Name: in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענק השפעה תמידי (IPAP201601422) ו נובו Nordisk קרן מענק פרויקט ביו-רפואי (NNF17OC0028990). YZ גם מודה בקבלת פרס לתואר שני אוסטרלי מאוניברסיטת סידני. אנחנו רוצים להודות למר פט פיסארו ולגב מורגן ג'ונס לסיוע בבידוד ובתרבות הרקמה המונבציט.

ה-HMDM היו מבודדים מההכנות של מעיל הבאפי האנושי המסופק על ידי בנק הדם עם אישור מוסר מאזור הבריאות המקומי של סידני.
1. התרבות החMDM
<ol><li>לבודד את המונציטים מן ההכנות מעיל באפי הכין דם היקפי של תורמים אנושיים בריאים באמצעות הכנה מסחרית זמין כדי לבודד לימפוציטים, ואחריו משחררות הנ?...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation:+implication+for+the+inflammatory+disease+condition.">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).</li><li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypochlorous+acid+(HOCl)+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation.">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival.">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li><li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminase+inhibition+reduces+vascular+damage+and+modulates+innate+immune+responses+in+murine+models+of+atherosclerosis.">Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis.</a> Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).</li><li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis.">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).</li><li>Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Footprints+of+neutrophil+extracellular+traps+as+predictors+of+cardiovascular+risk.">Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).</li><li>Goldmann, O., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+world+of+extracellular+traps:+not+only+neutrophils+but+much+more.">The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more.</a> Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+derived+from+macrophages,+mast+cells,+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis.">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Extracellular+Traps:+A+Scoping+Review.">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+low-density+lipoprotein+results+in+the+time-dependent+accumulation+of+cholesteryl+esters+and+apolipoprotein+B-100+protein+in+primary+human+monocyte-derived+macrophages.">Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages.</a> FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).</li><li>Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production.">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li><li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+&#176;C+to+35+&#176;C.">The acid ionization constant of HOCl from 5 &#176;C to 35 &#176;C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li><li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid.">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li></ol>

הדור וההדמיה של היווצרות MET באמצעות M1 הבדיל HMDMs מייצג חדש במודל מבחנה שעשוי להועיל לחקירת התפקיד הפתולוגי הפוטנציאלי של מבנים מקרופאג אלה, במיוחד תחת דלקתי כרונית תנאים. הוא מספק פרוטוקול חזק לגירוי של מקרופאגים אנושיים הראשי כדי לשחרר את המטס, אשר יכול גם להיות מנוצל במחקרים קשורים עם מונ...

שחרורו של ETs מ נויטרופילים זוהה לראשונה כתגובה חיסונית מולדת המופעל על ידי זיהום חיידקי1. הם מורכבים השדרה DNA אשר שונים חלבונים הגרניט עם תכונות אנטי בקטריאלי מאוגדים, כולל נויטרופילים elastase ו myeloperoxidase2. התפקיד העיקרי של נויטרופילים (רשתות) היא ללכוד פתוגנים ולהקל על חיסול שלהם3. עם זאת, בנוסף לתפקיד המגן של ETs בהגנה החיסונית, מספר גדל והולך של מחקרים גילו גם תפקיד בפתוגנזה מחלה, במיוחד במהלך התפתחות של מחלות מונחה דלקות (כלומר, דלקת מפרקים שגרונית ו טרשת עורקים4). שחרורו של ETs יכול להיות מופעלות על ידי ציטוקינים pro-דלקתיות שונים כולל אינטרלויקין 8 (IL-8) ו נמק גורם הגידול אלפא (tnfα)5,6, ואת הצטברות מקומי של ETs יכול להגביר את הנזק לרקמות ולעורר תגובה הפרו דלקתית7. לדוגמה, ETs היו מעורבים כמו לשחק תפקיד סיבתי בפיתוח טרשת עורקים8, קידום פקקת9, וחיזוי הסיכון וכלי דם10.
