder belangrijk zijn in het geval van macrofagen, gezien hun cruciale rol in de ontwikkeling, regulering en oplossing van chronische ontstekingsziekten. Daarom is het belangrijk om een beter begrip te krijgen van de potentiële relatie tussen ET-vrijlating van macrofagen en ontsteking-gerelateerde ziekte ontwikkeling. Recente studies hebben aangetoond dat de aanwezigheid van Mets en netten in intact menselijke atherosclerotische plaques en georganiseerde trombi13. Evenzo zijn METs betrokken bij het besturen van nierschade door de regulering van ontstekingsreacties14. Echter, in tegenstelling tot neutrofielen, er zijn beperkte gegevens over de mechanismen van MET vorming van macrofagen. Recente studies met behulp van humane in vitro modellen van MET formatie vertonen enkele verschillen in de trajecten die betrokken zijn bij elk celtype (d.w.z. met betrekking tot de afwezigheid van Histon-Citrullinatie met macrofagen)6. Echter, sommige hebben aangetoond dat netto vrijlating kan ook optreden in de afwezigheid van Histon-Citrullinatie15.
Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige en directe methode te bieden om MET vrijgave te beoordelen in een klinisch relevant macrofaag model. Er zijn een aantal verschillende in vitro macrofaag celmodellen die zijn gebruikt om Mets te bestuderen (d.w.z. de thp-1 humane monocyt cellijn en verschillende muriene macrofaag cellijnen)16. Er zijn enkele beperkingen in verband met deze modellen. Bijvoorbeeld, de differentiatie van thp-1 monocyten aan macrofagen meestal vereist een priming stap, zoals de toevoeging van forbol myristaat acetaat (PMA), die zelf activeert proteïne kinase C (PKC)-afhankelijke trajecten. Dit proces is bekend om te activeren ET release4 en resulteert in een lage basale met release van thp-1 cellen. Andere studies hebben gewezen op enkele verschillen in bioactiviteit en ontstekingsreacties die in vivo door macrofagen zijn aangebracht in vergelijking met PMA-behandelde THP-1-cellen17.
Evenzo, het gedrag en inflammatoire reacties van verschillende muriene macrophage-achtige cellijnen niet volledig vertegenwoordigen de respons spectrum van primaire menselijke macrofagen18. Daarom worden met het oog op het onderzoeken van macrofaag et-vorming in de klinische setting, primaire humane monocyte-afgeleide macrofagen (hmdm's) verondersteld een relevanter model te zijn in plaats van monocytische of muriene macrofaag-achtige cellijnen.
ET vrijlating van M1 gepolariseerde HMDMs is aangetoond na blootstelling van deze cellen aan een aantal verschillende ontstekings stimuli, waaronder het myeloperoxidase-afgeleide oxidant hypochloreuze zuur (HOCl), PMA, TNFα en IL-86. Hier beschreven is een protocol voor het polariseren van HMDMs op de M1 fenotype en visualiseer de daaropvolgende ONTMOETTE release bij blootstelling aan deze ontstekings stimuli. PMA wordt gebruikt als een stimulans van de release om vergelijkingen te maken met eerdere onderzoeken die neutrofielen hebben gebruikt. Belangrijker, HOCl, IL-8, en TNFα worden ook gebruikt om te stimuleren MET release, die worden verondersteld te zijn betere modellen van de ontstekings omgeving in vivo. De microscopische methode voor visualisatie van ET-release impliceert het extracellulair DNA in levende celculturen met behulp van SYTOX Green, een ondoorlatende fluorescerende groene nucleïnezuur vlek die met succes is toegepast in eerdere neutrofiele onderzoeken. Deze methode maakt een snelle en kwalitatieve beoordeling van de ET-release mogelijk, maar is niet geschikt als een stand-alone methode voor de kwantificering van ET-vrijgave omvang. Er moet een alternatieve methode worden gebruikt als kwantificering nodig is om de mate van ET-afgifte te vergelijken die voortvloeit uit verschillende behandelings condities of interventies.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120Q broad spectrum fluorescent light source</td>
			<td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>24606</td>
			<td>Characterisation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14025050</td>
			<td>For washing steps and HOCl treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorous acid (HOCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>PMC4031</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>rhil-4</td>
			<td>For M2 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 8</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-943</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59202C</td>
			<td>Added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td>1114544</td>
			<td>For isolation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>For washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For MET visulaization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-200 brightfield light source</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>300-01A-50</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages

