Name: in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

यह काम एक स्थायी प्रभाव अनुदान (IPAP201601422) और नोवो Nordisk फाउंडेशन जैव चिकित्सा परियोजना अनुदान (NNF17OC0028990) द्वारा समर्थित किया गया था. वाईजेड भी सिडनी विश्वविद्यालय से एक ऑस्ट्रेलियाई स्नातकोत्तर पुरस्कार की प्राप्ति स्वीकार करता है. हम मोनोसाइट अलगाव और ऊतक संस्कृति के साथ सहायता के लिए श्री पैट Pisansarakit और सुश्री मॉर्गन जोन्स शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.

HMDM सिडनी स्थानीय स्वास्थ्य जिले से नैतिकता के अनुमोदन के साथ रक्त बैंक द्वारा आपूर्ति की मानव buffy कोट तैयारी से अलग थे.
1. एचएमडीएम संस्कृति
<ol><li>लिम्फोसाइटों को अलग करने के लिए व्यावसायिक रूप स?...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation:+implication+for+the+inflammatory+disease+condition.">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).</li><li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypochlorous+acid+(HOCl)+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation.">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival.">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li><li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminase+inhibition+reduces+vascular+damage+and+modulates+innate+immune+responses+in+murine+models+of+atherosclerosis.">Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis.</a> Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).</li><li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis.">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).</li><li>Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Footprints+of+neutrophil+extracellular+traps+as+predictors+of+cardiovascular+risk.">Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).</li><li>Goldmann, O., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+world+of+extracellular+traps:+not+only+neutrophils+but+much+more.">The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more.</a> Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+derived+from+macrophages,+mast+cells,+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis.">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Extracellular+Traps:+A+Scoping+Review.">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+low-density+lipoprotein+results+in+the+time-dependent+accumulation+of+cholesteryl+esters+and+apolipoprotein+B-100+protein+in+primary+human+monocyte-derived+macrophages.">Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages.</a> FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).</li><li>Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production.">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li><li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+&#176;C+to+35+&#176;C.">The acid ionization constant of HOCl from 5 &#176;C to 35 &#176;C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li><li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid.">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li></ol>

एम 1 विभेदित HMDMs का उपयोग कर MET गठन की पीढ़ी और दृश्य इन मैक्रो मॉडल है कि इन मैक्रोफेज संरचनाओं की संभावित रोग भूमिका की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है में एक नया इन विट्रो मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है, विशे?...