עכשיו הוא מוכר כי בנוסף נויטרופילים, תאים חיסוניים אחרים (כלומר, התורן תאים, אאוזיפרלס, ו מקרופאגים) יכול גם לשחרר את האור על חשיפה לחיידקים או גירוי פרו-דלקתי11,12. זה עשוי להיות משמעותי במיוחד במקרה של מקרופאגים, בהתחשב תפקיד המפתח שלהם בפיתוח, רגולציה, והרזולוציה של מחלות דלקתיות כרוניות. לכן, חשוב להשיג הבנה גדולה יותר של הקשר הפוטנציאלי בין שחרור ET מקרופאגים ופיתוח דלקת מחלות הקשורות. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו נוכחות של מטס ורשתות בפלאק טרשת עורקים אנושיים שלמים ומאורגנים בתרובי13. באופן דומה, המטס היו מעורבים בנהיגה פציעה בכליות באמצעות התקנה של תגובות דלקתיות14. עם זאת, בניגוד נויטרופילים, יש נתונים מוגבלים על מנגנוני היווצרות MET מקרופאגים. מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות האדם מודלים מחוץ לתחום של היווצרות MET להראות כמה הבדלים המסלולים המעורבים בכל סוג תא (כלומר, לגבי העדר הציטרין של היסטון עם מקרופאגים)6. עם זאת, חלק הראו כי מהדורת NET יכול להתרחש גם בהעדר האוקירורולציה15.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה פשוטה וישירה להערכת שחרור MET במודל מקרופאג רלוונטי קלינית. ישנם מספר שונים של מודלים מקרופאג cell מחוץ לתחום ששימשו לחקר מטס (כלומר, קו התאים האנושי THP-1 מונוציט וקווי התאים השונים murine מקרופאג)16. ישנן מספר מגבלות המשויכות למודלים אלה. לדוגמה, הבידול של THP-1 מונוציטים מקרופאגים בדרך כלל דורש צעד לקרקע, כגון תוספת של מיבריא אצטט myristate (PMA), אשר עצמו מפעיל את החלבון קינאז C (PKC) התלויים שבילים. תהליך זה ידוע להפעיל את שחרור ET4 ותוצאות שחרור בסיס נמוך הבזמ thp-1 תאים. מחקרים אחרים הדגישו כמה הבדלים ביו פעילות ותגובות דלקתיות רכוב על ידי מקרופאגים ב vivo לעומת PMA מטופלים THP-1 תאים17.
באופן דומה, את ההתנהגות ואת התגובות דלקתיות של קווי מורטין מקרופאג שונים כמו הקווים אינם מייצגים לחלוטין את ספקטרום התגובה של מקרופאגים האדם העיקרי18. לכן, לצורך חקירת היווצרות מקרופאג ET בהגדרה הקלינית, מקרופאגים (HMDMs) של האדם הראשי הנגזר הנחשב להיות מודל רלוונטי יותר מאשר קווי תאים מקרופאג כמו monocytic או murine.
