Name: in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

この作品は、永久的なインパクト・グラント(IPAP201601422)とノボ・ノルディスク財団バイオメディカル・プロジェクト・グラント(NNF17OC0028990)によって支援されました。YZはまた、シドニー大学からオーストラリアの大学院賞を受賞したことも認めています。パット・ピサンサラキット氏とモーガン・ジョーンズ氏の単球分離と組織培養に関する支援に感謝します。

HMDMは、シドニー地方保健地区からの倫理の承認を得て血液銀行から供給されたヒトバフィーコート製剤から分離された。
1. HMDMカルチャー
<ol><li>リンパ球を単離する市販の調製物を用いて健康なヒトドナーの末梢血から調製したバフィーコート製剤から単球を単離し、続いて逆電流遠心溶血19、 20.</li>
	<li>単球特性評価用の修...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation:+implication+for+the+inflammatory+disease+condition.">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).</li><li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypochlorous+acid+(HOCl)+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation.">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival.">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li><li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminase+inhibition+reduces+vascular+damage+and+modulates+innate+immune+responses+in+murine+models+of+atherosclerosis.">Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis.</a> Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).</li><li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis.">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).</li><li>Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Footprints+of+neutrophil+extracellular+traps+as+predictors+of+cardiovascular+risk.">Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).</li><li>Goldmann, O., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+world+of+extracellular+traps:+not+only+neutrophils+but+much+more.">The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more.</a> Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+derived+from+macrophages,+mast+cells,+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis.">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Extracellular+Traps:+A+Scoping+Review.">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+low-density+lipoprotein+results+in+the+time-dependent+accumulation+of+cholesteryl+esters+and+apolipoprotein+B-100+protein+in+primary+human+monocyte-derived+macrophages.">Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages.</a> FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).</li><li>Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production.">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li><li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+&#176;C+to+35+&#176;C.">The acid ionization constant of HOCl from 5 &#176;C to 35 &#176;C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li><li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid.">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li></ol>

M1分化HmDMを用いたMET形成の生成と可視化は、特に慢性炎症下でこれらのマクロファージ構造の潜在的な病理学的役割を調べるのに有用である可能性のある新しいin vitroモデルを表す条件。これは、ヒト単球またはマウスマクロファージ細胞株との関連研究にも利用することができるMETを放出する原発ヒトマクロファージの刺激のための堅牢なプロトコルを提供する。HMDMによるMET形成の刺激の?...

