Name: in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch einen Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) und Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990) unterstützt. YZ bestätigt auch den Erhalt eines Australian Postgraduate Award von der University of Sydney. Wir danken Herrn Pat Pisansarakit und Frau Morgan Jones für die Unterstützung bei der Monozytenisolation und Gewebekultur.

Die HMDM wurden von menschlichen, buffy Mantelpräparaten isoliert, die von der Blutbank mit ethischer Genehmigung des Sydney Local Health District geliefert wurden.
1. HMDM Kultur
<ol><li>Isolieren Sie die Monozyten aus buffy Mantelpräparaten aus dem peripheren Blut von gesunden menschlichen Spendern mit einem kommerziell erhältlichen Präparat zur Isolierung von Lymphozyten, gefolgt von gegenläufiger Zentrifugalelutriation19, 20</sup...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation:+implication+for+the+inflammatory+disease+condition.">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).</li><li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypochlorous+acid+(HOCl)+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation.">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival.">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li><li>Knight, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+derived+from+macrophages,+mast+cells,+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis.">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Extracellular+Traps:+A+Scoping+Review.">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. 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T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production.">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li><li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+&#176;C+to+35+&#176;C.">The acid ionization constant of HOCl from 5 &#176;C to 35 &#176;C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li><li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid.">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li></ol>

Die Erzeugung und Visualisierung der MET-Bildung mit M1-differenzierten HMDMs stellt ein neues In-vitro-Modell dar, das für die Untersuchung der möglichen pathologischen Rolle dieser Makrophagenstrukturen, insbesondere bei chronisch entzündlichen Bedingungen. Es bietet ein robustes Protokoll für die Stimulation von primären menschlichen Makrophagen, um METs freizusetzen, die auch in verwandten Studien mit menschlichen Monozyten- oder murinen Makrophagenzelllinien verwendet werden können. Die erfolgreiche Umsetzung ...