न्यूट्रोफिल से ईटी की रिहाई की पहचान सबसे पहले जीवाणु संक्रमण1के कारण होने वाली एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में की गई थी . इनमें डीएनए की रीढ़ की हड्डी होती है जिसमें एंटी-बैक्टीरियल गुणों वाले विभिन्न कण प्रोटीन बंधे होते हैं, जिनमें न्यूट्रोफिल इलैस्टेज और माइलोपेरॉक्सिडस2शामिल हैं। न्यूट्रोफिल ईटीएस (एनआईटी) की प्राथमिक भूमिका रोगजनकों को पकड़ना और उनके उन्मूलन को सुगम बनाना3है। हालांकि, प्रतिरक्षा रक्षा में ईटीएस की सुरक्षात्मक भूमिका के अलावा, अध्ययनों की बढ़ती संख्या ने रोग रोगजनन में एक भूमिका की भी खोज की है, विशेष रूप से सूजन-चालित रोगों के विकास के दौरान (यानी, रूमेटोइड गठिया और ऐथेरोस्क्लेरोसिस4) ईटीएस की रिहाई interleukin 8 (आईएल-8) और ट्यूमर नेक्रोसिस कारक अल्फा (TNF ] )5,6,और ईटीएस के स्थानीयकृत संचय ऊतक क्षति को बढ़ाने और एक आह्वान सहित विभिन्न समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स द्वारा ट्रिगर किया जा सकता है समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया7| उदाहरण के लिए, ईटी को एथेरोस्क्लेरोसिस8के विकास में एक कारण भूमिका निभाने , थ्रोम्बिसिस9को बढ़ावा देने और हृदय जोखिम10की भविष्यवाणी के रूप में फंसाया गया है .
अब यह मान्यता प्राप्त है कि न्यूट्रोफिल के अलावा, अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं (यानी, मस्तूल कोशिकाओं, eosinophils, और मैक्रोफेज) भी माइक्रोबियल या समर्थक भड़काऊ उत्तेजना के संपर्क में ETs जारी कर सकते हैं11,12. यह मैक्रोफेज के मामले में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है, विकास, विनियमन, और पुरानी भड़काऊ रोगों के समाधान में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका पर विचार. इसलिए, मैक्रोफेज और सूजन से संबंधित रोग विकास से एट रिलीज के बीच संभावित संबंधों की अधिक से अधिक समझ हासिल करना महत्वपूर्ण है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एमईटीएस और एनईटीएस की उपस्थिति में मानव एथेरोस्क्लेरोटिक प्लेक और संगठित थ्रोम्बी13में शामिल हैं . इसी तरह, एमईटीएस को सूजन प्रतिक्रियाओं के विनियमन के माध्यम से गुर्दे की चोट को चलाने में फंसाया गयाहै। तथापि, न्यूट्रोफिल के विपरीत, मैक्रोफेज से एमईटी निर्माण के तंत्र पर सीमित आंकड़े हैं। एमईटी गठन के मानव इन विट्रो मॉडल का उपयोग कर के हाल के अध्ययन प्रत्येक सेल प्रकार में शामिल रास्ते में कुछ मतभेद दिखा (यानी, मैक्रोफेज के साथ histone citrullination के अभाव के बारे में)6. हालांकि, कुछ ने दिखाया है कि नेट रिलीज भी histone citrullination15की अनुपस्थिति में हो सकता है.
इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक मैक्रोफेज मॉडल में एमईटी रिलीज का आकलन करने के लिए एक सरल और प्रत्यक्ष विधि प्रदान करना है। इन विट्रो मैक्रोफेज सेल मॉडलों में कई अलग-अलग हैं जिनका उपयोग एमईटीएस (अर्थात, THP-1 मानव मोनोसाइट सेल लाइन और विभिन्न murine मैक्रोफेज सेल लाइनों)16का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इन मॉडलों के साथ संबद्ध कुछ सीमाएँ हैं. उदाहरण के लिए, thp-1 monocytes के मैक्रोफेज के लिए भेदभाव आमतौर पर एक प्राइमिंग कदम की आवश्यकता है, इस तरह के phorbol myristate एसीटेट (पीएमए) के अलावा के रूप में, जो अपने आप में प्रोटीन kinase सी (PKC) पर निर्भर रास्ते सक्रिय करता है. इस प्रक्रिया को एट रिलीज4 ट्रिगर और THP-1 कोशिकाओं से एक कम बेसल MET रिलीज में परिणाम के लिए जाना जाता है. अन्य अध्ययनों में पीएमए द्वारा उपचारित टीएचपी-1 कोशिकाओं17की तुलना में विवो में मैक्रोफेज द्वारा शुरू की गई जैव सक्रियता और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में कुछ अंतर ों पर प्रकाश डाला गया है।
इसी प्रकार, विभिन्न मौरीन मैक्रोफेज जैसे सेल लाइनों के व्यवहार और भड़काऊ प्रतिक्रियाएं प्राथमिक मानव मैक्रोफेज18के अनुक्रिया स्पेक्ट्रम को पूरी तरह से प्रदर्शित नहीं करती हैं। इसलिए, नैदानिक सेटिंग में मैक्रोफेज एट गठन की जांच के प्रयोजन के लिए, प्राथमिक मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज (एचएमडीएम) को मोनोसाइटिक या मौरीन मैक्रोफेज जैसे सेल लाइनों के बजाय अधिक प्रासंगिक मॉडल माना जाता है।
एम 1 polarized HMDMs से एट रिलीज विभिन्न भड़काऊ उत्तेजनाओं की एक संख्या के लिए इन कोशिकाओं के प्रदर्शन के बाद प्रदर्शन किया गया है, myeloperoxidase व्युत्पन्न ऑक्सीडेंट hypochlorous एसिड (HOCl), PMA, TNF, और आईएल-86सहित . यहाँ वर्णित M1 phenotype करने के लिए HMDMs polarize और इन भड़काऊ उत्तेजनाओं के संपर्क में बाद में एमईटी रिलीज कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल है. पीएमए का उपयोग एमईटी रिलीज के एक प्रोत्साहन के रूप में किया जाता है ताकि पिछले अध्ययनों की तुलना की जा सके, जिनमें न्यूट्रोफिल का उपयोग किया गया है। महत्वपूर्ण बात, HOCl, आईएल -8, और TNF - भी एमईटी रिलीज, जो vivo में भड़काऊ वातावरण के बेहतर मॉडल माना जाता है को प्रोत्साहित करने के लिए उपयोग किया जाता है. एट रिलीज के दृश्य के लिए सूक्ष्म विधि SYTOX हरे रंग का उपयोग कर रहते सेल संस्कृतियों में extracellular डीएनए धुंधला शामिल है, एक अपारगम्य फ्लोरोसेंट हरी न्यूक्लिक एसिड दाग है कि सफलतापूर्वक पिछले न्यूट्रोफिल अध्ययन में लागू किया गया है. इस विधि एट रिलीज के तेजी से और गुणात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह एट रिलीज हद तक के परिमाणीकरण के लिए एक खड़े अकेले विधि के रूप में उपयुक्त नहीं है. वैकल्पिक पद्धति का उपयोग किया जाना चाहिए यदि विभिन्न उपचार स्थितियों या हस्तक्षेपों से उत्पन्न एट रिलीज की सीमा की तुलना करने के लिए परिमाणीकरण की आवश्यकता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120Q broad spectrum fluorescent light source</td>
			<td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>24606</td>
			<td>Characterisation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14025050</td>
			<td>For washing steps and HOCl treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorous acid (HOCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>PMC4031</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>rhil-4</td>
			<td>For M2 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 8</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-943</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59202C</td>
			<td>Added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td>1114544</td>
			<td>For isolation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>For washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For MET visulaization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-200 brightfield light source</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>300-01A-50</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages

न्यूट्रोफिल द्वारा एक्स्ट्रासेल्यूलर ट्रैप (ईटी) की रिहाई को पुरानी सूजन से संबंधित बीमारियों के विकास में एक योगदान कारक के रूप में पहचाना गया है। न्यूट्रोफिल ईटीएस (एनटीएस) डीएनए, हिस्टोन प्रोटीन, और विभिन्न ग्रेन्यूल प्रोटीन (यानी, माइलोपेरॉक्सिड्स, इलैस्टेस, और कैथेप्सिन जी) की एक जाल से मिलकर बनता है। मैक्रोफेज सहित अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाएं भी ETs का उत्पादन कर सकती हैं; तथापि, विवो में यह किस सीमा तक होता है और क्या मैक्रोफेज बाह्यकोशिक ीय जाल (एमईटीएस) रोग तंत्र में भूमिका निभाता है, इसकी विस्तार से जांच नहीं की गई है। भड़काऊ रोगों में एमईटी की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए, इन विट्रो में प्राथमिक मानव मैक्रोफेज से एमईटी रिलीज को विज़ुअलाइज़ करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, जिसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों में भी शोषण किया जा सकता है। यह इन संरचनाओं की आगे की विशेषता और न्यूट्रोफिल से जारी ईटी की तुलना की अनुमति देता है। मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज (एचएमडीएम) एम 1 समर्थक भड़काऊ फीनोटाइप के भेदभाव के बाद विभिन्न भड़काऊ उत्तेजनाओं के संपर्क में एमईटी का उत्पादन करता है। METs की रिहाई एक हरे फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग है कि कोशिकाओं को जीने के लिए impermeant है का उपयोग कर माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है (उदा. SYTOX हरे). एचएमडीएम जैसे हौसले से अलग प्राथमिक मैक्रोफेज का उपयोग, विवो सूजन की घटनाओं में मॉडलिंग में फायदेमंद है जो संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए प्रासंगिक हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग मानव मोनोसाइट सेल लाइनों (जैसे, THP-1) से एमईटी रिलीज का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, जो फोरबोल माइरिस्टेट एसीटेट या अन्य मैक्रोफेज सेल लाइनों (जैसे, murine मैक्रोफेज-जैसे J774A.1 कोशिकाओं) के साथ मैक्रोफेज में भेदभाव के बाद किया जा सकता है।