好中球からの尿毒剤の放出は、まず細菌感染1によって引き起こされる自然免疫応答として同定された。それらは、好中球エラスターゼおよび骨髄oxoxidase2を含む抗菌特性を有する種々の顆粒タンパク質が結合するDNA骨格からなる。好中球のNE(NETs)の主な役割は、病原体を捕捉し、その除去を促進することです 3.しかし、免疫防御におけるETの保護的役割に加えて、特に炎症主導疾患の発症時(すなわち、関節リウマチおよび関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化症 4).Eの放出は、インターロイキン8(IL-8)および腫瘍壊死因子α(TNFα)5、6を含む様々な炎症性サイトカインによって引き起こされ、およびEの局所的な蓄積は、組織損傷を増加させ、誘発することができる炎症性反応7.例えば、ETは、アテローム性動脈硬化症8の発症に因果的役割を果たし、血栓症9を促進し、心血管リスク10を予測することに関与している。
好中球に加えて、他の免疫細胞(すなわち、肥満細胞、好酸球、およびマクロファージ)も微生物または炎症刺激11、12への曝露時にEを放出できることが認識されている。これは、慢性炎症性疾患の発症、調節、および解決における重要な役割を考慮して、マクロファージの場合に特に重要であり得る。したがって、マクロファージからのET放出と炎症関連疾患発症との間の潜在的な関係をより深く理解することが重要である。最近の研究は、無傷のヒトアテローム硬化性プラークおよび組織化された血栓13におけるMETおよびNETの存在を示している。同様に、METは、炎症反応14の調節を介して腎臓損傷を駆動するのに関与している。しかしながら、好中球とは対照的に、マクロファージからのMET形成のメカニズムに関するデータは限られている。MET形成のヒトin vitroモデルを用いた最近の研究は、各細胞型に関与する経路のいくつかの違いを示す(すなわち、マクロファージによるヒストンシトルリン化の欠如に関して)6.しかし、一部の人々は、ヒストンシトルリン化15がない場合にもNETリリースが発生する可能性があることを示しています。
このプロトコルの全体的な目標は、臨床的に関連するマクロファージモデルでMET放出を評価するための簡単で直接的な方法を提供することです。MET(すなわち、THP-1ヒト単球細胞株および各種マウスマクロファージ細胞株)16を研究するために使用されている多数の異なるin vitroマクロファージ細胞モデルがある。これらのモデルに関連するいくつかの制限があります。例えば、マクロファージに対するTHP-1単球の分化には、通常、プロテインキナーゼC(PKC)依存性経路を活性化するフォルボル菌性酢酸(PMA)の添加などのプライミングステップが必要です。このプロセスは、ETリリース4をトリガすることが知られており、THP-1細胞からの低基底MET放出をもたらす。他の研究は、PMA処理THP-1細胞17と比較して、生体内のマクロファージによって取り付けられた生理活性および炎症応答のいくつかの違いを強調している。
同様に、異なるマウスマクロファージ様細胞株の挙動および炎症応答は、一次ヒトマクロファージ18の応答スペクトルを完全に表すものではない。従って、臨床現場におけるマクロファージET形成を調べる目的で、原発ヒト単球由来マクロファージ(HMDM)は、単球性またはマウスマクロファージ様細胞株よりもむしろより関連性の高いモデルであると考えられている。
M1偏光HMDMからのET放出は、ミエロペルオキシダーゼ由来酸化性次亜塩素酸(HOCl)、PMA、TNFα、およびIL-86を含む多数の異なる炎症刺激にこれらの細胞の曝露後に実証されている。ここで説明するプロトコルは、M1表現型にHMDMを偏光させ、これらの炎症刺激への曝露時にその後のMET放出を可視化するプロトコルである。PMAは、好中球を使用した以前の研究との比較を容易にするためにMETリリースの刺激として使用されます。重要なことに、HOCl、IL-8、およびTNFαはまた、生体内の炎症環境のより良いモデルであると考えられているMET放出を刺激するために使用される。ET放出の可視化のための顕微鏡的方法は、SYTOXグリーンを使用して生細胞培養中の細胞外DNAを染色することを含む、 SYTOXグリーン、以前の好中球研究で正常に適用された不浸透性蛍光緑色核酸染色。この方法は、ETリリースの迅速かつ定性的な評価を可能にしますが、ETリリース範囲を定量化するためのスタンドアロンの方法としては適切ではありません。異なる治療条件または介入から生じるET放出の程度を比較するために定量化が必要な場合は、代替方法論を使用する必要があります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120Q broad spectrum fluorescent light source</td>
			<td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>24606</td>
			<td>Characterisation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14025050</td>
			<td>For washing steps and HOCl treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorous acid (HOCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>PMC4031</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>rhil-4</td>
			<td>For M2 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 8</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-943</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59202C</td>
			<td>Added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td>1114544</td>
			<td>For isolation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>For washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For MET visulaization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-200 brightfield light source</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>300-01A-50</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages

好中球による細胞外トラップ(けること)の放出は、慢性炎症に関連する疾患の発症に寄与する要因として同定されている。好中球のNETs(NETs)は、DNA、ヒストンタンパク質、および様々な顆粒タンパク質(すなわち、骨髄ペルオキシダーゼ、エラスターゼ、およびカテプシンG)のメッシュからなる。マクロファージを含む他の免疫細胞も、ETを産生することができる。しかしながら、これは生体内でどの程度起こるのか、そしてマクロファージ細胞外トラップ(MET)が病理学的メカニズムにおいて役割を果たすかどうかは、詳細には調べていない。炎症性病理におけるMETの役割をよりよく理解するために、インビトロで一次ヒトマクロファージからのMET放出を可視化するためのプロトコルが開発され、免疫蛍光実験でも利用できる。これにより、これらの構造のさらなる特性評価と好中球から放出されるEとの比較が可能になります。ヒト単球由来マクロファージ(HMDM)は、M1前炎症表現型への分化に続いて異なる炎症刺激にさらされるとMETを産生する。METの放出は、生細胞(例えば、SYTOXグリーン)に含まれる緑色蛍光核酸染色を用いて顕微鏡検査によって可視化することができる。HMDMのような単に単離された一次マクロファージの使用は、潜在的な臨床応用に関連する生体内炎症性イベントのモデリングに有利である。このプロトコルはまた、ヒト単球細胞株からのMET放出(例えば、THP−1)をホルボル酢酸または他のマクロファージ細胞株(例えば、マウスマクロファージ様J774A.1細胞)とのマクロファージへの分化後に使用することもできる。