De afgifte van extracellulaire vallen (ETs) door neutrofielen is geïdentificeerd als een factor die bijdraagt aan de ontwikkeling van ziekten die verband houden met chronische ontstekingen. Neutrofiele ETS (netten) bestaan uit een Maas van DNA, Histon-eiwitten en diverse korrel proteïnen (d.w.z. myeloperoxidase, elastase en door G). Andere immuuncellen, waaronder macrofagen, kunnen ook ETs produceren; in hoeverre dit in vivo gebeurt en of macrofaag extracellulaire vallen (METs) een rol spelen bij pathologische mechanismen, is niet in detail onderzocht. Om de rol van METs in inflammatoire pathologieën beter te begrijpen, werd een protocol ontwikkeld voor het visualiseren van de introductie van primaire menselijke macrofagen in vitro, die ook kunnen worden misbruikt bij immunofluorescentie experimenten. Dit maakt verdere karakterisering van deze structuren en hun vergelijking met ETs vrijgegeven uit neutrofielen. Humane monocyte-afgeleide macrofagen (HMDM) produceren METs bij blootstelling aan verschillende ontstekings stimuli na differentiatie aan het M1 pro-inflammatoire fenotype. De vrijgave van de METs kan worden gevisualiseerd door microscopie met behulp van een groen fluorescerende nucleïnezuur vlek die ongevoelig is voor levende cellen (bijv. SYTOX groen). Het gebruik van vers geïsoleerde primaire macrofagen, zoals HMDM, is voordelig bij het modelleren in vivo ontstekings gebeurtenissen die relevant zijn voor potentiële klinische toepassingen. Dit protocol kan ook worden gebruikt om te studeren met vrijlating van humane monocyt cellijnen (bv, thp-1) na differentiatie in macrofagen met forbol myristaat acetaat of andere macrofaag cellijnen (bijv. de Murine macrofaag-achtige J774A. 1 cellen).

Brightfield-afbeeldingen met de morfologische veranderingen van HMDM in reactie op stimuli voor celdifferentiatie worden weergegeven in Figuur 1. M1 gepolariseerde macrofagen uit experimenten met HMDM blootgesteld aan IFNγ en LPS vertoonden een langwerpige en spil achtige celvorm, zoals aangegeven door de zwarte pijlen in Figuur 1 (middelste paneel). Ter vergelijking, de morfologie van de m2 gepolariseerde macrofagen na blootstelling van HMDM aan IL-4 voor 48 h...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Hier is een protocol voor het opsporen van macrofaag extracellulaire trap (met) productie in levende celcultuur met behulp van microscopie en fluorescentie kleuring. Dit protocol kan verder worden uitgebreid om specifieke MET eiwit markers te onderzoeken door immunofluorescentie kleuring.