सेल विभेदन के लिए उत्तेजनाओं के प्रत्युत्तर में एचएमडीएम के रूपात्मक परिवर्तनदर्शियों को दर्शानेवाली ब्राइटफील्ड छवियां चित्र 1 में दर्शाए गए हैं। HMDM के साथ प्रयोगों से M1 polarized मैक्रोफेज IFN$ ?...

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In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

यहाँ प्रस्तुत माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट धुंधला का उपयोग कर लाइव सेल संस्कृति में मैक्रोफेज एक्स्ट्रासेल्यूलर ट्रैप (एमईटी) उत्पादन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल है। इस प्रोटोकॉल आगे इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा विशिष्ट एमईटी प्रोटीन मार्करों की जांच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

विट्रो उत्तेजना और विक्षेत मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज में extracellular ट्रैप रिलीज के दृश्य

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

न्यूट्रोफिल और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा बाहेल जाल की रिहाई जन्मजात प्रतिरक्षा में महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी दृढ़ता से भड़काऊ विकृतियों के साथ जुड़ा हुआ है। मैक्रोफेज में इस प्रक्रिया के बारे में बहुत कम जाना जाता है, हालांकि ये कोशिकाएं भड़काऊ प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। यह प्रोटोकॉल मैक्रोफेज एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप या मास्ट रिलीज का एक प्राथमिक मानव इन विट्रो मॉडल प्रदान करता है।यह हमारे लिए वीवो में इस संरचना के संभावित शारीरिक विकास का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रदान करता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि इस प्रोटोकॉल से कोशिकाएं मानव बफी कोट तैयारी से अलग प्राथमिक कोशिकाएं हैं। मोनोसाइट को मैक्रोफेज में अंतर करने के लिए कोई भड़काना कदम आवश्यक नहीं है, जो अन्य मोनोसाइट सेल लाइन जैसे टीएचपी-1 सेल लाइन के विपरीत है।यह प्रोटोकॉल आसानी से अलग न्यूट्रोफिल और माइक्रोग्लिया सहित अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जाता है। मैक्रोफेज द्वारा उत्पादित अतिरिक्त जाल बहुत नाजुक हैं, इसलिए दाग वाले जाल की अखंडता को बनाए रखने के लिए कदम के बीच परवाह की जानी चाहिए। बाँझ परिस्थितियों में, पूर्ण आरपीएमआई-1640 संस्कृति मीडिया को जोड़कर एम 1 प्राइमिंग माध्यम तैयार करें, 20 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता के लिए इंटरफेरॉन गामा और लिपोपॉलिसाकराइड को एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता के लिए तैयार करें।20 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता के लिए पूर्ण RPMI-1640 संस्कृति मीडिया के लिए interleukin 4 जोड़कर M2 भड़काना मीडिया तैयार करें। बाँझ परिस्थितियों में, एचएमडीएम युक्त वरीयता प्राप्त और सुसंस्कृत ऊतक संस्कृति प्लेट कुओं से मीडिया को आकांक्षी करें। ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें, बाँझ PBS के एक मिलीलीटर पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम ।पीबीएस बफर निकालें और दो अतिरिक्त बार धोएं। एचएमडीएम युक्त प्रत्येक में एम 1 या एम 2 प्राइमिंग मीडिया का एक मिलीलीटर जोड़ें। कोशिका इनक्यूबेटर में 5% कार्बन डाइऑक्साइड की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।