שחרור ET מ-M1 מקוטב HMDMs הוכח לאחר החשיפה של תאים אלה למספר גירויים דלקתיים שונים, כולל myeloperoxidase הנגזר חומצה היפוכלורית חמצון (HOCl), PMA, TNFα, ו-IL-86. מתוארים כאן הוא פרוטוקול כדי להקטאת HMDMs ל-M1 פניטיפ ולדמיין שחרור MET לאחר מכן בחשיפה לגירויים דלקתיים אלה. PMA משמש גירוי של שחרור MET כדי להקל על השוואות למחקרים קודמים אשר השתמשו נויטרופילים. וחשוב מכך, HOCl, IL-8 ו-TNFα משמשים גם כדי לעורר שחרור MET, אשר האמינו להיות מודלים טובים יותר של הסביבה דלקתית ב vivo. השיטה המיקרוסקופית להדמיה של מהדורת ET כרוכה בצביעת ה-DNA של החילוץ בתרביות תאים חיים באמצעות שימוש ברעלים בירוק, הכתם הירוק של פלורסנט בלתי מורגש בצבע חומצות גרעין שהוחלו בהצלחה במחקרים הקודמים של נויטרופילים. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה ואיכותית של שחרור ET, אך אינה מתאימה כשיטה עצמאית לכמת של מידת שחרור ET. יש להשתמש במתודולוגיה חלופית אם הכמת נדרש כדי להשוות את היקף שחרור ET כתוצאה מתנאי טיפול שונים או התערבויות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120Q broad spectrum fluorescent light source</td>
			<td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>24606</td>
			<td>Characterisation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14025050</td>
			<td>For washing steps and HOCl treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorous acid (HOCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>PMC4031</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>rhil-4</td>
			<td>For M2 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 8</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-943</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59202C</td>
			<td>Added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td>1114544</td>
			<td>For isolation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>For washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For MET visulaization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-200 brightfield light source</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>300-01A-50</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages

שחרורו של מלכודות מסחטות (ETs) על ידי נויטרופילים זוהה כגורם תורם להתפתחות של מחלות הקשורות לדלקת כרונית. נויטרופילים מורכב מרשת של DNA, חלבונים היסטון, וחלבונים שונים של הגרניט (כלומר, myeloperoxidase, elastase, ו-צנתור G). תאים חיסוניים אחרים, כולל מקרופאגים, יכולים גם לייצר ETs; עם זאת, עד כמה זה קורה בvivo והאם מקרופאג מלכודות לחילוץ (מטס) לשחק תפקיד במנגנונים פתולוגיים לא נבדק בפרוטרוט. כדי להבין טוב יותר את התפקיד של גרורות בפתווגיות דלקתיות, פרוטוקול פותחה לצורך ויזואליזציה שחרור MET מקרופאגים האנושי העיקרי בתוך מבחנה, אשר ניתן גם לנצל בניסויים immunofluorescence. זה מאפשר אפיון נוסף של המבנים האלה ואת ההשוואה שלהם ETs שוחרר מ נויטרופילים. מקרופאגים של האדם מונוציט הנגזר (HMDM) לייצר גרורות בעת חשיפה גירויים דלקתיים שונים בעקבות בידול ל-M1 pro-הפנוטיפים דלקתיים. שחרורו של מטס יכול להיות מדמיין על ידי מיקרוסקופ באמצעות כתם ירוק הגרעין חומצה פלואורסצנטי כי הוא מיועד לחיות תאים (g., בדיקת רעלים ירוק). השימוש של מקרופאגים ראשוניים מבודדים, כגון HMDM, הוא יתרון במידול באירועים דלקתיים vivo הרלוונטיים יישומים קליניים פוטנציאליים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד שחרור MET מתוך קווי מונוציט האדם התאים (למשל, THP-1) בעקבות בידול לתוך מקרופאגים עם האצטטים myristate מקרופאג או אחרים תא קווי (g., מקרופאג murine כמו J774A. 1 תאים).

ברייטפילד תמונות המציגות את השינויים הורפולוגיים של HMDM בתגובה לגירויים של בידול התא מוצגים באיור 1. מקרופאגים מקוטבי M1 מניסויים עם HMDM חשופים ל-IFNγ ו-LPS הראו צורה מוארך ובעלת צורת ציר, כפי שמצוין על-ידי החיצים השחורים באיור 1 (הלוח האמצעי). לצורך השוואה, המבנה ש...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לזהות מלכודת מקרופאג מסחטות (MET) ייצור בתרבות התא החי באמצעות מיקרוסקופ וכתמים פלואורסצנטית. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עוד יותר כדי לבחון סמנים מסוימים של החלבון נפגשו על-ידי כתמים immunofluorescence.

בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

שחרור מלכודות חוץ תאיות על ידי נויטרופילים ותאי חיסון אחרים חשוב בחסינות המולדת אך גם קשור מאוד עם פתולוגיות דלקתיות. מעט מאוד ידוע על תהליך זה מקרופאגים למרות תאים אלה ממלאים תפקיד קריטי בתגובה דלקתית. פרוטוקול זה מספק מודל ראשוני במבחנה אנושית של מקרופאגים מלכודת חוץ-תאית או שחרור תורן.הוא מספק לנו מודל לחקור צמיחה פיזיולוגית פוטנציאלית של מבנה זה ב vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי התאים מפרוטוקול זה הם תאים ראשוניים מבודדים מן ההכנות מעיל באפי אנושי. אין צורך בשלב priming כדי להבדיל את המונוציטים למאקרופגים, בניגוד לקו תא מונוציטים אחר כגון קו תא THP-1.פרוטוקול זה מותאם בקלות לתאי חיסון אחרים, כולל נויטרופילים ומיקרוגליה מבודדים. מלכודת חוץ-תאית המיוצרת על ידי מקרופאגים היא שברירית מאוד, ולכן יש לנקוט באמצע הצעד כדי לשמר את שלמות המלכודות המוכתמות. בתנאים סטריליים, להכין M1 priming בינוני על ידי הוספת המדיה המלאה RPMI-1640 תרבות, אינטרפרון גמא לריכוז של 20 ננוגרם למיליליטר ו lipopolysaccharide לריכוז של מיקרוגרם אחד למיליליטר.הכן M2 priming מדיה על ידי הוספת interleukin 4 לתקשורת התרבות המלאה RPMI-1640 לריכוז של 20 ננוגרם למיליליטר. בתנאים סטריליים, שאפו מדיה מ בארות צלחת רקמות זרעים ותרבותיים המכילים HMDM. בזהירות להוסיף לתוך כל באר, מיליליטר אחד של PBS סטרילי מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.הסר את מאגר PBS ושטף פעמיים נוספות. הוסף מיליליטר אחד של המדיה M1 או M2 לכל באר המכילה את HMDM. להחרים את התאים במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5%פחמן דו חמצני באינקובטור תאים.בתנאים סטריליים, הכינו את אמצעי התקשורת התרבותיים המכילים ממריצים שונים של מהדורת MET למדיית RPMI-1640 המלאה. לניסויים עם גירוי חומצה hypochlorous, להכין 200 חומצה hypochlorous micromolar בצינור פלקון עם HBSS כי כבר התחמם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. לאחר טיפול הקיטוב, שאפו את מדיית התא מכל באר ושטפו בזהירות את התאים שלוש פעמים בעזרת אליקוטים מיליליטריים של PBS סטרילי עבור PMA, אלפא TNF וגירוי אינטרלוקין 8 או HBSS לגירוי חומצה היפוכלורית.לאחר הסרת ה- PBS בשלב הכביסה הסופי, הוסף מיליליטר אחד של מדיה מלאה המכילה PMA, TNF אלפא או אינטרלוקין 8. הדגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באינקובטור תא במשך שש שעות עבור גירוי אלפא TNF ו 24 שעות עבור PMA או interleukin 8 גירוי. לניסויים עם חומצה היפוכלורית, לאחר הסרת HBSS בשלב הכביסה הסופי, להוסיף מיליליטר אחד של חומצה hypochlorous מוכן טרי.ואז להחרים את התאים במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5%פחמן דו חמצני באינקובטור תא. לאחר מכן, שאפו בזהירות את על-טבעי התאים ושטפו את התאים שלוש פעמים בעזרת אליקוטים מיליליטריים של HBSS. לאחר הסרת HBSS מהשבב האחרון לשטוף, להוסיף מיליליטר אחד של מדיה מלאה RPMI-1640 תרבות.