Die Freisetzung von ETs aus Neutrophilen wurde zuerst als angeborene Immunantwort identifiziert, die durch eine bakterielle Infektion ausgelöst wurde1. Sie bestehen aus einem DNA-Rückgrat, an das verschiedene Granulatproteine mit antibakteriellen Eigenschaften gebunden sind, einschließlich neutrophiler Elastase und Myeloperoxidase2. Die primäre Rolle von neutrophilen ETs (NETs) besteht darin, Krankheitserreger zu erfassen und deren Eliminierung zu erleichtern3. Neben der schützenden Rolle von ETs in der Immunabwehr haben jedoch immer mehr Studien eine Rolle bei der Pathogenese von Krankheiten entdeckt, insbesondere bei der Entwicklung von entzündungsgetriebenen Erkrankungen (z. B. rheumatoide Arthritis und Arteriosklerose4). Die Freisetzung von ETs kann durch verschiedene pro-inflammatorische Zytokine ausgelöst werden, einschließlich Interleukin 8 (IL-8) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF)5,6, und die lokalisierte Anhäufung von ETs kann Gewebeschäden erhöhen und pro-entzündliche Reaktion7. Zum Beispiel, ETs wurden als eine kausale Rolle in der Entwicklung von Arteriosklerose8beteiligt , Förderung der Thrombose9, und Vorhersage kardiovaskulären Risiko10.
Es ist nun anerkannt, dass neben Neutrophilen auch andere Immunzellen (d. h. Mastzellen, Eosinophile und Makrophagen) ETs bei Exposition gegenüber der mikrobiellen oder pro-inflammatorischen Stimulation freisetzen können11,12. Dies kann besonders bei Makrophagen von Bedeutung sein, wenn man ihre Schlüsselrolle bei der Entwicklung, Regulierung und Lösung chronischer entzündlicher Erkrankungen berücksichtigt. Daher ist es wichtig, ein besseres Verständnis der potenziellen Beziehung zwischen DER FREISETZUNG von ET aus Makrophagen und der entwicklung von entzündungsbedingten Krankheiten zu gewinnen. Jüngste Studien haben das Vorhandensein von METs und NETs in intakten menschlichen atherosklerotischen Plaques und organisierten Thromben13gezeigt. In ähnlicher Weise wurden METs in die Fahrt nierenverletzung durch die Regulierung von Entzündungsreaktionen14verwickelt. Im Gegensatz zu Neutrophilen gibt es jedoch begrenzte Daten über die Mechanismen der MET-Bildung aus Makrophagen. Jüngste Studien mit menschlichen In-vitro-Modellen der MET-Bildung zeigen einige Unterschiede in den Pfaden, die an jedem Zelltyp beteiligt sind (d. h. in Bezug auf das Fehlen einer Histon-Zitrullination mit Makrophagen)6. Einige haben jedoch gezeigt, dass NET-Freisetzung auch ohne Histon-Citrullination15auftreten kann.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine einfache und direkte Methode zur Bewertung der MET-Freisetzung in einem klinisch relevanten Makrophagenmodell bereitzustellen. Es gibt eine Reihe von verschiedenen In-vitro-Makrophagenzellmodellen, die verwendet wurden, um METs zu untersuchen (d. h. die THP-1 menschliche Monozytenzelllinie und verschiedene murine Makrophagenzelllinien)16. Diesen Modellen sind einige Einschränkungen zugeordnet. Beispielsweise erfordert die Differenzierung von THP-1-Monozyten zu Makrophagen in der Regel einen Grundierungsschritt, wie z. B. die Zugabe von Phorbolmyristateacetat (PMA), das selbst Proteinkinase C (PKC)-abhängige Pfade aktiviert. Dieser Prozess ist dafür bekannt, ET-Freisetzung4 auszulösen und führt zu einer niedrigen basalen MET-Freisetzung aus THP-1-Zellen. Andere Studien haben einige Unterschiede in der Bioaktivität und Entzündungsreaktionen durch Makrophagen in vivo im Vergleich zu PMA-behandelten THP-1-Zellen17hervorgehoben.
In ähnlicher Weise stellen das Verhalten und die entzündlichen Reaktionen verschiedener muriner Makrophagen-ähnlicher Zelllinien das Reaktionsspektrum der primären menschlichen Makrophagen18nicht vollständig dar. Daher wird für die Untersuchung der Makrophagen-ET-Bildung im klinischen Umfeld angenommen, dass primäre humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen (HMDMs) eher ein relevanteres Modell als monozytäre oder murine makrophagenähnliche Zelllinien sind.
Die ET-Freisetzung von M1 polarisierten HMDMs wurde nach der Exposition dieser Zellen gegenüber einer Reihe verschiedener entzündlicher Reize, einschließlich der myeloperoxidase-abgeleiteten oxidanten Hypochlorsäure (HOCl), PMA, TNF und IL-86,nachgewiesen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, um HMDMs zum M1-Phänotyp zu polarisieren und die nachfolgende MET-Freisetzung bei Exposition gegenüber diesen entzündlichen Reizen zu visualisieren. PMA wird als Stimulus der MET-Freisetzung verwendet, um Vergleiche mit früheren Studien zu erleichtern, die Neutrophile verwendet haben. Wichtig ist, dass HOCl, IL-8 und TNF auch verwendet werden, um die MET-Freisetzung zu stimulieren, die als bessere Modelle der entzündlichen Umgebung in vivo geglaubt werden. Die mikroskopische Methode zur Visualisierung der ET-Freisetzung beinhaltet die Färbung der extrazellulären DNA in lebenden Zellkulturen mit SYTOX-Grün, einem undurchlässigen fluoreszierenden grünen Nukleinsäurefleck, der in früheren Neutrophilenstudien erfolgreich angewendet wurde. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und qualitative Bewertung der ET-Freisetzung, ist jedoch nicht als eigenständige Methode für die Quantifizierung der ET-Freisetzungsausdehnung geeignet. Es sollte eine alternative Methodik angewandt werden, wenn eine Quantifizierung erforderlich ist, um den Umfang der ET-Freisetzung zu vergleichen, die sich aus unterschiedlichen Behandlungsbedingungen oder Interventionen ergibt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120Q broad spectrum fluorescent light source</td>
			<td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>24606</td>
			<td>Characterisation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14025050</td>
			<td>For washing steps and HOCl treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorous acid (HOCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>PMC4031</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>rhil-4</td>
			<td>For M2 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 8</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-943</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59202C</td>
			<td>Added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td>1114544</td>
			<td>For isolation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>For washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For MET visulaization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-200 brightfield light source</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>300-01A-50</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages

Die Freisetzung von extrazellulären Fallen (ETs) durch Neutrophile wurde als ein Faktor zur Entwicklung von Krankheiten im Zusammenhang mit chronischen Entzündungen identifiziert. Neutrophile ETs (NETs) bestehen aus einem Netz aus DNA, Histonproteinen und verschiedenen Granulatproteinen (z. B. Myeloperoxidase, Elastase und Kathepsin G). Andere Immunzellen, einschließlich Makrophagen, können auch ETs produzieren; Inwieweit dies jedoch in vivo geschieht und ob extrazelluläre Makrophagenfallen (METs) in pathologischen Mechanismen eine Rolle spielen, wurde jedoch nicht im Detail untersucht. Um die Rolle von METs bei entzündlichen Pathologien besser zu verstehen, wurde ein Protokoll zur Visualisierung der MET-Freisetzung aus primären menschlichen Makrophagen in vitro entwickelt, das auch in Immunfluoreszenzexperimenten genutzt werden kann. Dies ermöglicht eine weitere Charakterisierung dieser Strukturen und deren Vergleich mit ETs, die von Neutrophilen freigesetzt werden. Humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen (HMDM) produzieren METs bei Exposition gegenüber verschiedenen entzündlichen Reizen nach Differenzierung zum m1-pro-inflammatorischen Phänotyp. Die Freisetzung von METs kann durch Mikroskopie mit einem grünen fluoreszierenden Nukleinsäurefleck visualisiert werden, der für lebende Zellen impermeant ist (z.B. SYTOX grün). Die Verwendung von frisch isolierten primären Makrophagen, wie HMDM, ist vorteilhaft bei der Modellierung von in vivo entzündlichen Ereignissen, die für potenzielle klinische Anwendungen relevant sind. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die MET-Freisetzung von menschlichen Monozytenzelllinien (z. B. THP-1) nach Differenzierung in Makrophagen mit phorbolmyristateacetat oder anderen Makrophagenzelllinien (z. B. die murinen Makrophagen-ähnlichen J774A.1-Zellen) zu untersuchen.

Hellfeldbilder, die die morphologischen Veränderungen von HMDM als Reaktion auf Reize zur Zelldifferenzierung zeigen, sind in Abbildung 1dargestellt. M1 polarisierte Makrophagen aus Experimenten mit HMDM, die IFN und LPS ausgesetzt waren, zeigten eine längliche und spindelartige Zellform, wie die schwarzen Pfeile in Abbildung 1 (mittleres Panel) zeigen. Zum Vergleich: Die Morphologie der polarisierten Makrophagen M2 nach Exposition von HMDM bei IL-4 für 48 h ...

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In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Hier wird ein Protokoll zum Nachweis der Produktion extrazellulärer Makrophagen (MET) in der Lebendzellkultur mittels Mikroskopie und Fluoreszenzfärbung vorgestellt. Dieses Protokoll kann weiter erweitert werden, um spezifische MET-Proteinmarker durch Immunfluoreszenzfärbung zu untersuchen.