In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Het vrijkomen van extracellulaire vallen door neutrofielen en andere immuuncellen is belangrijk in aangeboren immuniteit, maar ook sterk verbonden met ontstekingspathologieën. Er is zeer weinig bekend over dit proces in macrofagen, hoewel deze cellen een cruciale rol spelen bij ontstekingsrespons. Dit protocol biedt een primaire menselijke in vitro model van macrofagen extracellulaire val of mast release.Het biedt ons een model om een potentiële fysiologische groei van deze structuur in vivo te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de cellen uit dit protocol zijn primaire cellen geïsoleerd van menselijke buffy vacht preparaten. Er is geen priming stap nodig om de monocyet te onderscheiden in macrofagen, wat in contrast staat met andere monocytencellijn zoals THP-1 cellijn.Dit protocol is gemakkelijk aan te passen aan andere immuuncellen, waaronder geïsoleerde neutrofiele en microglia. Extracellulaire val geproduceerd door macrofagen zijn zeer kwetsbaar, dus zorgen moeten worden genomen tussen stap om de integriteit van de gekleurde vallen te behouden. Onder steriele omstandigheden, bereid M1 priming medium door toe te voegen aan de volledige RPMI-1640 cultuur media, interferon gamma aan de concentratie van 20 nanogram per milliliter en lipopolysaccharide aan de concentratie van een microgram per milliliter.Bereid M2 priming media door interleukine 4 toe te voegen aan de volledige RPMI-1640 cultuurmedia aan de concentratie van 20 nanogram per milliliter. Onder steriele omstandigheden, aspirate media uit de gezaaide en gekweekte weefsel kweekplaat putten met HMDM. Voeg voorzichtig in elke put, een milliliter steriele PBS voorverwarmd tot 37 graden Celsius.Verwijder de PBS-buffer en was twee keer extra. Voeg een milliliter van de M1 of M2 priming media aan elke put met de HMDM. Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius in aanwezigheid van 5%kooldioxide in een cel incubator.Bereid onder steriele omstandigheden de kweekmedia met verschillende stimulatoren van de MET-release voor op de volledige RPMI-1640-media. Voor experimenten met hypochlorous zuur stimulatie, bereid 200 micromolar hypochlorous zuur in een Falcon buis met HBSS die is voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Na de polarisatiebehandeling, aspirate de cel media van elke put en zorgvuldig wassen van de cellen drie keer met een milliliter aliquots van ofwel steriele PBS voor PMA, TNF alpha, en interleukine 8 stimulatie of HBSS voor hypochlooeuze zuur stimulatie.Na het verwijderen van de PBS in de laatste wasstap, voeg een milliliter van complete media met PMA, TNF alpha, of interleukine 8. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide in een cel incubator gedurende zes uur voor TNF alpha stimulatie en 24 uur voor PMA of interleukine 8 stimulatie. Voor experimenten met hypochloorzuur, na het verwijderen van de HBSS in de laatste wasstap, voeg een milliliter vers bereide hypochlorous zuur.Vervolgens incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius in aanwezigheid van 5%kooldioxide in een cel incubator. Daarna, zorgvuldig aspirate de cellen'supernatant en was de cellen drie keer met een milliliter aliquots van HBSS. Na het verwijderen van de HBSS uit de laatste wasstap, voeg een milliliter van complete RPMI-1640 cultuur media.Vervolgens broeden de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in de aanwezigheid van 5%kooldioxide in een cel incubator. Bereid SYTOX groene kleurstof in HBSS met een concentratie van 40 micromolar. Voeg direct 25 microliter van de kleurstof toe aan elke put die HMDM bevat.Incubeercellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten in het donker. Plaats vervolgens de HMDM in weefselcultuurputten op het microscoopstadium van een omgekeerde fluorescerende microscoop voor beeldvorming. Schakel een breedspectrum fluorescerende lichtbron, heldere lichtbron en omgekeerde microscoop in die zijn geïnstalleerd met een kleurendigcamera met hoge resolutie.Draai het filterwiel naar de nummer twee positie voor groene fluorescentie met excitatie op 504 nanometer en afmeting op 523 nanometer. Met behulp van de 5X doelstelling, focus het beeld met de grove focus dan de fijne focus knoppen op de microscoop totdat het beeld lijkt scherp, duidelijk en gericht. Schakel de microscoop over naar de cameramodus.Start de bijbehorende software. Klik op de knop Afspelen om een voorbeeld van de afbeelding te bekijken en de fijne focusknop op de microscoop aan te passen totdat de afbeelding scherp, helder en gefocust wordt weergegeven in het voorbeeldvenster van de software. Klik op de knop Vastleggen.Klik in de software op Bestand. Opslaan als het vereiste afbeeldingsbestandstype. Draai op de microscoop het filterwiel naar de positie nummer vijf voor beeldvorming op helder veld en herhaal de opnameprocedures om het bijbehorende beeld van helder veld te verkrijgen.Heldere veldbeelden die de morfologische veranderingen van HMDM in reactie op stimuli tonen worden hier getoond. M1-gepolariseerde macrofagen van experimenten met HMDM blootgesteld aan interferon gamma en lipopolysaccharide toonde een langwerpige en spindel-achtige celvorm. Ter vergelijking, de morfologie van de M2-gepolariseerde macrofagen na blootstelling van HMDM aan interleukine 4 gedurende 48 uur waren meestal rond en plat.Het vermogen van gedifferentieerde HMDM-fenotypes om MET's vrij te geven werd gevisualiseerd door live-cel fluorescentiebeeldvorming met SYTOX groen. De controle verkregen uit elk HMDM-fenotype dat gedurende 24 uur werd geïncubeerd bij afwezigheid van pro-inflammatoire stimuli toonde zeer beperkte groene kleuring. Positieve kleuring voor MET's, weergegeven als groene strepen, werd bereikt met blootstelling van M1-HMDMs aan hypochloorzuur, PMA, interleukine 8 of TNF alpha.De aanwezigheid van een aantal groene vlekken zichtbaar in de cellen weerspiegelt verlies van membraan integriteit die kan voortvloeien uit celdood die onafhankelijk is van extracellulaire val release. De experimenten uitgevoerd met M2-HMDMs blootgesteld aan interleukine 4 toonde geen afgifte van DNA uit de cellen, zoals aangegeven door de afwezigheid van de strengen of strepen van extracellulaire DNA. Echter, er was een cellulaire opname van groene fluorescerende kleurstof met het hypochloorzuur en TNF alpha.Het is belangrijk om te voorkomen dat de directe heldere licht die de kleuring kan overbelichten voordat beeldvorming. Extracellulair DNA kan worden gekwantificeerd door qPCR-analyse op nucleair en mitochondriaal DNA aanwezig in celsupernatant. Verdere karakterisering van de maststructuur en de rol ervan in chronische ontstekingen met behulp van HMDM kan meer klinisch relevant zijn in vergelijking met andere vereeuwigde cellijn macrofagen winkels.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infectie model om te onderzoeken<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacties in menselijke primaire monocyt-afgeleide immuuncellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

A Simple Fluorescence Assay voor het kwantificeren van Canine neutrofielen extracellulaire inklembeveiliging

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...