細胞分化の刺激に対するHMDMの形態変化を示す明視野画像を図1に示す。IFNγおよびLPSに曝露されたHMDMを用いた実験からのM1偏光マクロファージは、図1(中央パネル)の黒い矢印で示されるように細長く紡錘状の細胞形状を示した。比較のために、48時間のIL-4にHMDMを曝露した後のM2偏光マクロファージの形態は、図1(右端パネル)の...

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In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

ここで提示するプロトコルは、顕微鏡法および蛍光染色を用いて生細胞培養におけるマクロファージ細胞外トラップ(MET)産生を検出するプロトコルである。このプロトコルは、免疫蛍光染色によって特異的なMETタンパク質マーカーを調べるためにさらに拡張することができる。

分化ヒト単球由来マクロファージにおける細胞外トラップ放出のIn Vitro刺激と可視化

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

好中球および他の免疫細胞による細胞外トラップの放出は、自然免疫において重要であるが、また、炎症病理と強く関連している。これらの細胞は炎症反応において重要な役割を果たしているが、マクロファージにおけるこのプロセスについてはほとんど知られていない。このプロトコルは、マクロファージ細胞外トラップまたはマスト放出の主要なヒトin vitroモデルを提供する。これは、生体内でこの構造の潜在的な生理学的成長を研究するためのモデルを提供します。この技術の主な利点は、このプロトコルからの細胞がヒトバフィーコート製剤から単離された一次細胞であることである。単球をマクロファージに分化するために必要なプライミングステップはなく、THP-1細胞株などの他の単球細胞株とは対照的である。このプロトコルは、単離された好中球およびミクログリアを含む他の免疫細胞に容易に適応される。マクロファージによって生成される細胞外トラップは非常に脆弱であるため、染色されたトラップの完全性を維持するために、ステップ間に注意を払う必要があります。滅菌条件下で、完全なRPMI-1640培地に添加してM1プライミング培地を調製し、インターフェロンガンマは1ミリリットル当たり20ナノグラム、リポ多糖の濃度は1ミリリットル当たり1マイクログラムの濃度にする。ミリットル当たり20ナノグラムの濃度に完全なRPMI-1640培養培地にインターロイキン4を加えることによってM2プライミング培地を調製する。無菌条件下では、HMDMを含む播種および培養組織培養プレートウェルから吸引された培地。慎重に各井戸に追加, 37 摂氏に事前に温めた滅菌PBSの1ミリリットル.PBSバッファーを取り出し、さらに2回洗います。HMDMを含む各ウェルにM1またはM2プライミングメディアの1ミリリットルを追加します。細胞インキュベーターに5%の二酸化炭素が存在する場合、セルを摂氏37度で48時間インキュベートする。滅菌条件下で、完全なRPMI-1640培地にMET放出の異なる刺激剤を含む培養培地を調製する。次亜塩素酸刺激の実験では、摂氏37度に予め温めたHBSSを備えたファルコンチューブに200マイクロモル次亜塩素酸を調製します。偏光処理後、各ウェルから細胞培地を吸引し、PMA、TNFアルファ、およびインターロイキン8刺激または次亜塩素酸刺激のためのHBSSのいずれかの無菌PBSの1ミリリットルのアリコートで細胞を3回慎重に洗浄する。最終洗浄工程でPBSを除去した後、PMA、TNFアルファ、またはインターロイキン8を含む完全な培地を1ミリリットル添加する。TNFアルファ刺激のために6時間、PMAまたはインターロイキン8刺激のために24時間、セルインキュベーターで37°Cと5%の二酸化炭素で細胞をインキュベートします。次亜塩素酸の実験では、最終洗浄工程でHBSSを除去した後、調製した次亜塩素酸を1ミリリットル添加する。