Name: in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une subvention IMPACT perpétuelle (IPAP201601422) et Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ reconnaît également la réception d'un Australian Postgraduate Award de l'Université de Sydney. Nous tenons à remercier M. Pat Pisansarakit et Mme Morgan Jones pour leur aide dans l'isolement des monocytes et la culture tissulaire.

Les HMDM ont été isolés des préparations de manteau buffy humain fournies par la banque de sang avec l'approbation éthique du district sanitaire local de Sydney.
1. Culture HMDM
<ol><li>Isoler les monocytes des préparations de pelage bouffi préparées à partir du sang périphérique de donneurs humains sains à l'aide d'une préparation disponible dans le commerce pour isoler les lymphocytes, suivie d'une élutriation centrifuge contre-courant19, <s...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+derived+from+macrophages,+mast+cells,+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis.">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Doster, R. 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T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production.">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li><li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+&#176;C+to+35+&#176;C.">The acid ionization constant of HOCl from 5 &#176;C to 35 &#176;C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li><li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid.">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li></ol>

La génération et la visualisation de la formation MET à l'aide de HMDM différenciés M1 représente un nouveau modèle in vitro qui peut être utile pour étudier le rôle pathologique potentiel de ces structures macrophages, en particulier sous inflammatoire chronique Conditions. Il fournit un protocole robuste pour la stimulation des macrophages humains primaires pour libérer des METs, qui peuvent également être utilisés dans des études connexes avec des lignées de cellules de macrophage de monocyte humain ou...