बाँझ परिस्थितियों में, संस्कृति मीडिया को तैयार करें जिसमें पूर्ण आरपीएमआई-1640 मीडिया को मिले रिलीज के विभिन्न उत्तेजक शामिल हैं। हाइपोक्लोरस एसिड उत्तेजना के साथ प्रयोगों के लिए, एचबीएसएस के साथ फाल्कन ट्यूब में 200 माइक्रोमोलर हाइपोक्लोर एसिड तैयार करें जो पूर्व-गर्म 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म हो गया है। ध्रुवीकरण उपचार के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से सेल मीडिया को एस्पिरेट करें और ध्यान से कोशिकाओं को तीन बार पीएमए, टीएनएफ अल्फा के लिए बाँझ पीबीएस के एक मिलीलीटर एलिकोट्स के साथ धोएं, और हाइपोक्लोरस एसिड उत्तेजना के लिए इंटरल्यूकिन 8 उत्तेजना या एचबीएसएस।अंतिम धोने के कदम में PBS को हटाने के बाद, पीएमए, टीएनएफ अल्फा, या इंटरल्यूकिन 8 युक्त पूर्ण मीडिया का एक मिलीलीटर जोड़ें। टीएनएफ अल्फा उत्तेजना के लिए छह घंटे और पीएमए या इंटरल्यूकिन 8 उत्तेजना के लिए 24 घंटे के लिए एक सेल इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें । हाइपोक्लोरस एसिड के साथ प्रयोगों के लिए, अंतिम धोने के चरण में एचबीएसएस को हटाने के बाद, हौसले से तैयार हाइपोक्लोरस एसिड का एक मिलीलीटर जोड़ें।फिर कोशिकाओं को एक सेल इनक्यूबेटर में 5% कार्बन डाइऑक्साइड की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। उसके बाद, सावधानी से कोशिकाओं के सुपरनेट को एस्पिएरेट करें और कोशिकाओं को एचबीएसएस के एक मिलीलीटर एलिकोट्स के साथ तीन बार धोएं। अंतिम वॉश स्टेप से एचबीबीएस को हटाने के बाद, पूर्ण आरपीएमआई-1640 कल्चर मीडिया का एक मिलीलीटर जोड़ें।फिर एक सेल इनक्यूबेटर में 5% कार्बन डाइऑक्साइड की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट। एचबीएसएस में 40 माइक्रोमॉलर की सांद्रता पर SYTOX ग्रीन डाई तैयार करें। सीधे एचएमडीएम युक्त प्रत्येक कुएं में डाई के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें।अंधेरे में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिर एचएमडीएम को इमेजिंग के लिए एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के माइक्रोस्कोप चरण पर ऊतक संस्कृति कुओं में रखें। एक व्यापक स्पेक्ट्रम फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत, उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश स्रोत, और उल्टे माइक्रोस्कोप एक उच्च संकल्प रंग डिजिटल कैमरे के साथ स्थापित पर बारी।523 नैनोमीटर पर 504 नैनोमीटर और आयाम पर उत्तेजन के साथ हरे फ्लोरेसेंस के लिए नंबर दो स्थिति में फिल्टर व्हील घुमाएं। 5X उद्देश्य का उपयोग करके, छवि को मोटे फोकस के साथ केंद्रित करें, फिर माइक्रोस्कोप पर ठीक फोकस घुंडी जब तक छवि तेज, स्पष्ट और केंद्रित दिखाई देती है। माइक्रोस्कोप को कैमरा मोड में स्विच करें।संबंधित सॉफ्टवेयर शुरू करें। छवि का पूर्वावलोकन करने के लिए प्ले बटन पर क्लिक करें और माइक्रोस्कोप पर ठीक फोकस घुंडी समायोजित करें जब तक कि छवि तेज, स्पष्ट और सॉफ्टवेयर पूर्वावलोकन विंडो में केंद्रित न दिखे। कैप्चर बटन पर क्लिक करें।सॉफ्टवेयर के भीतर, फ़ाइल पर क्लिक करें। आवश्यक छवि फ़ाइल प्रकार के रूप में सहेजें। माइक्रोस्कोप पर, फिल्टर व्हील को उज्ज्वल-क्षेत्र इमेजिंग के लिए नंबर पांच स्थिति में घुमाएं, और संबंधित उज्ज्वल-क्षेत्र छवि प्राप्त करने के लिए कैप्चर प्रक्रियाओं को दोहराएं।उत्तेजनाओं के जवाब में एचएमडीएम के रूपात्मक परिवर्तनों को दिखाने वाले उज्ज्वल क्षेत्र छवियां यहां दिखाई जाती हैं। एचएमडीएम के साथ प्रयोगों से एम 1-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज इंटरफेरॉन गामा और लिपोपोलिनासैकराइड के संपर्क में एक लम्बी और धुरी की तरह सेल आकार दिखाया । तुलना के लिए, एचएमडीएम के एक्सपोजर के बाद एम 2-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज की आकृति विज्ञान 48 घंटे के लिए इंटरल्यूकिन 4 आम तौर पर गोल और सपाट थे।