ואז להחרים את התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% פחמן דו חמצני באינקובטור תאים. הכן צבע ירוק SYTOX ב- HBSS בריכוז של 40 מיקרומולרים. מוסיפים ישירות 25 מיקרוליטרים של הצבע לכל באר המכילה HMDM.דגירה תאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות בחושך. לאחר מכן מניחים את HMDM בארות תרבות הרקמות על שלב המיקרוסקופ של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך להדמיה. הפעל מקור אור פלואורסצנטי רחב ספקטרום רחב, מקור אור בהיר ומיקרוסקופ הפוך המותקן במצלמה דיגיטלית צבעונית ברזולוציה גבוהה.סובב את גלגל המסנן למיקום מספר 2 עבור פלואורסצנטיות ירוקה עם העירור ב 504 ננומטר וממד ב 523 ננומטר. באמצעות המטרה 5X, למקד את התמונה עם המוקד גס ואז ידיות המיקוד בסדר על המיקרוסקופ עד התמונה מופיע חדה, ברורה, וממוקדת. העבר את המיקרוסקופ למצב מצלמה.הפעל את התוכנה המשויכת. לחצו על הלחצן 'הפעל' כדי להציג את התמונה בתצוגה מקדימה ולהתאים את ידית המיקוד העדינה במיקרוסקופ עד שהתמונה תופיע חדה, ברורה וממוקדת בחלון התצוגה המקדימה של התוכנה. לחץ על לחצן לכידה.בתוך התוכנה, לחץ על קובץ. שמור כסוג קובץ התמונה הנדרש. במיקרוסקופ, סובב את גלגל המסנן למיקום מספר חמש עבור דימות שדה בהיר וחזור על הליכי הלכידה כדי להשיג את תמונת השדה הבהיר המתאימה.תמונות שדה בהיר המציגות את השינויים המורפולוגיים של HMDM בתגובה לגירויים מוצגות כאן. מקרופאגים מקוטבים M1 מניסויים עם HMDM שנחשפו לגמא אינטרפרון וליפופולסכריד הראו צורת תא מוארכת דמוית ציר. לשם השוואה, המורפולוגיה של מקרופאגים מקוטבים M2 לאחר החשיפה של HMDM כדי interleukin 4 במשך 48 שעות היו בדרך כלל עגול ושטוח.היכולת של פנוטיפים HMDM מובחנים לשחרר METs הודמיה על ידי הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים עם ירוק SYTOX. השליטה המתקבלת מכל פנוטיפ HMDM דגירה במשך 24 שעות בהיעדר כל גירויים פרו דלקתיים הראו כתמים ירוקים מוגבלים מאוד. כתמים חיוביים עבור METs, המוצגים כפסים ירוקים, הושגו עם חשיפה של M1-HMDMs לחומצה היפוכלורית, PMA, אינטרלוקין 8 או TNF אלפא.נוכחות של כמה כתמים ירוקים ניכר בתאים משקף אובדן שלמות קרום אשר עלול לנבוע מוות של תאים כי הוא עצמאי של שחרור מלכודת חוץ תאית. הניסויים שבוצעו עם M2-HMDMs שנחשפו אינטרלוקין 4 הראו שום שחרור של DNA מהתאים, כפי שצוין על ידי היעדר גדילים או פסים של DNA חוץ תאי. עם זאת, הייתה ספיגה תאית מסוימת של צבע פלואורסצנטי ירוק עם החומצה ההיפוכלורית ואלפא TNF.חשוב להימנע מאור בהיר ישיר אשר יכול לחשיפת יתר של הכתמים לפני הדמיה. דנ"א חוץ-תאי ניתן לכמת על ידי ניתוח qPCR על דנ"א גרעיני ומיטוכונדריאלי נוכח בתא על טבעי. אפיון נוסף של מבנה התורן ותפקידיו בדלקת כרונית באמצעות HMDM עשויים להיות רלוונטיים יותר מבחינה קלינית בהשוואה לחנויות מקרופאגים אחרות של קו תאים מונצחים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...