La libération d'ETs des neutrophiles a d'abord été identifiée comme une réponse immunitaire innée déclenchée par une infection bactérienne1. Ils se composent d'une colonne vertébrale de l'ADN à laquelle diverses protéines de granule avec des propriétés antibactériennes sont liés, y compris l'élastase neutrophile et myeloperoxidase2. Le rôle principal des ET neutrophiles (ENe) est de capturer les agents pathogènes et de faciliter leur élimination3. Cependant, en plus du rôle protecteur des ET dans la défense immunitaire, un nombre croissant d'études ont également découvert un rôle dans la pathogénie de la maladie, en particulier pendant le développement de maladies induites par l'inflammation (c.-à-d. la polyarthrite rhumatoïde et l'athérosclérose4). La libération des ET peut être déclenchée par diverses cytokines pro-inflammatoires, y compris l'interleukine 8 (IL-8) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF)5,6, et l'accumulation localisée d'ET peut augmenter les lésions tissulaires et évoquer un réponse pro-inflammatoire7. Par exemple, les ET ont été impliqués comme jouant un rôle causal dans le développement de l'athérosclérose8, la promotion de la thrombose9, et la prévision du risque cardiovasculaire10.
Il est maintenant reconnu qu'en plus des neutrophiles, d'autres cellules immunitaires (c.-à-d. les mastocytes, les éosinophiles et les macrophages) peuvent également libérer des ET lors de l'exposition à la stimulation microbienne ou pro-inflammatoire11,12. Ceci peut être particulièrement significatif dans le cas des macrophages, considérant leur rôle clé dans le développement, la régulation, et la résolution des maladies inflammatoires chroniques. Par conséquent, il est important d'acquérir une meilleure compréhension de la relation potentielle entre la libération d'ET des macrophages et le développement de la maladie inflammation-connexe. Des études récentes ont montré la présence de METs et NETs dans les plaques atherosclérotiques humaines intactes et organisé thrombi13. De même, les MET ont été impliqués dans la conduite des lésions rénales par la régulation des réponses inflammatoires14. Cependant, contrairement aux neutrophiles, il existe peu de données sur les mécanismes de formation du MET à partir de macrophages. Des études récentes utilisant des modèles in vitro humains de formation MET montrent certaines différences dans les voies impliquées dans chaque type de cellule (c.-à-d., en ce qui concerne l'absence de citrullination histone avec des macrophages)6. Cependant, certains ont montré que la libération NET peut également se produire en l'absence de citrullination histone15.
L'objectif global de ce protocole est de fournir une méthode simple et directe pour évaluer la libération de MET dans un modèle de macrophage cliniquement pertinent. Il existe un certain nombre de différents modèles de cellules macrophages in vitro qui ont été utilisés pour étudier les ETM (c.-à-d., la lignée cellulaire monocyte humaine THP-1 et diverses lignées de cellules macrophages murine)16. Ces modèles sont liés à certaines limites. Par exemple, la différenciation des monocytes THP-1 aux macrophages nécessite généralement une étape d'amorçage, comme l'ajout d'acétate de myristate phorbol (PMA), qui active lui-même les voies dépendantes de la protéine kinase C (PKC). Ce processus est connu pour déclencher la libération ET4 et les résultats dans une libération basale faible MET des cellules THP-1. D'autres études ont mis en évidence certaines différences dans la bioactivité et les réponses inflammatoires montées par macrophages in vivo par rapport aux cellules THP-1 traitées par PMA17.
De même, le comportement et les réponses inflammatoires de différentes lignées cellulaires de type macrophage murine ne représentent pas complètement le spectre de réponse des macrophages humains primaires18. Par conséquent, dans le but d'étudier la formation d'ET de macrophage dans le cadre clinique, les macrophages humains primaires de monocyte-dérivé (HMDMs) sont censés être un modèle plus pertinent plutôt que monocytic ou murine macrophage-comme des lignes de cellules.
Et libération de M1 polarisé HMDMs a été démontré e après l'exposition de ces cellules à un certain nombre de stimuli inflammatoires différents, y compris l'acide hypochloreux oxydant dérivé de myeloperoxidase (HOCl), PMA, TNFMD, et IL-86. Décrit ici est un protocole pour polariser des HMDM au phénotype de M1 et visualiser la libération suivante de MET sur l'exposition à ces stimulus inflammatoires. La PMA est utilisée comme stimulus de la libération de MET pour faciliter les comparaisons avec les études précédentes qui ont utilisé des neutrophiles. Fait important, HOCl, IL-8, et TNF sont également utilisés pour stimuler la libération met, qui sont censés être de meilleurs modèles de l'environnement inflammatoire in vivo. La méthode microscopique pour la visualisation de la libération et consiste à tacher l'ADN extracellulaire dans les cultures cellulaires vivantes à l'aide de SYTOX vert, une tache d'acide nucléique vert fluorescent imperméable qui a été appliquée avec succès dans les études précédentes neutrophile. Cette méthode permet une évaluation rapide et qualitative de la libération et de l'ET, mais elle n'est pas appropriée comme méthode autonome pour la quantification de l'étendue de la libération ET. Une autre méthode devrait être utilisée si la quantification est nécessaire pour comparer l'étendue de la libération d'ET résultant de différentes conditions de traitement ou interventions.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120Q broad spectrum fluorescent light source</td>
			<td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>24606</td>
			<td>Characterisation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14025050</td>
			<td>For washing steps and HOCl treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorous acid (HOCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>PMC4031</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>rhil-4</td>
			<td>For M2 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 8</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-943</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59202C</td>
			<td>Added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td>1114544</td>
			<td>For isolation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>For washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For MET visulaization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-200 brightfield light source</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>300-01A-50</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages

La libération de pièges extracellulaires (ET) par les neutrophiles a été identifiée comme un facteur contribuant au développement de maladies liées à l'inflammation chronique. Les ETs de Neutrophiles (NET) se composent d'un maillage d'ADN, de protéines histones et de diverses protéines granules (c.-à-d. myeloperoxidase, élastase et cathepsine G). D'autres cellules immunitaires, y compris les macrophages, peuvent également produire des ET; cependant, dans quelle mesure cela se produit in vivo et si les pièges extracellulaires macrophages (MET) jouent un rôle dans les mécanismes pathologiques n'a pas été examiné en détail. Pour mieux comprendre le rôle des MET dans les pathologies inflammatoires, un protocole a été développé pour visualiser la libération de MET des macrophages humains primaires in vitro, qui peuvent également être exploités dans des expériences d'immunofluorescence. Cela permet une caractérisation plus poussée de ces structures et leur comparaison avec les ET libérées par les neutrophiles. Les macrophages humains dérivés du monocyte (HMDM) produisent des MET lors de l'exposition à différents stimuli inflammatoires après différenciation avec le phénotype pro-inflammatoire M1. La libération des MET peut être visualisée par microscopie à l'aide d'une tache d'acide nucléique fluorescent vert qui est imperméable aux cellules vivantes (p. ex., sYTOX vert). L'utilisation de macrophages primaires fraîchement isolés, tels que hmDM, est avantageuse dans la modélisation des événements inflammatoires in vivo qui sont pertinents pour les applications cliniques potentielles. Ce protocole peut également être employé pour étudier la libération de MET des lignées humaines de cellules de monocyte (par exemple, THP-1) suivant la différenciation en macrophages avec l'acétate de myristate de phorbol ou d'autres lignées de cellules de macrophage (par exemple, les cellules de Macrophage-like de macrophage murine-comme J774A.1).