एमईटी जारी करने के लिए विभेदित एचएमडीएम फेनोटाइप की क्षमता को एसटीईटी ग्रीन के साथ लाइव-सेल फ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा कल्पना की गई थी। किसी भी समर्थक भड़काऊ उत्तेजनाओं की अनुपस्थिति में 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड प्रत्येक एचएमडीएम फेनोटाइप से प्राप्त नियंत्रण बहुत सीमित हरे रंग का धुंधला दिखा । METs के लिए सकारात्मक धुंधला, हरी धारियाँ के रूप में दिखाया गया है, M1-HMDMs के जोखिम के साथ हाइपोक्लोरस एसिड, पीएमए, इंटरल्यूकिन 8, या टीएनएफ अल्फा के लिए हासिल किया गया था ।कोशिकाओं में कुछ हरे रंग की धुंधला की उपस्थिति झिल्ली अखंडता की हानि को दर्शाती है जो कोशिका मृत्यु से हो सकती है जो बाहुलर जाल रिलीज से स्वतंत्र है। इंटरल्यूकिन 4 के संपर्क में आने वाले M2-HMDMs के साथ किए गए प्रयोगों में कोशिकाओं से डीएनए की कोई रिहाई नहीं दिखाई गई, जैसा कि एक्स्ट्रासेलुलर डीएनए की किस्में या धारियाँ की अनुपस्थिति से संकेत मिलता है । हालांकि, हाइपोक्लोरस एसिड और टीएनएफ अल्फा के साथ हरे फ्लोरोसेंट डाई का कुछ सेलुलर तेज था।यह प्रत्यक्ष उज्ज्वल प्रकाश जो इमेजिंग से पहले धुंधला overexpose कर सकते हैं से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। सेल सुपरनेट में मौजूद न्यूक्लियर और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए पर क्यूपीसीआर विश्लेषण द्वारा एक्स्ट्रासेलुलर डीएनए की मात्रा निर्धारित की जा सकती है । अन्य अमर सेल लाइन मैक्रोफेज स्टोर की तुलना में एचएमडीएम का उपयोग करके मस्त संरचना और पुरानी सूजन में इसकी भूमिकाओं का और अधिक लक्षण वर्णन अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक हो सकता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

एक<em&gt; इन विट्रो में</em&gt; सह - संक्रमण का अध्ययन करने के लिए मॉडल<em&gt; प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</emमानव प्राथमिक monocyte व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं में&gt; एचआईवी -1 सहभागिता

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

कोशिकी डीएनए रिलीज के उच्च throughput मापन और मानव न्यूट्रोफिल में मात्रात्मक नेट गठन<em&gt; इन विट्रो</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक विभेदित मानव monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज की संस्कृति

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

कुत्ते न्युट्रोफिल कोशिकी जाल रिलीज की मात्रा का ठहराव के लिए एक सरल प्रतिदीप्ति परख

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

पूरे रक्त से मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं की पीढ़ी

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

फ्लो साइटोमैट्री द्वारा सेंट्रल नर्वस सिस्टम से माइक्रोग्लिया और मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का विश्लेषण

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

अलगाव साल्मोनेला typhimurium-मैक्रोफेज से युक्त Phagosomes का

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

अलगाव और इन विट्रो संस्कृति Murine और मानव वायुकोशीय मैक्रोफेज

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

इन विट्रो में कुत्ते न्युट्रोफिल Extracellular जाल गठन: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा गतिशील और मात्रात्मक विश्लेषण

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...