In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Die Freisetzung von extrazellulären Fallen durch Neutrophile und andere Immunzellen ist wichtig in der angeborenen Immunität, aber auch stark mit entzündlichen Pathologien verbunden. Über diesen Prozess in Makrophagen ist nur sehr wenig bekannt, obwohl diese Zellen eine entscheidende Rolle bei der Entzündungsreaktion spielen. Dieses Protokoll stellt ein primäres menschliches In-vitro-Modell von Makrophagen extrazellulärer Falle oder Mastfreisetzung bereit.Es bietet ein Modell für uns, um ein potenzielles physiologisches Wachstum dieser Struktur in vivo zu studieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Zellen aus diesem Protokoll primär Zellen sind, die aus menschlichen Buffy-Coat-Präparaten isoliert sind. Es ist kein Grundierungsschritt erforderlich, um die Monozyten in Makrophagen zu differenzieren, was im Gegensatz zu anderen Monozytenzelllinien wie THP-1-Zelllinie steht.Dieses Protokoll ist leicht an andere Immunzellen angepasst, einschließlich isolierter Neutrophiler und Mikroglia. Extrazelluläre Fallen, die durch Makrophagen erzeugt werden, sind sehr zerbrechlich, daher müssen zwischen den Schritten Die sorgsamen Schritte getroffen werden, um die Integrität der Gebeizten zu erhalten. Bereiten Sie unter sterilen Bedingungen das M1-Grundierungsmedium vor, indem Sie dem gesamten RPMI-1640-Kulturmedium, Interferon-Gamma die Konzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter und Lipopolysaccharid in der Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen.Bereiten Sie M2-Grundierungsmedien vor, indem Sie Interleukin 4 zu den kompletten RPMI-1640-Kulturmedien der Konzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter hinzufügen. Unter sterilen Bedingungen, Aspirat Medien aus den gesäten und kultivierten GewebeKultur Plattenbrunnen hmDM enthalten. Sorgfältig in jeden Brunnen, einen Milliliter sterilen PBS vorgewärmt auf 37 Grad Celsius hinzufügen.Entfernen Sie den PBS-Puffer und waschen Sie zwei weitere Male. Fügen Sie entweder einen Milliliter des M1- oder M2-Grundiermediums zu jedem Brunnen hinzu, der das HMDM enthält. Inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5% Kohlendioxid in einem Zellinkubator.Bereiten Sie unter sterilen Bedingungen die Kulturmedien mit verschiedenen Stimulatoren der MET-Freisetzung auf das gesamte RPMI-1640-Medium vor. Für Experimente mit hypochloröser Säurestimulation bereiten Sie 200 mikromolare Hypochlorsäure in einem Falcon-Röhrchen mit HBSS vor, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Nach der Polarisationsbehandlung die Zellmedien aus jedem Brunnen aspirieren und die Zellen dreimal mit einem Milliliter Aliquots entweder steriler PBS für PMA, TNF alpha und Interleukin 8 Stimulation oder HBSS zur hypochlorösen Säurestimulation sorgfältig waschen.Nachdem Sie die PBS im letzten Waschschritt entfernt haben, fügen Sie einen Milliliter vollständiger Medien hinzu, die PMA, TNF alpha oder Interleukin 8 enthalten. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem Zellinkubator für sechs Stunden für TNF Alpha Stimulation und 24 Stunden für PMA oder Interleukin 8 Stimulation. Für Experimente mit Hypochlorsäure, nach dem Entfernen der HBSS in der letzten Waschschritt, fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitete Hypochlorsäure.Dann inkubieren Sie die Zellen für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5% Kohlendioxid in einem Zell-Inkubator. Danach saugen Sie vorsichtig die Oberwasserstand der Zellen und waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter Aliquots von HBSS. Nachdem Sie den HBSS aus dem letzten Waschschritt entfernt