Les images brightfield montrant les changements morphologiques de HMDM en réponse aux stimuli pour la différenciation cellulaire sont montrées dans la figure 1. Les macrophages polarisés M1 provenant d'expériences avec HMDM exposés à l'IFNMD et au LPS ont montré une forme cellulaire allongée et en forme de fuseau, comme l'indiquent les flèches noires de la figure 1 (panneau du milieu). À titre de comparaison, la morphologie des macrophages polarisés ...

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In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Présenté ici est un protocole pour détecter la production de pièges extracellulaires macrophages (MET) dans la culture cellulaire vivante en utilisant la microscopie et la coloration de fluorescence. Ce protocole peut être étendu pour examiner des marqueurs spécifiques de protéine de MET par coloration d'immunofluorescence.

Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

La libération de pièges extracellulaires par les neutrophiles et autres cellules immunitaires est importante dans l’immunité innée mais aussi fortement liée aux pathologies inflammatoires. Très peu est connu au sujet de ce processus dans les macrophages bien que ces cellules jouent un rôle critique dans la réponse inflammatoire. Ce protocole fournit un modèle in vitro humain primaire de piège extracellulaire de macrophages ou de libération de mât.Il fournit un modèle pour nous d’étudier une croissance physiologique potentielle de cette structure in vivo. Le principal avantage de cette technique est que les cellules de ce protocole sont des cellules primaires isolées des préparations de couches buffy humaines. Il n’y a pas d’étape d’amorçage nécessaire pour différencier le monocyte en macrophages, ce qui contraste avec d’autres lignées cellulaires monocytes telles que la lignée cellulaire THP-1.Ce protocole est facilement adapté à d’autres cellules immunitaires, y compris le neutrophile isolé et les microglies. Les pièges extracellulaires produits par les macrophages sont très fragiles, il faut donc prendre soin de préserver l’intégrité des pièges tachés. Dans des conditions stériles, préparer le milieu d’amorçage M1 en ajoutant au milieu de culture complet du RPMI-1640, l’interféron gamma à la concentration de 20 nanogrammes par millilitre et le lipopolysaccharide à la concentration d’un microgramme par millilitre.Préparez les supports d’amorçage M2 en ajoutant l’interleukine 4 à l’ensemble des médias de culture RPMI-1640 à la concentration de 20 nanogrammes par millilitre. Dans des conditions stériles, aspirer les médias des puits de plaques de culture tissulaire ensemencées et cultivés contenant du HMDM. Ajouter délicatement dans chaque puits, un millilitre de PBS stérile préchauffé à 37 degrés Celsius.Retirez le tampon PBS et lavez-le deux fois de plus. Ajouter un millilitre de supports d’amorçage M1 ou M2 à chaque puits contenant le HMDM. Incuber les cellules pendant 48 heures à 37 degrés Celsius en présence de 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur cellulaire.Dans des conditions stériles, préparez les médias culturels contenant différents stimulateurs de la libération du MET à l’ensemble des médias RPMI-1640. Pour des expériences avec la stimulation acide hypochlorous, préparez l’acide hypochlorous de 200 micromolaires dans un tube de Faucon avec HBSS qui a été préchauffé à 37 degrés Celsius. Après le traitement de polarisation, aspirer le média cellulaire de chaque puits et laver soigneusement les cellules trois fois avec un millilitre aliquots de PBS stérile pour PMA, TNF alpha, et interleukin 8 stimulation ou HBSS pour la stimulation acide hypochlorous.Après avoir retiré le PBS dans l’étape finale de lavage, ajouter un millilitre de supports complets contenant PMA, TNF alpha, ou interleukine 8. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur cellulaire pendant six heures pour la stimulation alpha TNF et 24 heures pour la pma ou l’interleukine 8 stimulation. Pour les expériences avec de l’acide hypochlorous, après avoir enlevé le HBSS dans l’étape finale de lavage, ajouter un millilitre d’acide hypochlorous fraîchement préparé.Puis incuber les cellules pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius en présence de 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur cellulaire. Après cela, aspirez soigneusement le supernatant des cellules et lavez les cellules trois fois avec un millilitre aliquots de HBSS. Après avoir retiré le HBSS de l’étape finale de lavage, ajoutez un millilitre de médias culturels RPMI-1640 complets.Puis incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius en présence de 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur cellulaire. Préparer le colorant vert SYTOX dans HBSS à une concentration de 40 micromolaires. Ajouter directement 25 microlitres du colorant à chaque puits contenant du HMDM.Incuber les cellules à température ambiante pendant 5 minutes dans l’obscurité. Placez ensuite le HMDM dans les puits de culture tissulaire au stade du microscope d’un microscope fluorescent inversé pour l’imagerie. Allumez une source de lumière fluorescente à large spectre, une source lumineuse à champ lumineux et un microscope inversé installé avec un appareil photo numérique couleur haute résolution.Faites pivoter la roue filtrante à la position numéro deux pour la fluorescence verte avec excitation à 504 nanomètres et dimension à 523 nanomètres. En utilisant l’objectif 5X, concentrez l’image avec la mise au point grossière, puis les boutons de mise au point fine sur le microscope jusqu’à ce que l’image semble nette, claire et ciblée. Passez du microscope au mode Caméra.Démarrez le logiciel associé. Cliquez sur le bouton Lecture pour prévisualiser l’image et ajuster le bouton de mise au point fine sur le microscope jusqu’à ce que l’image semble nette, claire et focalisée dans la fenêtre d’aperçu du logiciel. Cliquez sur le bouton Capture.Dans le logiciel, cliquez sur Fichier. Enregistrer comme le type de fichier d’image requis. Au microscope, faites pivoter la roue filtrante à la position numéro cinq pour l’imagerie à champ lumineux et répétez les procédures de capture pour obtenir l’image correspondante à champ lumineux.Des images en champ lumineux montrant les changements morphologiques de HMDM en réponse aux stimuli sont montrées ici. Les macrophages polarisés par M1 provenant d’expériences avec HMDM exposées à l’interféron gamma et au lipopolysaccharide ont montré une forme cellulaire allongée et en forme de fuseau. À titre de comparaison, la morphologie des macrophages polarisés par M2 après l’exposition de HMDM à l’interleukine 4 pendant 48 heures était généralement ronde et plate.La capacité des phénotypes différenciés de HMDM de libérer des METs a été visualisée par la formation image de fluorescence de cellules vivantes avec le vert de SYTOX. Le contrôle obtenu de chaque phénotype de HMDM incubé pendant 24 heures en l’absence de tous les stimulus pro-inflammatoires a montré la coloration verte très limitée. La coloration positive pour des METs, montrée comme stries vertes, a été réalisée avec l’exposition des M1-HMDMs à l’acide hypochlorous, PMA, interleukin 8, ou alpha de TNF.La présence d’une certaine coloration verte apparente dans les cellules reflète la perte de l’intégrité de la membrane qui peut résulter de la mort cellulaire qui est indépendante de la libération extracellulaire de piège. Les expériences réalisées avec des M2-HMDMs exposés à l’interleukine 4 n’ont montré aucune libération d’ADN des cellules, comme indiqué par l’absence des brins ou des stries de l’ADN extracellulaire. Cependant, il y avait une certaine absorption cellulaire du colorant fluorescent vert avec l’acide hypochlorous et l’alpha de TNF.Il est important d’éviter la lumière vive directe qui peut surexposer la coloration avant l’imagerie. L’ADN extracellulaire peut être quantifié par l’analyse qPCR sur l’ADN nucléaire et mitochondrial présent dans le supernatant cellulaire. Une caractérisation plus détaillée de la structure du mât et de ses rôles dans l’inflammation chronique à l’aide de HMDM peut être plus pertinente sur le plan clinique par rapport à d’autres macrophages immortalisés de lignée cellulaire.

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