その後、細胞インキュベーターに5%の二酸化炭素が存在する場合、37°Cで15分間培養します。その後、細胞の上清を慎重に吸引し、HBSSの1ミリリットルのアリコートで細胞を3回洗浄する。最終洗浄工程からHBSSを取り外した後、完全なRPMI-1640培養培地を1ミリリットル加えます。その後、細胞インキュベーターに5%の二酸化炭素が存在する場合、37°Cで24時間培養します。40マイクロモルの濃度でHBSSでSYTOXグリーン染料を調製します。HMDMを含む各ウェルに25マイクロリットルの染料を直接加えます。暗い所で5分間室温で細胞をインキュベートする。次に、HMDMを組織培養井戸に配置し、蛍光顕微鏡を反転してイメージングします。高解像度カラーデジタルカメラを搭載した広域蛍光光源、明視野光源、反転顕微鏡をオンにします。504ナノメートルで励起し、523ナノメートルで寸法を出して緑色蛍光のナンバー2の位置にフィルターホイールを回転させます。5Xの目的を使用して、画像がシャープ、クリア、および焦点が合うまで、顕微鏡上の細かい焦点ノブを粗い焦点で画像を焦点を合わせます。顕微鏡をカメラモードに切り替えます。関連付けられているソフトウェアを起動します。[再生] ボタンをクリックして画像をプレビューし、イメージが鮮明で鮮明で、ソフトウェア プレビュー ウィンドウにフォーカスが合うまで、顕微鏡の細かいフォーカス つまみを調整します。[キャプチャ]ボタンをクリックします。ソフトウェア内で、[ファイル] をクリックします。必要なイメージ ファイルの種類として保存します。顕微鏡上で、フィルターホイールを明視野イメージングの5番に回転させ、キャプチャ手順を繰り返して対応する明視野画像を得ます。刺激に応答してHMDMの形態学的変化を示す明視野画像をここに示す。インターフェロンガンマおよびリポ多糖に曝露したHMDMの実験からM1偏光マクロファージは、細長く紡錘状の細胞形状を示した。比較のために、HMDMをインターロイキン4に48時間曝露した後のM2偏光マクロファージの形態は、典型的には円形および平坦であった。METを放出するHMDMの分化されたタイプの能力を、SYTOXグリーンでの生細胞蛍光イメージングによって可視化した。いずれの炎症促進刺激も存在しない状態で24時間インキュベートされた各HMDM表現型から得られた対照は、極めて限られた緑色染色を示した。緑色の筋として示されるMETに対する陽性染色は、次亜塩素酸、PMA、インターロイキン8、またはTNFアルファへのM1-HMDMの曝露で達成された。細胞内に明らかな緑色染色の存在は、細胞外トラップ放出とは無関係である細胞死から生じる膜完全性の喪失を反映している。インターロイキン4に曝露したM2-HMDMを用いて行った実験では、細胞外DNAの鎖または筋の欠如によって示されるように、細胞からのDNAの放出は示さなかった。しかし、次亜塩素酸とTNFアルファを用いた緑色蛍光色素の細胞化があった。イメージングの前に染色を過度に露出させる可能性のある直接の明るい光を避けることは重要です。細胞外DNAは、細胞上清中に存在する核およびミトコンドリアDNAに関するqPCR解析により定量することができる。HMDMを用いた慢性炎症におけるマスト構造およびその役割のさらなる特徴は、他の不死化細胞系マクロファージストアと比較してより臨床的に関連し得る。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

ヒト好中球における細胞外DNAのリリースおよび定量NET形成のハイスループット測定<em&gt;インビトロ</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

イヌ好中球細胞外トラップリリースの定量化のためのシンプルな蛍光アッセイ

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...