haben, fügen Sie einen Milliliter vollständiger RPMI-1640-Kulturmedien hinzu.Dann inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5% Kohlendioxid in einem Zell-Inkubator. Bereiten Sie SYTOX grünen Farbstoff in HBSS mit einer Konzentration von 40 Mikromolaren vor. Direkt 25 Mikroliter des Farbstoffs zu jedem Brunnen hinzufügen, der HMDM enthält.Inkubieren Sie Zellen bei Raumtemperatur für 5 Minuten im Dunkeln. Dann legen Sie das HMDM in Gewebekulturbrunnen auf die Mikroskopstufe eines invertierten Fluoreszenzmikroskops für die Bildgebung. Schalten Sie eine breitspektrumfreie Fluoreszenzlichtquelle, eine Hellfeld-Lichtquelle und ein invertiertes Mikroskop ein, das mit einer hochauflösenden Farb-Digitalkamera installiert ist.Drehen Sie das Filterrad auf die Nummer zwei für grüne Fluoreszenz mit Anregung bei 504 Nanometern und Dimension bei 523 Nanometern. Mit dem 5X-Objektiv, fokussieren Sie das Bild mit dem groben Fokus dann die feinen Fokusknöpfe auf dem Mikroskop, bis das Bild scharf, klar und fokussiert erscheint. Schalten Sie das Mikroskop in den Kameramodus.Starten Sie die zugehörige Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe, um eine Vorschau des Bildes anzuzeigen, und passen Sie den Feinfokusknopf am Mikroskop an, bis das Bild im Software-Vorschaufenster scharf, klar und fokussiert erscheint. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen.Klicken Sie innerhalb der Software auf Datei. Speichern als erforderlicher Bilddateityp. Drehen Sie das Filterrad auf dem Mikroskop auf die Position Nummer fünf für die Lichtfeldabbildung, und wiederholen Sie die Aufnahmevorgänge, um das entsprechende Hellfeldbild zu erhalten.Hier werden Hellfeldbilder gezeigt, die die morphologischen Veränderungen von HMDM als Reaktion auf Reize zeigen. M1-polarisierte Makrophagen aus Experimenten mit HMDM, die Interferongamma und Lipopolysaccharid ausgesetzt waren, zeigten eine längliche und spindelartige Zellform. Zum Vergleich: Die Morphologie der M2-polarisierten Makrophagen nach Exposition von HMDM mit Interleukin 4 für 48 Stunden war in der Regel rund und flach.Die Fähigkeit differenzierter HMDM-Phänotypen, METs freizusetzen, wurde durch Live-Zell-Fluoreszenz-Bildgebung mit SYTOX grün visualisiert. Die Kontrolle, die von jedem HMDM-Phänotyp erhalten wurde, der 24 Stunden lang inBrütete, ohne dass es keine entzündungshemmenden Reize gab, zeigte eine sehr begrenzte grüne Färbung. Eine positive Färbung von METs, dargestellt als grüne Streifen, wurde bei Exposition von M1-HMDMs gegenüber Hypochlorsäure, PMA, Interleukin 8 oder TNF alpha erreicht.Das Vorhandensein einer grünen Färbung, die in den Zellen sichtbar ist, spiegelt den Verlust der Membranintegrität wider, der durch den Zelltod entstehen kann, der unabhängig von extrazellulärer Trapfreisetzung ist. Die Experimente mit M2-HMDMs, die Interleukin 4 ausgesetzt waren, zeigten keine Freisetzung von DNA aus den Zellen, wie das Fehlen der Stränge oder Streifen extrazellulärer DNA zeigt. Jedoch, Es gab einige zelluläre Aufnahme von grünen Fluoreszenzfarbstoff mit der Hypochlorsäure und TNF alpha.Es ist wichtig, das direkte helle Licht zu vermeiden, das die Färbung vor der Bildgebung überbelichten kann. Extrazelluläre DNA kann durch qPCR-Analyse an nuklearer und mitochondrialer DNA im Zellüberstand quantifiziert werden. Eine weitere Charakterisierung der Maststruktur und ihrer Rolle bei chronischen Entzündungen mit HMDM kann im Vergleich zu anderen verewigten Zelllinienmakrophagen klinisch relevanter sein.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Forschung

Immunologie und Infektion

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...